治疗包括骨髓增生性肿瘤和慢性骨髓性白血病在内的与转导素β样蛋白1(TBL1)活性相关的疾病和病症的方法

摘要

本发明公开了利用蒽-9,10-二酮二肟化合物：2-((3R,5S)-3,5-二甲基哌啶-1-基磺酰基)-7-((3S,5R)-3,5-二甲基哌啶-1-基磺酰基)蒽-9,10-二酮二肟治疗癌症，包括骨髓增生性肿瘤、慢性骨髓性白血病和急性骨髓性白血病。这种蒽-9,10-二酮二肟化合物中断Wnt/β-连环蛋白通路并抑制该通路的异常调节活性来治疗、诊断和预防β-连环蛋白通路相关病症以及破坏转导素β样蛋白1(TBL1)与辅助激活分子β-连环蛋白的相互作用。

说明书

技术领域

本发明涉及调节与转导素β样蛋白1(transducinβ-like protein1，TBL1) 活性相关的疾病和病症的治疗方法及其用途的领域，所述疾病和病症包括骨 髓增生性肿瘤、慢性骨髓性白血病和急性骨髓性白血病。

背景技术

在美国，癌症是导致死亡的第二大诱因。这对开发新的治疗方法提出了 严峻的挑战。癌症的特征在于恶性细胞的异常生长，恶性细胞经过一系列的 遗传变化导致肿块生长并具备转移性质。

已表明蛋白质的转导素β样蛋白1(TBL1)家族通过作为辅助调节交换因 子起作用而包含在转录激活因子中。TBL1家族由TBL1X、TBL1Y和TBLR1 蛋白组成。这些蛋白质是SMRT-核受体/辅助抑制因子(N-CoR)复合物的组成 成分，它们用于交换该复合物上的辅助抑制因子和辅助激活因子。SMRT和 NCoR是参与多种不同的核受体介导的转录抑制的大的辅助抑制因子蛋白。 蛋白质的TBL1家族与NCoR/SMRT形成可逆复合物以作为核受体的转录激 活因子起作用。

Β-连环蛋白(β-catenin)是构成粘合连接(AJ)的蛋白质复合物的一部分。AJ 通过调节细胞生长和细胞间的粘合而对上皮细胞层的形成和维持是必需的。 β-连环蛋白还锚定肌动蛋白细胞骨架，并可负责传递接触抑制信号，一旦上 皮层完整，该信号导致细胞停止分裂。

已表明Wnt/β-连环蛋白通路在癌症中起作用。近期研究已表明TBL1能 与β-连环蛋白结合并将复合物募集到Wnt响应启动子上以激活特定的转录程 序。同时还表明β-连环蛋白需要TBL1来主动地转录靶基因。此外，TBL1 似乎可保护β-连环蛋白免于遍在蛋白化(某些酶引起的翻译后修饰)和降解。 但是，TBL1和β-连环蛋白之间相互作用的机制尚不可知。

异常β-连环蛋白信号传导在肿瘤发生过程中起重要作用。具体地说， 估计在β-连环蛋白通路中，结肠直肠癌有高于80％的突变，这导致不受调节 的致癌信号传导。已表明异常β-连环蛋白信号传导参与多种癌症类型，包括 黑素瘤(melanoma)、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、骨髓瘤(myeloma)和急性骨 髓性白血病(AML)。此外，已在大量其它病症中发现异常Wnt/β-连环蛋白信 号传导，所述其他病症包括骨质疏松症(osteoporosis)、骨关节炎 (osteoarthritis)、多囊性肾病(polycystic kidney disease)、糖尿病(diabetes)、精 神分裂症(schizophrenia)、血管疾病、心脏疾病、过度增生性病症 (hyperproliferative disorders)和神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)。骨 髓增生性肿瘤(MPNs)是一类密切相关的恶性血液疾病，在这些疾病中，产生 机体血细胞的骨髓细胞异常发育并且功能异常。三种主要的骨髓增生性肿瘤 是真性红细胞增多(Polycythemia Vera，PV)、自发性血小板增多(Essential  Thrombocythemia，ET)和原发性骨髓纤维化(Primary Myelofibrosis，PMF)。 在大多数PV患者和50％的ET和PMF患者中存在JAK2的基因突变。在许 多病例中β-连环蛋白通路在MPN中被激活，并且β-连环蛋白通路对于这些 细胞的存活是必需的。

慢性骨髓性白血病是白血病的一种形式，其特征为骨髓中占主要地位的 骨髓细胞的增多和不受调节的生长以及这些细胞在含有“费城染色体”的血液 中的蓄积，在费城染色体中9号染色体的一部分和22号染色体的一部分断裂并 交换位置，从而形成了bcr-abl融合基因。CML对若干其它致癌通路包括CML 细胞生长所需的β-连环蛋白通路具有激活作用。

因此，需要提供能中断Wnt/β-连环蛋白通路并抑制该通路的异常调节活 性(deregulated activity)的药剂(agent)来治疗、诊断和预防β-连环蛋白通路相 关的病症和疾病。

发明内容

本发明提供了通过施用治疗有效量的抑制转导素β样蛋白1(TBL1)结合 疾病相关分子的药剂来治疗疾病或病症的方法。尤其是，所提供的方法和组 合物涉及对β-连环蛋白信号传导通路的病症的治疗、诊断和/或预防。

在另一个优选实施方式中，β-连环蛋白相关病症包括骨髓增生性肿瘤 (MPN)、慢性骨髓性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(AML)。

在最优选实施方式中，提供的药剂具有以下结构或其药学上可接受的盐：

这一药剂在本申请中通篇被称为化合物1。

在一个优选实施方式中，TBL1选自转导素(β)-样1X-连接的(TBL1X)蛋 白、转导素(β)-样1Y-连接的(TBL1Y)蛋白和转导素(β)-样R1-连接的TBLR1 蛋白。

在一个实施方式中，所述激活因子是β-连环蛋白。

在另一个实施方式中，所述激活因子是β-连环蛋白相关蛋白。

在另一个实施方式中，所提供的药剂可与其它治疗剂联合使用，所述其 它治疗剂包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于尼洛替尼 (nilotinib))、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(包括但不限于帕比司他(panobinostat))、 其它抗癌剂和其它治疗剂。

附图说明

图1A-图1D是描述化合物1单用以及与TG101209联用对MPN细胞在 诱导细胞凋亡方面的活性的柱状图。

图2是描述化合物1单用以及与TG101209联用对分离自患者的原代 MPN细胞在诱导细胞凋亡方面的活性的柱状图。

图3A和图3B是示出化合物1对CML细胞在诱导细胞凋亡方面的活性 的表格。

图4A-图4C是描述化合物1与其它药剂联用对CML细胞在诱导细胞凋 亡方面的活性的棒状图。

图5A是CD34+原代AML细胞，CD34+原代FLT3-ITD AML细胞；和 CD34+正常AML细胞的一组照片。

图5B是CD34+FLT3-ITD原代AML细胞在对照条件下以及施用化合物 1后16小时的一组照片。

图5C是描述化合物1的施用对AML细胞的效应的蛋白质印迹照片。

图6A是示出化合物1的施用对原代AML细胞中β-连环蛋白与TBL1 的结合的效应的蛋白质印迹照片。

图6B是先前施用化合物1和未施用化合物1的染色AML细胞的一组照 片。

图6C是示出化合物1的施用对AML细胞中β-连环蛋白与TBL1的结合 的效应的蛋白质印迹照片。

图7A描述了TOP-FLASH和FOP-FLASH荧光素酶活性相对于采用不同 量的化合物1处理AML细胞的柱状图。

图7B包含采用化合物1处理AML细胞的效应的chIP(染色质免疫沉淀) 分析结果的柱状图。

图7C包含向AML细胞施用100nM化合物1对β-连环蛋白、c-MYC、 细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和p21(对照)的水平的效应的柱状图。

图8A是显示采用不同量化合物1处理的CD34+原代FLT3-WT AML细 胞、CD34+原代FLT3-ITD AML细胞和CD34+正常细胞中非活细胞％的柱状 图。

图8B是显示采用不同量化合物1处理的CD34+CD38-Lin-原代AML细 胞中非活细胞％的柱状图。

图8C是示出采用化合物1处理对植入OCI-AML3的NSG小鼠存活情况 的效应的图表。

图8D是示出采用化合物1处理对植入原代FLT3-ITD AML3的NSG小 鼠存活情况的效应的图表。

具体实施方式

定义

除非另行说明，使用以下定义。

术语“前药”是指在生理条件下变成本发明的化合物或本发明化合物的活 性部分的化合物，包括但不限于本发明化合物的单体和二聚体。

术语“活性部分”是指在体内具有药学活性的化合物，不论这样的化合物 是否为本发明的化合物。

术语“受试者”包括哺乳动物，包括人类。术语“患者”和“受试者”可互换 使用。

术语“骨髓增生性肿瘤(Myeloproliferative Neoplasias)”或“MPN”是指一类 密切相关的恶性血液疾病，在这些疾病中，产生机体血细胞的骨髓细胞异常 发育并且功能异常。三种主要的骨髓增生性肿瘤是真性红细胞增多、自发性 血小板增多和原发性骨髓纤维化。

术语“慢性骨髓性白血病(Chronic Myeloid Leukemia)”或“CML”是指白血 细胞的癌症。它是白血病的一种形式，其特征为骨髓中占主要地位的骨髓细 胞的增多和不受调节的生长以及这些细胞在含有“费城染色体”的血液中的蓄 积，在费城染色体中，9号染色体的一部分和22号染色体的一部分断裂并交换 位置，从而形成了bcr-abl融合基因。

术语“急性骨髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia)”或“AML”是指血液和 骨髓的癌症。

术语“TG101209”是指一种JAK2抑制剂，其是一种针对几种酪氨酸激酶 的可口服生物利用的小分子ATP-竞争性抑制剂。这一化合物也被称为N-叔 丁基-3-[[5-甲基-2-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]嘧啶-4-基]氨基]苯磺酰胺。

术语“治疗有效量”是指施用于受试者以治疗疾病或病症时足以对疾病或 病症的这种治疗产生效应的化合物的量。“治疗有效量”可发生改变，这取决 于多种因素，包括化合物、正在治疗的病症和该病症的严重程度；使用的具 体化合物的活性；使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、 性别和饮食；给药时间、给药途径和使用的具体化合物的排泄速率；治疗的 持续时间；与使用的具体化合物联合或同时使用的药物；以及医学领域中被 熟知的类似因素。例如，本领域技术人员所熟知的是，以低于达到预期治疗 效应所需的水平的化合物剂量开始，逐渐增加剂量直到达到预期的效应。

在一个实施方式中，术语“处理”或“治疗”是指改善疾病或病症(即，阻 止或减轻疾病的发展或其至少一种临床症状)。在另一个实施方式中，“处 理”或“治疗”是指改善至少一种身体参数，该身体参数可能是受试者不能辨别 的。在另一个实施方式中，“处理”或“治疗”是指在身体上(例如，可辨别的 症状的稳定)、生理学上(例如，身体参数的稳定)、或者在这两方面调节疾病 或病症。在另一个实施方式中，“处理”或“治疗”是指延缓疾病或病症的发 作，或者甚至阻止疾病或病症的发作。

术语“药学上可接受的盐”是指那些在合理医学判断的范围内，适合用于 与人类和低等动物的组织接触且不具有异常毒性、刺激性、过敏反应等并与 合理获益/风险比相应的盐。药学上可接受的盐是本领域所熟知的。例如，S. M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1中详细描述了药学上可 接受的盐，以及下列等等(et seq)。

药学上可接受的盐包括但不限于酸加成盐。例如，氮原子可与酸形成 盐。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、 天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺 酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸 盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(异硫代硫酸盐)、乳酸 盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶 酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸 盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和 十一烷酸盐。而且，碱性含氮基团可与如下试剂发生季铵化作用，如低级烷 基卤化物，如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫 酸酯，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯；长链卤化物，如癸基、 月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，如 苄基和苯乙基溴化物以及其它。由此获得了水或油溶性或分散性的产物。可 用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括诸如盐酸、氢溴酸、硫酸 和磷酸的无机酸，以及诸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸的有机酸。

药学上可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子诸如 锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，和无毒季氨和胺阳离子，包括铵、四甲铵、 四乙铵、甲铵、二甲铵、三甲铵、三乙铵、二乙铵和乙铵和其它。其它可用 于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌 嗪等。

发明详述

本发明提供了通过施用治疗有效量的抑制转导素β样蛋白1(TBL1)结合 疾病相关分子的药剂来治疗疾病或病症的方法。尤其是，所提供的方法和组 合物涉及骨髓增生性肿瘤(MPN)、慢性骨髓性白血病(CML)和急性骨髓性白 血病(AML)中β-连环蛋白信号传导通路病症的治疗、诊断和/或预防。

在一方面，本发明涉及治疗和/或预防β-连环蛋白相关病症的方法，所 述方法包括向所需患者施用治疗有效量的与转导素β样蛋白1(TBL1)蛋白结 合的药剂从而阻止β-连环蛋白的结合。

在最优选的实施方式中，所提供的药剂具有以下结构或其药学上可接受 的盐：

这一化合物在本申请中通篇被称为“化合物1”。

在另一个优选实施方式中，β-连环蛋白相关病症包括癌症，其包括但不 限于MPN、CML和AML。

在一个优选实施方式中，TBL1选自转导素(β)-样1X-连接的(TBL1X)、 转导素(β)-样1Y-连接的(TBL1Y)和转导素(β)-样R1-连接的TBLR1蛋白。

化合物1最初是在对其抑制转录激活或β-连环蛋白基因的能力进行基于 细胞的筛选中被鉴定的。通过对该化合物的表征发现了该化合物能诱导β-连 环蛋白的降解，干扰转录激活复合物，并具有核受体信号传导通路调节因子 的特征。化合物1与TBL1相互作用，并阻止β-连环蛋白与TBL1联合，从 而导致β-连环蛋白降解。

已发现化合物1的这一活性可抑制癌细胞中的β-连环蛋白通路，并导致 那些细胞经历细胞凋亡。具体地说，来源于CML患者的细胞系以及来源于 MPN患者的细胞系和原代细胞在化合物1的存在下经历了细胞凋亡和生长 抑制。此外，化合物1的活性与影响这些疾病中在治疗上重要的信号传导通 路的化合物(诸如，JAK2，BCR-ABL和HDAC)具有协同作用，而且可与这 些药剂联合使用以改善患有该病的个体的这些疾病。

因此，在一些实施方式中，所提供的药剂可与其它治疗剂联合使用，所 述其它治疗剂包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于尼洛替尼)、组 蛋白脱乙酰酶抑制剂(包括但不限于帕比司他)、其它抗癌剂和其它治疗剂。

在以上或其它治疗中使用时，可以以纯形式或者当存在所述形式时以药 学上可接受的盐、酯或前药形式使用治疗有效量的一种本发明的化合物。或 者，所述化合物可作为包含所述化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂 的药物组合物被施用。

施用于人或低等动物的本发明化合物的日总剂量可在约0.0001至约 1000mg/kg/天的范围内。如果需要，可将有效日剂量分为多个剂量以便于 施用；因此，单剂量组合物可包含这样的量或其分数以构成日剂量。

为了更清楚地理解本发明，下文提供了详细说明。这些仅为例证，且应 被理解为不以任意方式限制本发明的范围。实际上，根据如下实施例和上述 描述，除了本文已显示和描述的变形之外的本发明的各种变形对本领域技术 人员而言是显然的。意图这些变形也落入所附权利要求书的范围内。

实施例

实施例1

化合物1对MPN细胞在诱导细胞凋亡方面的活性

简要的说，将细胞系HEL92.1.7(图1A和图1C)和UKE1(图1B和图1D) 接种于含有10％FBS和青霉素/链霉素的培养基中。24小时后，将细胞用1) 化合物1；或者2)化合物1联合TG101209处理48小时。处理结束时，用1X PBS洗涤细胞，并用膜联蛋白V(annexin V)和TOPRO3碘化物进行染色。通 过流式细胞术测定凋亡细胞的百分比。

如图1A-1D所示，化合物1(在图例中是指BC2059)诱导HEL92.1.7和 UKE1这两种细胞的细胞凋亡。TG101209增强了这些细胞凋亡-诱导效应。

实施例2

化合物1以及与其它药剂联用对分离自患者的原代MPN细胞在诱导细胞凋亡方面的活性

简要的说，将分离自MPN患者骨髓的CD34+细胞接种于含有10％FBS 和青霉素/链霉素的培养基中。24小时后，将细胞用化合物1或者用化合物1 联合TG101209处理48小时。处理结束时，用1X PBS洗涤细胞，并用膜联 蛋白V和TOPRO3碘化物进行染色。通过流式细胞术测定凋亡细胞的百分 比。使用Chou-Talalay的方法(Adv.Enzyme Regul.22,27–55)测定联合指数 (CI)。

图2是描述这一实验结果的柱状图。可以看出，化合物1(在图例中是指 BC2059)在100nM或以上浓度下诱导CD34+MPN细胞凋亡。加入 TG101209增强了这一效应。

实施例3

化合物1对CML细胞在诱导细胞凋亡方面的活性

简要的说，将细胞系K562(人永生化髓性白血病细胞系(human  immortalized myelogenous leukemia line))和LAMA-84(人白细胞细胞系)接种 于含有10％FBS和青霉素/链霉素的培养基中。24小时后，将细胞用化合物 1处理48小时。处理结束时，用1X PBS洗涤细胞，并用膜联蛋白V和 TOPRO3碘化物进行染色。通过流式细胞术测定凋亡细胞的百分比。

图3A和3B是示出这一实验结果的表格。可以看出，用化合物1处理 增加了细胞周期G0/G1期时凋亡细胞的数目，但是在细胞周期的S或G2/M 期没有显著效应。

实施例4

化合物1与其它药剂联用对CML细胞在诱导细胞凋亡方面的活性

简要的说，将细胞系K562和LAMA-84接种于含有10％FBS和青霉素/ 链霉素的培养基中。24小时后，1)单用化合物1；或者2)化合物1与帕比司 他和尼洛替尼联用处理细胞48小时。处理结束时，用1X PBS洗涤细胞，并 用膜联蛋白V和TOPRO3碘化物进行染色。通过流式细胞术测定凋亡细胞的 百分比。

图4A-图4C是示出这一实验结果的柱状图。如这些图所示，用化合物 1处理增加了K562和LAMA-84这两种细胞系中凋亡细胞的数目。帕比司他 和尼洛替尼增强了化合物1的效应。

实施例5

化合物1在人MPN的小鼠模型中的活性。我们测定了化合物1的体内抗MPN活性。

简要的说，以不到致死量的剂量照射NOD-SCID小鼠，并将HEL92.1.7 输注到尾静脉内，建立MPN。经尾静脉用15或20mg/Kg的化合物1每周两次 (b.i.w)给药3周来处理小鼠。停止给药后追踪动物的存活情况。与对照相 比，化合物1处理的小鼠表现出显著改善的存活情况(p<001)。

实施例6

化合物1对AML细胞中β-连环蛋白表达和核定位的效应

本实验的目的是分析化合物1对AML细胞中β-连环蛋白表达和核定位的 效应。

简要的说，用抗β-连环蛋白抗体和DAPI核酸染色剂对CD34+原代AML 细胞、CD34+原代FLT3-ITD AML细胞和CD34+正常细胞进行染色。还合并 了这些染色照片。这些染色细胞的照片包含在图5A中。如这些照片所示， 在这两种类型的AML细胞中存在大量被表达的β-连环蛋白，而且β-连环蛋白 集中于这些细胞的核中。

图5B示出了用100nM化合物处理CD34+原代FLT3-ITD AML细胞16小 的结果。可以看出，与对照细胞(即，未经化合物1处理)相比，这一处理导 致AML细胞中β-连环蛋白表达和核定位的耗尽。

图5C是进一步示出采用化合物1处理导致AML细胞中β-连环蛋白表达和 核定位耗尽的蛋白质印迹照片。可以看出，用100nM化合物1处理的AML细 胞表达了较少的β-连环蛋白，但是大致相同水平的TBL1、c-MYC、存活素和 β-肌动蛋白。

实施例7

化合物1对AML细胞中β-连环蛋白与TBL1的结合的效应

本实验的目的是分析化合物1对AML细胞中β-连环蛋白与TBL1的结合的 效应。

图6A是示出用100nM化合物1处理8小时后原代AML细胞中存在较少β- 连环蛋白的蛋白质印迹照片。

图6B是先前施用化合物1和未施用化合物1的染色AML细胞的一组照 片。上面一组图描述了对照细胞(先前未施用化合物1)，下面一组图描述了 100nM化合物1给药16小时后的AML细胞。将细胞采用抗β-连环蛋白抗体、 抗TBL1抗体和DAPI核酸染色剂进行染色。还合并了TBL1和抗β-连环蛋白染 色的照片。可以看出，化合物1的施用降低了β-连环蛋白水平并严重破坏了 β-连环蛋白与TBL1的结合。尤其是比较右上方的照片和右下方的照片。

图6C是示出向AML细胞施用化合物1导致β-连环蛋白的蛋白酶体降解的 蛋白质印迹照片。可以看出，与未经处理的AML细胞相比，在用100nM化 合物1处理8小时的AML细胞中存在更少的β-连环蛋白。但是，当向相同 AML细胞施用10nM卡非佐米(Carfilzomib，CZ)(一种蛋白酶抑制剂)时，β-连 环蛋白的量增加。

实施例8

化合物1对AML细胞中β-连环蛋白和靶基因启动子和转录的效应

本实验的目的是分析化合物1对AML细胞中β-连环蛋白和靶基因启动子 和转录的效应。

图7A描述了TOP-FLASH和FOP-FLASH荧光素酶活性相对于采用不同量 的化合物1处理AML细胞的柱状图。

TOP-FLASH是一种转染级T-细胞因子(TCF)报告质粒，它包含两组(其 中第二组是反向的)三拷贝的胸苷激酶(TK)最小启动子和荧光素酶开放阅读 框上游的TCF结合位点(野生型)。

FOP-FLASH是一种包含突变的TCF结合位点的报告质粒，是阴性对 照。

如图7A所示，通过这种荧光素酶检测法测量，用20nM、50nM和100 nM的化合物1处理导致低得多的β-连环蛋白表达。在FOP-FLASH(阴性对照) 中没有减少。这些结果表明采用化合物1处理AMC细胞导致β-连环蛋白表达 减少。

图7B包含用化合物1处理AML细胞的效应的chIP(染色质免疫沉淀)分析 结果的柱状图。如图7B所示，用200nM化合物1处理AML细胞8小时导致存 活素、CCND1和c-MYC的启动子DNA的量减少。

图7C包含向AML细胞施用100nM化合物1对β-连环蛋白、c-MYC、细胞 周期蛋白D1和p21(对照)的水平的效应的柱状图。如图7所显示的，用100 nM化合物处理导致降低的β-连环蛋白、c-MYC和细胞周期蛋白D1表达以及 高得多的p21表达。

实施例9

化合物1对植入原代AML细胞的NSG小鼠的体外细胞凋亡和存活情况的效应。

本实验的目的是分析化合物1对植入原代AML细胞的NSG小鼠的体外细 胞凋亡和存活情况的效应。

图8A是显示采用不同量的化合物1处理的CD34+原代FLT3-WT AML细 胞，CD34+原代FLT3-ITD AML细胞和CD34+正常细胞中非活细胞％的柱状 图。如图8A所示，化合物1在这两种类型的AML细胞中显著诱导体外细胞凋 亡。

图8B是显示采用不同量的化合物1处理的CD34+CD38-Lin-原代AML细 胞中非活细胞％的柱状图。如图8B所示，化合物1显著诱导AML细胞的体外 细胞凋亡。

与对照小鼠相比，在具有由OCI-AML3异种移植细胞建立的AML的 受体缺乏(NSG)小鼠中，采用化合物1每周两次尾静脉输注 处理三周，导致改善的存活情况。图8C包含示出这一实验结果的图表。5 mg/kg化合物1和10mg/kg化合物1处理均导致改善的存活情况，其中10 mg/kg剂量更有效。

在具有原代FLT3-ITD AML异种移植物的NSG小鼠中获得了极为相似的 结果。如图8D中所示，与对照小鼠相比，采用10mg/kg化合物1处理(三周， 每周两次静脉输注)导致存活％显著增加。

这些结果强有力地表明化合物1显著改善了植入原代AML细胞的NSG 小鼠的存活情况。