天山雪莲sikPIP1基因在培育抗寒和抗旱植物中的应用

摘要

本发明涉及一种天山雪莲sikPIP1基因在培育抗寒植物中的应用。本发明从天山雪莲中克隆sikPIP1基因，并在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒和抗旱性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温和耐干旱胁迫性能得到提高，最终获得抗低温和耐旱能力明显增强的植物。从天山雪莲中筛选、克隆出与抗寒直接相关的基因，将其用于农作物品种改良，具有巨大的经济价值。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)中克隆得到 sikPIP1基因，构建组成型植物表达载体，转化植物，并对抗寒和抗旱效果进行评价，以增加植物的 抗寒和抗旱性能。

背景技术：

低温和干旱是常见的非生物胁迫，是影响农作物产量和品质的重要因素。低温和干旱胁迫可使植 物光合作用降低，使细胞脱水，造成膜系统破坏，透性加大，积累活性氧，使位于膜上的酶活性紊乱， 呼吸作用增强，能量产生和物质合成受阻，消耗增强，植物处于饥饿状态，严重影响了植物的正常生 长发育，甚至导致死亡(郭子武，李宪利等，植物低温胁迫响应的生化与分子生物学机制研究进展， 中国生态农业学报，2004，12(2)：54-57)。

水孔蛋白(AQP)又称水通道蛋白，是水专一性通道蛋白，属于膜内在主体蛋白，普遍存在于动、 植物及微生物中(Hofte G M，Hubbard L，Reizer J，et al.Vegetative and seed-specific isoforms of a  putative solute transporter in the tonoplast of Arabidopsis thaliana[J].Plant Physiol，1992，99： 561-570.)。其种类繁多、分布广泛，与植物体内水分的快速、高效运输密切相关。水孔蛋白是一种小 而高度疏水的跨膜蛋白，具有MIP家族结构的典型特征，晶体学和拓扑学研究表明，水孔蛋白具有由 5个环(loop，A-E)相连的6个跨膜α螺旋及N端与C端组成，在膜上形成类似“水漏”状的构象。在 拟南芥基因组中含有至少23个基因编码这一水孔蛋白家族成员，部分水孔蛋白已证明存在于质膜或 液泡膜。AQP的调节机制可以大致分为两种：通过调节AQP的活性来调节其功能(如磷酸化)和通过 改变膜上AQP的含量来调节跨膜水流动(如改变合成速率)。植物水孔蛋白基因可分为四类：质膜内在 蛋白(PIPs)、液泡膜内在蛋白(TIPs)、NLM蛋白(NLMs)和小分子碱性内在蛋白(SIPs)(Chaumont  F，Barrieu F，Jung R，et al.Plasma membrane intrinsic proteins from maize cluster in two sequence  subgroups with differential aquaporin activity.[J].Plant Physiol，2000，(122)：1025-1034.) 。相关研究表明，AQP的表达受发育、干旱、低温、ABA等的调节(Tyeman SD，et al.Plant  aquaporins：multifunctional water and solute channels with expanding roles[J].Plant Cell  Environ，2002，(25)：173-194.and QUINRTERO J M，FOURNIER JM，BENLLOCHM，Water transport  in sunflower root systems effects of ABA，Ca²⁺ status and HgCl₂[J].J Exp Bot，1999，339：1607-1612. )。

作为新疆的特色植物，新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)，又名天山雪莲、雪莲花等。 属菊科凤毛菊属，主要生长于海拔2400～4100m的高山草甸、高山冰碛石和流石滩石隙、悬崖峭壁石 缝等处。那里气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温3～5℃，最低月平均温-19～-21℃，年 降水量约800毫米，无霜期仅有50天左右。

天山雪莲经过长期的自然选择，形成了稳定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了适应极端环境 条件下的生理和生化机制，这种与环境相适应的机制，与一般的耐冷、抗寒应答性的适应机制不同， 主要表现在其低温条件下能够正常的生长发育，而一般的抗寒性植物在相应的低温条件下，生长发育 受到抑制。近年来植物抗寒基因工程得到迅速发展，并研究出了多种转基因抗寒植物，为培育抗寒植 物开辟了新途径。

发明内容：

前期我们利用GateWay技术构建的低温胁迫下天山雪莲叶片组织的cDNA文库，从天山雪莲文 库中筛选克隆到天山雪莲水孔蛋白基因sikPIP1，为了研究该基因的功能，我们构建了该基因的植物 表达载体，并将此基因导入烟草中，提高了植物的抗寒和抗旱性。

本发明的一个目的是为植物抗寒和抗旱育种提供有价值的水孔蛋白基因sikPIP1，其发明的目还 在于构建植物表达载体：pBI121-sik PIP1，在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒和抗旱 性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温和干旱胁迫性能得到提高，最终获得抗(耐)低温和干 旱能力明显增强的植物。

本发明的目的是通过以下过程和方法实现的：

本发明所述的从天山雪莲中克隆sik PIP1基因，其序列为<210>1。

本发明的从天山雪莲中克隆sik PIP1基因的过程如下：

提取经低温处理的天山雪莲RNA，并以RNA反转录成的cDNA为模板，利用Primer5.0设计分别带 有Xba I和SacI的PCR引物P1和P2进行扩增，得到目的基因；

构建sik PIP1基因植物表达载体pBI121-sik PIP1；

利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得转基因植物并对其抗寒性进行 功能研究：

植物在受到低温和干旱胁迫处理后，细胞膜会受到损伤而导致细胞电解质会发生外渗，从而导致电 导率的升高。野生型(CK)和转天山雪莲PIP1基因基因烟草在移栽3周后分别经低温和干旱处理后， 测定烟草叶片电导率。结果表明，非低温胁迫条件下，转基因烟草与野生型烟草的相对电导率相差不大， 但-4℃低温处理2h后野生型烟草的相对电导率显著高于转基因烟草；非干旱胁迫条件下，转基因烟 草与野生型烟草的相对电导率相差不大，但在9d干旱处理后野生型烟草的相对电导率显著高于转基因 烟草。

MDA是膜脂过氧化的产物之一，其含量可以用于表示脂质过氧化的程度。野生型(CK)和转天 山雪莲PIP1基因烟草在移栽3周后经低温和干旱处理后，计算烟草叶片MDA含量。结果表明，随着 低温胁迫时间的延长，野生型烟草比转基因烟草的MDA含量增加大，表明低温胁迫导致野生型烟草的 细胞膜系统受损严重，而转基因烟草的膜系统受损程度较轻；同样在干旱胁迫下，烟草MDA含量呈上 升趋势，但转基因烟草MDA含量低于野生型烟草，认为转基因烟草的生物膜系统由于天山雪莲PIP1 基因的表达而对其产生了一定的保护作用。

本发明不仅得到天山雪莲抗寒和抗旱相关的水孔蛋白sikPIP1，而且将其构建成植物表达载体 pBI121-sikPIP1，在转基因植物中研究了该基因在提高植物耐低温和干旱性能中的重要功能。这对于 揭示雪莲的抗寒和抗旱机理，丰富植物抗寒和抗旱分子生物学理论，提高植物的耐低温和抗旱能力， 具有重要的意义。

转天山雪莲水孔蛋白基因sikPIP1烟草的抗寒和抗旱功能分析表明，转基因烟草的抗寒和抗旱性 得到显著提高。

附图说明：

图1是天山雪莲sikPIP1基因RT-PCR扩增图Fig1：sikPIP1 gene PCR amplified

图2是pGM-sikPIP1酶切鉴定Fig2：Restriction enzyme digestion identification of pGM-sikPIP1

图3是pBI121-sikPIP1 PCR鉴定Fig3：PCR identification of pBI121-sikPIP1

图4是pBI121-sikPIP1酶切鉴定Fig4：Restriction enzyme digestion identification of pBI121 -sikPIP1

图5是转化GV3101 PCR鉴定 Fig5：PCR identification of pBI121-sikPIP1-GV3101

图6是转化烟草PCR检测 Fig6：PCR identification of transformed tobacco

图7是转基因烟草RT-PCR分析 Fig7：RT-PCR analysis on transgenic tobacco

图8低温胁迫下不同烟草电导率测定 Fig8：The measurement of conductivity in different tobaccoes  under cold stress

图9是干旱胁迫下烟草电导率测定 Fig.9：The measurement of conductivity in different tobaccoes under drought stress

图10低温胁迫下不同烟草MDA含量的测定 Fig.10：The measurement of the content of MDA in  different tobaccoes under cold stress

图11干旱胁迫下不同烟草MDA含量的测定 Fig.11：The measurement of the content of MDA in  different tobaccoes under drought stress

图12是植物表达载体是pBI121-sikPIP1的构建流程图

图1中：

1：Marker；2：sik PIP1；3：阴性对照；

图2中：

1：Marker；2：pGM-sik PIP1双酶切；3：质粒对照；

图3中：

1：Marker；2：pBI121-sik PIP1；3：阴性对照；

图4中：

1：Marker；2：质粒对照；3：pBI121-sik PIP1双酶切；

图5中：

1：Marker；2：pBI121-sik PIP1-GV3101；3：阴性对照

图6中：

1：Marker；2：pBI121-sik PIP1对照；3-6：sik PIP1转化烟草；7阴性对照；

图7中：

1：Marker；2：pBI121-sik PIP1对照；3-10：sik PIP1转化烟草；11：阴性对照；

具体实施方式：

实验所涉及的药品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为上海生工公司生产；LA PCRTM in vitro Cloning  Kit购自TaKaRa公司；RNA酶、Taq酶、T4-DNA连接酶(T4-DNA ligase)、Marker、TRNzol总RNA提取 试剂购于TIANGEN公司；Xba I、SacI等限制性内切酶为Fermentas公司原装；IPTG、X-gal及抗生素、 植物激素购自上海Sangon公司；其他试剂及配制MS培养基的各种试剂均为国产分析纯。具体实验操 作依据[美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔的《分子克隆实验指南》。

1)实施例1：从天山雪莲中克隆到sikPIP1基因

1.1天山雪莲总mRNA的提取

1)将研钵及所用的器具在180℃烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的枪头、离心管均使用0.1％的 DEPC处理，高压灭菌；

2)取植物幼嫩叶片约0.1g于研钵中，加液氮充分研磨至粉末状；

3)将粉末分装至1.5mL的小离心管中，加入1ml的TRNzol提取试剂，充分快速混匀，室温放 置3-5min。

4)10000rpm，4℃离心5min，吸上清至一新的离心管，加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀；

5)10000rpm，4℃离心5min，吸取上层液体至另一新的离心管后，加入600μl预冷的异丙醇， 于-20℃沉淀30min；

6)10000rpm，4℃离心10min后，倒掉液体，在离心管底部即可见到白色沉淀，即为总RNA。

7)用70％的乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入30μl ddH₂O(DEPC 处理)溶解，保存于-20℃备用。

1.2cDNA第一链的合成

在DEPC处理的0.2ml离心管中加入RNA 5μl，Oligo dT 2μl，ddH2O 5μl后，在75℃水浴10min 后迅速置于冰上2min。然后在离心管中加入dNTP(2.5mmol/L)2ul，Rnase Inhibitor 1μl，M-MLV-RT 反转录酶1μl，DEPC ddH₂O 5ul，42℃ 1hr，70℃ 15min后，-20℃保存。

1.3cDNA第二链的合成及扩增

以天山雪莲cDNA为模板，用P1和P2为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性 对照。

sP₁为：5′TGCTCTAGAGCATGAGTTTTAGAGAGAGAAATGTCG 3′

             Xba I

sP2为：5′′TGCGAGCTCATTAATTTGTAGCATTGCTTCTGA3′

               Sac I

PCR反应体系(20μl)为：

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸45s，30cycles；72 ℃延伸7min；4℃保温。如图1、2。

PCR反应结束后，产物经浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用上海生工的琼脂糖凝胶回收 试剂盒按照说明书方法分别回收目的基因，得到的目的片段命名为sikPIP1。然后将目的片段和克隆载 体pGM-T连接并转化，经鉴定正确的命名为pGM-sikPIP1。

实施例2：构建sikPIP1基因植物表达载体

构建植物表达载体：pBI121-sikPIP1。用Xba I Sac I分别双酶切植物表达载体pBI121和克隆载体 pGM-sikPIP1，回收目的基因片段和载体片段。将目的基因片段与载体片段进行体外连接，经鉴定正 确的重组质粒分别命名为pBI121-sikPIP1，如图3、4。

在本实施方案中，sikPIP1基因和pBI121构成一个植物表达载体，用于植物的转化。根据本发明 的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了pBI121之外，还可以选用其他植物表达载体。

实施例3：农杆菌的转化：

3.1农杆菌感受态的制备

1)从新鲜的GV3101平板上挑取一个单菌落于LB液体培养基(5ml)+Rif(50ug/ml)+Gen (50ug/ml)中，于28℃、200rpm振荡培养48hr；

2)取200ul菌液于20ml的含Rif(50ug/ml)及Gen(50ug/ml)的LB液体培养基中活化培养至 OD₆₀₀＝0.5-0.8收集菌液，冰浴30min；

3)分装菌液于1.5ml离心管，于4℃，6000rpm离心5min，弃尽上清，收集农杆菌细胞；

4)将沉淀的农杆菌用750ul预冷的0.05mol/LCaCl₂重悬，4℃，8000rpm离心5min；

5)弃上清用75ul 0.05mol/lCaCl₂(10％甘油)重悬细胞，保存于-70℃。

3.2植物表达载体转化根癌农杆菌GV3101(冻融法)

1)吸取10μl上述重组载体质粒(约0.5μg/μl)，与75μl GV3101感受态细胞轻轻混匀，冰浴 30min，然后液氮冻存5min；

2)迅速置于37℃水浴2min；

3)加入600μl液体LB培养基(Rif+Gen)，28℃、200rpm振荡培养5hr；

4)将上述培养液于6000rpm离心5min，收集农杆菌细胞，弃去500μl液体培养基，剩余100μl 重悬细胞；

5)将菌液涂布在含有Kan 50μg/ml，Rif50μg/ml及Gen50μg/ml的固体LB培养基平板上，28℃ 培养24-48hr。

3.3 阳性克隆筛选

挑取若干单菌落，进行菌落PCR，将筛选出的阳性克隆命名为：pBI121-sikPIP1-GV3101。

在本实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉 的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化植物。如图5。

实施例4：烟草遗传转化及再生

本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各种不同的转化技 术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法， 显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等均可。

本方案中用于将转化细胞再生成植株的方法，可以使用适合于其他靶植物。最好使被转化的序列 稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的 核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。

4.1农杆菌浸染液的制备

1)从-70℃保存的含有：pBI121-sikPIP1的GV3101农杆菌甘油管中挑取菌块，接种于5ml附加有Kan  50μg/ml，Rif50μg/ml，Gen 50μg/ml的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养约30hr；

2)吸取200μl菌液，再用20ml LB液体培养基(Kan 50μg/ml，Rif50μg/ml，Gen 50μg/ml)稀释，28℃， 200rpm振荡培养约4hr；

3)活化的菌液培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6时，即为转化用的浸染液。

4.2浸染

1)超净工作台上将浸染液倒入无菌培养皿中，将无菌烟草叶片剪成1cm²大小的方块，放入菌液中， 振荡浸染10min；

2)取出烟草叶片，用滤纸吸干净叶盘上附着的菌液；

3)在共培养基(MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.3mg/L)上覆一张无菌滤纸，将浸染过的叶盘均匀地摆放 在滤纸上；在26℃暗培养条件下共培养2-3天。

4.3抗性愈伤组织筛选及出芽诱导

将共培养过的烟草叶盘转移至MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的烟草 诱导选择培养基上，叶盘伤口充分接触培养基。每25d左右转接一次，转接1-2次以后，叶盘边缘逐 渐产生淡绿色、致密的愈伤组织，继续培养直至诱导出丛生芽。

4.4转化植株的生根培养和移栽

待丛生芽长至2-3cm左右时，将其切下转接到MS+IAA 0.3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的烟草 生根选择培养基上进行生根培养。

转基因烟草15天左右开始有根生成，待根系发达时，将根系生长良好的转化植株，去除封口膜， 室温环境中进行炼苗7天左右，然后用水洗净培养基，将苗转入基质(蛭石∶腐质土＝2∶1)中，26 ℃，16hr 40μmol·m^-2·s^-1光照，70％相对湿度条件下培养，前2-3天需遮阴、避光、保湿。

实施例5：转基因烟草的分子检测

5.1转基因烟草的PCR鉴定

5.1.1烟草DNA的提取(SDS法)

1)取0.1g新鲜叶片，用玻棒在1.5ml离心管内充分研磨；

2)加入400μl提取缓冲液，充分混匀，12000rpm离心5min；

3)小心吸取300μl上清液，加入300μl异丙醇，室温沉淀20min，12000rpm离心10min，收集 沉淀；

4)将沉淀充分风干，加400μl TE溶解沉淀；

5)加入400μl氯仿/异戊醇(24/1)，充分混匀，静置20min，12000rpm离心10min；

6)小心吸取上清，加入40μl 3M NaAC(pH5.2)，800μl无水乙醇，-20℃沉淀过夜；

7)4℃，12000rpm离心15min，弃上清；

8)70％酒精洗涤两次，吹干后用30μl ddH₂O溶解。

5.1.2转基因烟草的PCR鉴定

以提取的转化基因的烟草DNA为模板，用P1和P2为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进 行扩增作为阴性对照，扩增体系如实施例1。如图6。

5.2转基因烟草的RT-PCR检测

5.2.1 待检测植株总RNA的提取

TIANGEN公司的TRNzol总RNA提取试剂提取已鉴定的转基因烟草和未转化的烟草总RNA， 方法同实施例1。

5.2.2 cDNA第一链的合成

方法同实施例1。

7.2.3 cDNA第二链的合成及扩增

在PCR反应管中加入cDNA第一链反应产物1μl，5×Taq buffer 4μl，MgCl₂(25mM)1.0μl，dNTP (2.5mM)0.5μl，上下游引物(25μmol)各0.5μl，ddH₂O补足至20μl，反应条件同实施例1。如图 7。

实施例6 野生型和转基因植株的模拟冷冻和干旱处理及叶片电导率测定

转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成活后选取生长 一致的苗(5-7叶期)，进行模拟冷冻胁迫和干旱胁迫处理。分别用打孔器从叶片中打取小圆片测定 叶片电导率。如图8，9所示。

实施例7：野生型和转基因植株的模拟冷冻和干旱处理叶片的MDA含量测定

转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。MDA是膜脂过氧化 的产物之一，其含量可以表示脂质过氧化的程度。烟草经不同低温温度处理，MDA的含量均有所提 高。从结果中分析得出，不管是0℃，-4℃低温处理8hr，野生型烟草比转基因烟草的MDA含量增加 大，说明野生型植株膜质的过氧化程度相对较高。原因可能在于转基因烟草降低了脂质过氧化的程度。 如图10，11所示。

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