评估抗癫痫药物苯妥英引发药物不良反应风险的方法

摘要

一种预测患者发生苯妥英引发之不良反应(ADRs)风险的方法，包括：史帝文生强生症候群(SJS)，毒性表皮溶解症(TEN)，或药物疹合并嗜伊红血症及全身症状（DRESS）。CYP2C基因的基因多型性(包括CYP2C9，CYP2C19，CYP2C8及CYP2C18)，HLA基因型(包括HLA-A*0207，HLA-A*2402，HLA-B*1301，HLA-B*1502，HLA-B*4001，HLA-B*4609，HLA-B*5101，HLA-DRB1*1001及HLA-DRB1*1502)，以及患者血浆中的苯妥英浓度都可能造成苯妥英引发不良反应。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于预测患者对于药物不良反应的风险之方法，尤指抗癫痫药物苯妥英 引发过敏反应的风险评估。

背景技术

药物不良反应（简称ADRs）是指在正常剂量下使用药物而引起伤害之表现。药物过敏 反应是一种在用药治疗中常见的不良反应且约占通报药物不良反应案件的20%。这些过敏反 应可能从轻微的皮肤起红疹(MPE)到造成生命威胁的药物疹合并嗜伊红血症及全身症状 (DRESS)，史帝文生强生症候群(SJS)和毒性表皮坏死溶解症(TEN)。

许多芳香环类抗癫痫药物（AEDs），如苯妥英，卡马西平或拉莫三嗪经常与过敏反应 有关。特别是，苯妥英是第一线芳香环类抗癫痫用药，然而，超过19%使用苯妥英治疗的病 人会发生过敏反应。先前文献指出微胞体环氧化物水解酶缺失及人类白血球组织抗原基因型 （HLA）可能与芳香环类抗癫痫药物引起的过敏反应有关联。然而，药物代谢/遗传基因易感 性和苯妥英引发过敏反应之间的关系仍尚未明了。

因此，仍然需要一种新颖并改进的方法用来预测苯妥英引发药物过敏反应的风险，其中 该风险可以通过评估包括CYP2C9的基因多型性，苯妥英血中浓度和HLA基因型等因素进 行预估。

发明内容

本发明提供一种评估病患发生苯妥英引发之不良反应风险的方法，特别是史帝文生强生 症候群(SJS)，毒性表皮坏死溶解症(TEN)及药物疹合并嗜伊红血症及全身症状(DRESS)等严 重型皮肤不良反应。针对58位苯妥英引发严重型皮肤不良反应(SCARs)病患，包括史帝文生 强生症候群，毒性表皮溶解症及药物疹合并嗜伊红血症及全身症状及198位对照组进行全基 因扫瞄（Affymetrix6.0）。在一实施例中，评估病患发生苯妥英引发不良反应风险的方法包 括检测10号染色体上CYP2Cs区域的单点核苷酸变异（SNPs）的步骤，如CYP2C18上的 rs17110192，rs7896133；CYP2C9上的rs1057910（CYP2C9*3），rs17110321，rs9332093， rs9332245；CYP2C19基因上的rs3758581，rs2860905，rs4086116及CYP2C8上的 rs7899038，rs1592037，rs1934952，rs11572139，rs6583967。

另一实施例中，评估病患发生苯妥英引发之不良反应风险的方法包含了侦测结合 rs1057910（CYP2C9*3），rs3758581，rs17110192，rs9332245或rs1592037（尤其是 rs17110192，rs1057910和rs3758581）之单倍型的步骤，此单倍型会增加统计学上的显著相 关性当苯妥英引发之史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症/药物疹合并嗜伊红血症及全身症 状病患与苯妥英耐受性对照组相比较时。没有苯妥英耐受性个体带有结合的rs1057910 （CYP2C9*3），rs3758581，rs17110192，rs9332245或rs1592037（尤其是rs1057910和 rs3758581，0/95），然而，近三分之一的苯妥英过敏患者带有此组合(30/96)。这些SNPs中 有一些会造成胺基酸序列改变，例如CYP2C19exon7上造成错义改变的rs3758581显著与苯 妥英-史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症/药物疹合并嗜伊红血症及全身症状相关，进一步 更发现CYP2C9*3与苯妥英引发之史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症/药物疹合并嗜伊红 血症及全身症状有显著相关性。

在又一实施例中，本发明提供评估病患发生苯妥英引发之过敏反应风险的方法，包括利 用候选基因（CYP2Cs和HLA）检测152位苯妥英药物过敏病患，包含53例苯妥英-史帝文 生强生症候群/毒性表皮溶解症，24例苯妥英-药物疹合并嗜伊红血症及全身症状和75例苯 妥英-皮肤红疹，以及118位耐受性对照组病人为服用苯妥英超过3个月，但没有任何不良反 应。结果显示高达30.2%的苯妥英-史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症病患及37.5%的苯妥 英-药物疹合并嗜伊红血症及全身症状病患带有CYP2C9*3基因型，相比之下，14.7%的苯妥 英-皮肤红疹病患及只有2.5%的耐受性对照组病人带有CYP2C9*3。本发明也指出CYP2C9 以及CYP2C19，CYP2C8和CYP2C18的基因变异型涉及苯妥英低下代谢能力并会增加血浆 中的药物累积进而导致过敏反应。除了CYP2Cs的基因关连之外，HLA-A*0207，HLA- A*2402，HLA-B*1301，HLA-B*1502，HLA-B*4001，HLA-B*4609，HLA-B*5101， HLA-DRB1*1001或HLA-DRB1*1502也显示出与苯妥英引发过敏反应有显著关系。因此， 这些数据表明CYP2C9/2C19/2C8/2C18的基因多型性或其缺陷之等位基因，苯妥英血中浓度 和特定之HLA基因型都有助于苯妥英引发严重皮肤药物不良反应。

附图说明

图1说明苯妥英引发严重皮肤药物不良反应(SCARs)的全基因组关联研究，其中每个点代表 一个SNP。x轴表示的SNP在染色体上的位置，y轴表示SNP在病患-对照关联研究的-log10的显 著性差异。此研究包含58例苯妥英-史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症/药物疹合并嗜伊红 血症及全身症状及198例一般人控制组。显著性差异<10-6的SNP以红色突显。强度信号座落于 在10号染色体上的CYP2C区域。

图2显示苯妥英药物不良反应病患及耐受性控制组的苯妥英血中浓度。苯妥英的正常治疗 浓度通常介于10-20微克/毫升，耐受性控制组的苯妥英血中浓度介于5-15微克/毫升。然而， 苯妥英-史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症患者的苯妥英血中浓度介于40-50微克/毫升，高 于耐受性控制组。

具体实施方式

以下详细描述的目的在于作为一个根据本发明的各方面提供了现前的示例性描述，而不 是旨在表示本发明可以制备或利用的唯一形式。而可被理解的是，能在不同实施例中被实施 的相同或等同之功能及要素也包括在本发明的精神和范围之内。

除非另有定义，在本文中所使用的所有技术性和科学性术语对于本发明所属领域的任一 普通技术人员都具有通常理解的相同含义。虽然任何类似或等同于本发明所述的方法、装置 和材料都能在本发明的实践或试验中使用，现在开始描述该示例性方法、装置和材料。

所有提及的发表文献都被并入参考文献并目的在于描述和揭露，举例来说，在发表文献 描述过的设计和方法可能被用来和本发明连结。本文上下及全文中所列出或讨论的发表文献 仅在提供其在本发明申请日之前的发现，不应被解释为承认本发明人没有资格由于先前发明 早于这些公开内容。

史蒂文生症候群（SJS）和毒性表皮坏死溶解症（TEN）的诊断是依照具共识性标准的 临床症状来定义（Bastuji-Garin S,Rzany B等人，1993）。史帝文生强生症候群被定义为皮 肤剥离面积小于体表面积的10％，重迭史帝文生强生症候群_毒性表皮溶解症为皮肤剥离介 于10-29％，毒性表皮溶解症为大于等于30％。药物疹合并嗜伊红血症及全身症状(DRESS) 的诊断标准为皮疹（如弥漫性斑丘疹、剥脱性皮炎）伴随嗜酸粒细胞增多、非典型淋巴细胞 循环，急性肝细胞损伤或肾功能恶化等症状（Kardaun SH,Sidoroff A等人，2007）。符合由 苯妥英引发史帝文生强生症候群、毒性表皮溶解症或药物疹合并嗜伊红血症及全身症状诊断 标准之患者将经长庚纪念医院体系鉴定并选入本研究。

本发明发现特定CYP2C基因变异型，包括CYP2C9，CYP2C19，CYP2C8和CYP2C18涉 及苯妥英的低代谢活性并与苯妥英引发过敏反应有关。除了CYP2C变异型，HLA-A*0207， HLA-A*2402，HLA-B*1301，HLA-B*1502，HLA-B*4001，HLA-B*4609，HLA-B*5101， HLA-DRB1*1001或HLA-DRB1*1502也被发现与苯妥英引发过敏反应或皮肤药物不良反应 有显著关联。

因此，本发明提供一种评估苯妥英引发过敏反应风险的方法，系检测染色体10号上 CYP2C区域的单点核苷酸变异（SNPs）之存在，包括CYP2C9，CYP2C19，CYP2C8和 CYP2C18。透过58位苯妥英引发严重型皮肤药物不良反应患者（包括史帝文生强生症候 群、毒性表皮溶解症及药物疹合并嗜伊红血症及全身症状）和198位一般人对照组进行全基 因扫瞄（Affymetrix6.0），发现最有显著相关的单点核苷酸变异（SNP）大部分皆都位于10 号染色体上的CYP2C区域（见图1），例如CYP2C18上的rs17110192，rs7896133； CYP2C9上的rs17110321，rs9332093，rs9332245；CYP2C19上的rs3758581，rs2860905， rs4086116；和CYP2C8上的rs7899038，rs1592037，rs1934952，rs11572139，rs6583967（见 表1）。其他位于CYP2C区域附近之SNP如rs2274222，rs11188183，rs7921561， rs10882544，rs7084271，rs644437，rs12769577，rs617848，rs10882551，rs585381， rs648638，rs664093，rs12262878，rs17524438，rs12413028，rs11188246，rs12415795， rs11596107，rs11596737，rs10509685，rs7912686，rs17453729，rs17453764，rs17526000及 rs12769370与苯妥英引发过敏反应亦有显著之关联（见表1）。

先前研究指出CYP2C9*3会增加苯妥英引发皮肤红疹（MPE）之风险（Lee AY等人， 2004）。在一实施例中，CYP2C9*3被用于预测苯妥英引发药物不良反应的风险。为试验 CYP2C9*3于苯妥英引发其他类型之药物不良反应（ADRs）的角色，尤其是针对皮肤粘膜起 水泡之史帝文生强生症候群或毒性表皮溶解症，单点核苷酸变异基因型鉴定(SNP genotyping) 将进行于苯妥英药物不良反应患者上。152例苯妥英引发药物不良反应之患者加入本研究， 其中包括53例苯妥英-史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症，24例苯妥英-药物疹合并嗜伊 红血症及全身症状和75例苯妥英-皮肤红疹，以及118位耐受性对照组病人为服用苯妥英超 过3个月，但没有过敏反应。结果显示53例苯妥英-史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症病 患中，有16位带有CYP2C9*3变异型（30.2％）；24例苯妥英-药物疹合并嗜伊红血症及全 身症状病患中，有9位带有CYP2C9*3变异型（37.5％），75例皮肤红疹病患中，有11位 带有CYP2C9*3变异型（14.7％），相较之下此变异型只在2.5%（3/118）耐受性病人中被 发现（见表2）。苯妥英过敏病例和耐受性对照组的统计分析显示CYP2C9*3与苯妥英引发 的史帝文生症候群/毒性表皮坏死溶解症最具显著相关(SJS/TEN vs.耐受性控制组：显著性差 异=3.3×10^-7,优势比=17.5(4.8-63.7))或与药物疹合并嗜伊红血症及全身症状有显著相关 (DRESS vs.耐受性控制组：显著性差异=6.1×10^-5,优势比=19.2(4.4-82.7))；但只与苯妥英引 起的皮肤红疹微弱相关(MPE vs.耐受性控制组：显著性差异=0.004,优势比=6.2(1.6-23.3))。 这意味着CYP2C9*3变异型的存在可以被用来鉴定苯妥英引发药物不良反应（ADRs）的高 风险病人，特别是指苯妥英引发的史帝文生强生症候群，毒性表皮溶解症及药物疹合并嗜伊 红血症及全身症状。

在另一实施例中，CYP2C上造成胺基酸改变的SNP也可用于评估苯妥英引发药物不良 反应的风险上。一些CYP2C基因上会造成胺基酸改变的SNP被进一步进行检测，如： CYP2C9上的371G>A（rs12414460，Arg124Gln），895A>G（rs72558192， Thr299Ala，又称为CYP2C9*16），1362G>C（Gln454His，又称为CYP2C9*19）; CYP2C19上的991A>G（rs3758581，Ile331Val），395G>A（rs72558184， Arg132Gln，又称为CYP2C19*6），636G>A（rs4986893，Trp212end，又称为 CYP2C19*3），681G>A，（rs4244285，造成重组位点突变，又称CYP2C19*2）， 781C>T（Arg261Trp）；及CYP2C18上的204T>A（rs41291550，Tyr68end），370C >T（Arg124Trp），576G>C（Gln192His），1154C>T（rs2281891， Thr385Met）。CYP2C酵素的这些变异可同时影响其活性及其受质特异性。举例来说， CYP2C19exon7上造成错义改变的rs3758581与苯妥英-史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症 /药物疹合并嗜伊红血症及全身症状有显著相关(SJS/TEN/DRESS vs.耐受性：显著性差异 =0.0003,优势比=7.28(2.3564-22.4912))（见表1）。

表1:位于10号染色体CYP2C区域上与苯妥英引发史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症/药物疹合 并嗜伊红血症及全身症状有相关之SNP列表。

表2:152位苯妥英引发皮肤药物不良反应患者与118位耐受性控制组之CYP2C9*3频率

§:SJS/TEN vs.耐受性：显著性差异=3.3×10^-7,优势比=17.5(4.8-63.7);DRESS vs.耐受性：显著性差异=6.1×10^-5, 优势比=19.2(4.4-82.7);MPE vs.耐受性：显著性差异=0.004,优势比=6.2(1.6-23.3)

本发明又一实施例中，结合不同的单点核苷酸变异（SNP）可以用来评估苯妥英引发药 物不良反应（ADRs）。结果发现，与苯妥英耐受性对照组相较之下，结合rs1057910 (CYP2C9*3)，rs3758581，rs17110192，rs9332245或rs1592037之单倍型会增加统计学上苯妥 英引发史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症/药物疹合并嗜伊红血症及全身症状之相关性。 尤其是当病患同时带有rs1057910和rs3758581或rs17110192与苯妥英引发史帝文生强生症候群 /毒性表皮溶解症/药物疹合并嗜伊红血症及全身症状更有显著的关联（见表3）。

表3:与苯妥英引发史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症/药物疹合并嗜伊红血症及全身症状 相关之主要SNP统计分析。

在另一实施例中，本发明提供一种评估苯妥英引发药物不良反应风险的方法，包含了检 测人类白血球抗原(HLA)基因型的存在，包括HLA-A，HLA-B及HLA-DRB1。聚合酶链反 应-序列特异性寡核苷酸探针法被用来鉴别苯妥英药物不良反应病人及耐受性控制组病人之 HLA-A，HLA-B及HLA-DRB1基因型。结果显示，HLA-A*0207，HLA-A*2402，HLA- B*1301，HLA-B*1502，HLA-B*4001，HLA-B*4609，HLA-B*5101，HLA-DRB1*1001或 HLA-DRB1*1502与苯妥英引发的不良反应（史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症，药物 疹合并嗜伊红血症及全身症状，或MPE）有显著相关（见表4-6）。实验数据显示，和耐受 性控制组相较，HLA-B*1301等位基因在苯妥英药物不良反应病人中显著增加频率，有15位 史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症患者（28.3％）和12位药物疹合并嗜伊红血症及全身 症状患者（46.2％）带有HLA-B*1301，而只有14位耐受性患者（11.9％）带有此基因型 (SJS/TEN vs.耐受性控制组:显著性差异=0.001,优势比=3.8(1.7-8.5);DRESS vs.耐受性控制 组:显著性差异=2×10^-4,优势比=6.4(2.5-16.5))。然而，这种显著相关性并不见于皮肤红疹 (MPE vs.耐受性控制组:显著性差异=0.296,优势比=1.7(0.7-3.7))。HLA-B*5101等位基因也 与苯妥英引发药物不良反应相关，有13.2％的史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症患者， 19.2％的药物疹合并嗜伊红血症及全身症状患者和15.6％的皮肤红疹患者带有HLA- B*5101，而只有5位耐受性控制组患者（4.2％）带有此基因型(SJS/TEN vs.耐受性控制组: 显著性差异=0.05,优势比=3.4;DRESS vs.耐受性控制组:显著性差异=0.018,优势比=5.4;MPE  vs.耐受性控制组:显著性差异=0.009,优势比=4.2)。

表4.HLA-A等位基因与苯妥英引发皮肤药物不良反应之相关性

表5.HLA-B等位基因与苯妥英引发皮肤药物不良反应之相关性

我们先前的研究指出，HLA-B*1502等位基因和卡马西平引起的史帝文生强生症候群/毒 性表皮溶解症有强烈关联（Chung WH等人，2004）。在本发明的又一实施例中，HLA- B*1502等位基因被用来评估苯妥英引发药物不良反应的风险，且结果显示HLA-B*1502和苯 妥英引发药物不良反应有关联。有12位史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症患者

（22.6％）带有HLA-B*1502，而只有9位耐受性对照组患者（7.6％）带有此基因型。和耐受 性控制组相较，HLA-B*1502等位基因在苯妥英引发的史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症 病人中显著增加频率(SJS/TEN vs.耐受性:显著性差异=0.01,优势比=3.5(1.4-9.0))。然而，这 种相关性并不见于苯妥英引发的药物疹合并嗜伊红血症及全身症状及皮肤红疹（显著性差 异>0.05）。

此外，在本发明中我们也发现和耐受性控制组相较，HLA-B*4609等位基因频率在苯妥 英引发的药物疹合并嗜伊红血症及全身症状病人中显著增加(DRESS vs.耐受性控制组:显著 性差异=0.032,优势比=19.7(0.9-449.8))，及HLA-A*0207等位基因也与苯妥英引发的药物疹 合并嗜伊红血症及全身症状有关联(DRESS vs.耐受性控制组:显著性差异=0.024,优势比=4.6 (1.3-16.2))。除此之外，HLA-DRB1*1001被发现和苯妥英引发的皮肤红疹有关(MPE vs.耐受 性控制组:显著性差异=0.02,优势比=13.2)；HLA-DRB1*1502被发现和苯妥英引发的史帝文 生强生症候群/毒性表皮溶解症有关(SJS/TEN vs.耐受性控制组:显著性差异=0.029,优势比 =14)。相比之下，HLA-A*2402及HLA-B*4001显示对于苯妥英引发的药物不良反应具有保 护作用(等位基因的频率减少于苯妥英药物不良反应患者，增加于耐受性控制组患者)。

表6.HLA-DRB1等位基因与苯妥英引发皮肤药物不良反应之相关性

本发明亦指出CYP2C9以及CYP2C19，CYP2C8和CYP2C18的基因变异型与苯妥英低下 代谢活性有关并使其药物累积，进而导致苯妥英过敏反应的风险。在一些实施例中，用于评 估苯妥英引发药物不良反应风险的方法包括检测病人血浆中苯妥英浓度的步骤。由于苯妥英 是由肝脏酵素进行代谢，因此细胞色素P450酵素的多型性会影响苯妥英血中浓度。苯妥英的 非线性药物动力学及治疗范围狭窄指出血浆中苯妥英浓度会影响其功效及毒性。

在这项研究中，药物过敏反应发病期间的苯妥英浓度系从病人血浆中利用高效液相色谱 法被测得，并藉由非线性药物动力公式来估算：

$t=\frac{K_m\times 1n\left(\frac{C_1}{C_2}\right)+(C_1-C_2)}{V_{\max }}\times V_d$

Km=4毫克/升(最大代谢速率的一半时之药物浓度)

Vmax=7毫克/公斤/天(最大代谢速率)

Vd=0.65升/公斤(分布体积)

t:两个苯妥英血中浓度相差的天数

苯妥英治疗区间通常介于10-20微克/毫升。服药后，耐受性控制组病患的苯妥英血中浓 度为5-15微克/毫升，然而，史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症病患的苯妥英血中浓度高 达40-50微克/毫升，相较高于耐受性控制组病患(SJS/TEN vs.耐受性控制组:显著性差异 =0.006;MPE vs.耐受性控制组:显著性差异=0.004)(见图2)。我们也比较了带有CYP2Cs变异 型之病患的苯妥英血中浓度，结果显示带有CYP2C9*3的苯妥英药物不良反应病患具较高的 苯妥英血中浓度。分析23位苯妥英药物不良反应病患后，有4位病患的苯妥英血中浓度低于 10微克/毫升，9位病患的苯妥英血中浓度介于10-20微克/毫升，及10位病病患的苯妥英血中 浓度高于20微克/毫升。在这23位病患中，5位带有CYP2C9*3变异型的病患其苯妥英血中浓 度皆高于20微克/毫升。本发明证明CYP2Cs变异型，尤其是CYP2C9*3显示低下的苯妥英代 谢活性会造成过敏反应。苯妥英的代谢缺陷会增加药物累积的风险，并导致其引发严重过敏 反应之风险，如史帝文生强生症候群/毒性表皮溶解症和药物疹合并嗜伊红血症及全身症 状。

该CYP2Cs变异型和HLA基因型可以通过使用本领域中已知的任何方法来检测。最好地 是，针对有兴趣之变异型的特定探针可与DNA进行杂交。所述探针可以被标记以用于直接检 测，或透过专一结合在探针上的第二个、可被检测之分子。又或者，cDNA、RNA或变异型 的蛋白产物也可被检测。

以上本发明之描述和说明，应被理解的是，这些都是本发明的示例并且不应被认为是限 制。因此，本发明不应被视为受限于前面的描述，而是包括任何等同物。

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