血管紧张素、血管紧张素醋酸盐的制备方法

摘要

本发明公开了血管紧张素、血管紧张素醋酸盐的制备方法。该血管紧张素的制备方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将血管紧张素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。本发明将反相纯化和反相脱盐联用，设计出聚合物填料苯乙烯-二乙烯基苯的最新应用，可以大批量制备血管紧张素和血管紧张素醋酸盐。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及血管紧张素、血管紧 张素醋酸盐的制备方法。

背景技术

血管紧张素(或血管紧张素胺)为增血压药，英文名angiotensinamide 或[Asn¹，Val⁵]-angiotensinⅡ，化学结构为 L-Asn-L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-Phe，是由八个氨基酸残基组 成的合成多肽，理论分子量1031.18。血管紧张素用于外伤或手术后休克和 全身麻醉或腰椎麻醉时所致的低血压症等，可预防或治疗围手术期低血压， 作为急救用药治疗休克期低血压，也可用于治疗血管紧张素转换酶抑制剂用 药过量且常规治疗无效时。

鞣酸加压素，是由九个氨基酸残基组成的合成多肽，其化学结构为 L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly(1→6)-二硫键鞣 酸盐，加压素的理论分子量1084.24。鞣酸加压素为抗利尿激素药，能促进 远端肾小管及集合管对水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制剂临床用于治 疗尿崩症。

醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)，是由七个氨基酸残基和一个苏氨醇组 成的合成多肽，化学结构为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰 -L-赖氨酰-L-苏氨酰-N-[2R-羟基-1R-(羟甲基)丙基]-L-半胱氨酰胺环(2→7) -二硫键醋酸盐，奥曲肽的理论分子量为1019.26，其原料药冻干粉中醋酸含 量为5％～12％。醋酸奥曲肽可抑制生长激素，抑制胃肠胰脏分泌多肽等，其 制剂临床用于需要长期奥曲肽治疗的活动性肢端肥大症，如术后生长激素残 留致血清生长激素水平增高，垂体外照射放射治疗后尚未达到充分疗效的血 清生长激素水平升高，部分不适合手术治疗及新诊断生长激素分泌腺瘤患者 的术前治疗。

目前已上市多肽药物常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱 法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法，也是我们固相合成血 管紧张素纯化和脱盐的主要技术手段。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先 中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到我们目标多肽血 管紧张素分子量约1kD，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处 理量小，比较适合分子量大于10kD蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低 压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用 色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不 等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。如果采用高 盐洗脱，后期处理无法找到合适的脱盐方案，分离纯化效果也有限，样品损 失很大，回收率计算也较复杂，对于后期反相制备很不利。现在还缺乏一种 有效的制备多肽盐原料药的方法，因此仍然迫切需要开发新的多肽盐的纯化 工艺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中多肽盐的制备工 艺复杂、收率低的缺陷，而提供了一种多肽、多肽盐的制备方法。本发明的 多肽盐的制备方法以多肽为起始原料，经过高压反相色谱纯化和脱盐步骤， 制备高纯度的多肽盐、特别是血管紧张素醋酸盐、鞣酸加压素和醋酸奥曲肽 的方法。

发明人经过反复的研究发现，目前高压反相色谱法经典纯化的填料是硅 胶基质，其柱效好，分辨率高，但色谱条件pH2-7耐受较窄；而安捷伦聚 合物填料PLRP-S为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，可耐受较宽阔 的pH范围(pH范围可达1-14)，并且可用1M NaOH溶液再生，也可以精 准控制孔径大小与孔径形态，使得溶质分子无障碍扩散，相对于硅胶基质， 其增加了有效表面积，能保持很好的柱效和分辨率，且提升了填料的载样量。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供了一种多肽的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反 相色谱法将多肽粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反 相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。

其中，所述的多肽粗品可为本领域的各种多肽粗品，较佳地为碱性多肽 粗品，更佳地为血管紧张素粗品、加压素粗品或奥曲肽粗品。所述的血管紧 张素粗品较佳地为专利申请CN201210131066.5公开的采用固相法合成的血 管紧张素粗品，HPLC纯度为80～90％；所述的加压素粗品较佳地为专利申 请CN201210131067.X公开的采用固相法合成的加压素粗品，HPLC纯度为 80～90％；所述的奥曲肽粗品较佳地为采用固相法合成制得的奥曲肽粗品， HPLC纯度为80～90％。

所述的多肽粗品溶液较佳地为多肽粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙 腈水溶液形成的10g/L溶液。

其中，所述的反相纯化的条件优选如下：流动相A为体积百分比为0.1％ 的三氟乙酸水溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液， 流动相C为所述的多肽粗品溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为 200mL/min)，检测波长为220nm；

按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～2min 95％A+5％B 2 2～22min 100％C 3 22～40min 95％A+5％B 4 40～100min 95％A+5％B→65％A+35％B 5 100～110min 40％A+60％B 6 110～120min 95％A+5％B

收集保留时间为45～95min的洗脱液得到多肽-三氟乙酸溶液。

其中，所述的反相脱盐的条件优选如下：流动相A为水，流动相B为 乙腈，流动相C为0.1mol/L NaOH溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为 200mL/min)，检测波长为220nm；

按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～5min 95％A+5％B 2 5～45min 75％A+25％多肽-三氟乙酸溶液 3 45～55min 95％A+5％B 4 55～75min 75％A+5％B+20％C 5 75～95min 95％A+5％B 6 95～155min 95％A+5％B→65％A+35％B 7 155～175min 40％A+60％B 8 175～180min 95％A+5％B

收集保留时间为100～155min的洗脱液即可得到多肽溶液。

其中，所述的高效液相反相色谱法的装填条件优选如下：填料为安捷伦 PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，孔径10nm，粒径10μm， 装柱密度0.33g/mL，柱压为650psi。

本发明还提供了多肽盐的制备方法，其包括下述步骤：将上述制备方法 得到的多肽溶液与酸混合，即可。

其中，所述的酸较佳地为冰醋酸或鞣酸。

本发明中，在所述的混合结束后，优选还进行减压浓缩，冷冻干燥，即 可得到多肽盐冻干粉体。所述的减压浓缩的压力较佳地为-0.15～-0.05MPa， 所述的减压浓缩的温度较佳地为25～35℃。

其中，所述的多肽较佳地为血管紧张素、加压素或奥曲肽。

其中，所述的多肽盐较佳地为血管紧张素醋酸盐、加压素鞣酸盐或奥曲 肽醋酸盐。

血管紧张素、加压素和奥曲肽都是一种多肽物质，在碱性条件下不稳定， 易降解，尤其是强碱环境下，本发明综合考察了碱洗脱的浓度和时间，以保 证减少脱盐过程中样品的破坏及损失。

本发明创新点在于将反相纯化和反相脱盐联用，血管紧张素中含有一个 碱性精氨酸残基(其胍基侧链pKa值为12.48)和一个碱性组氨酸残基，加 压素中含有一个碱性精氨酸残基，而奥曲肽中则含有一个碱性赖氨酸的残 基，该多肽在强酸性条件下结合TFA(三氟乙酸)能力很强，并且可能有多 个碱性残基位点可以结合，需强碱才能将TFA中和置换除去，为了大批量 制备和脱盐工艺，设计出聚合物填料PLRP-S的最新应用。本发明创新性运 用了反相吸附法脱盐，采用在线稀释上样解决了反相纯化和反相脱盐联用的 问题。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明利用了酸碱中和的方法，先用强碱中和强酸，利用多肽和 反相填料的疏水结合，在色谱柱上中性洗脱游离的强酸根，并采用碱性洗脱 中和结合的强酸根，制备除酸的多肽溶液。

(2)本发明采用在线上样，不用稀释样品溶液，直接在液相系统管路 里混合样品溶液和流动相A、流动相B，上样到色谱柱上，避免了稀释后， 样品体积过大，浓度被稀释的问题，适合连续的生产。

(3)本发明创新性地运用了反相吸附法脱盐，采用在线稀释上样解决 了反相纯化和反相脱盐联用的问题，优化了生产工艺，适合工业化连续生产。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1(HPLC法检测血管紧张素粗品原料和纯化中间体溶液纯度及 定量)

仪器：Waters2695/2489高效液相色谱仪

分离柱：Waters XBridge-C18，4.6×150mm，5μm

流动相：A为20mM NaH₂PO₄-H₃PO₄(pH3.0)，B为体积百分比为50％ 的乙腈水溶液

流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，室温检测，

洗脱梯度见下表1所示，百分比为体积百分比。

表1流动相洗脱梯度

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～7min 90％A+10％B→60％A+40％B 2 7～13min 60％A+40％B→50％A+50％B 3 13～35min 50％A+50％B→100％B 4 35～40min 100％B 5 40～45min 90％A+10％B

实施例2(75mm内径L&L4003制备柱装填)

运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术，填料为苯乙烯-二乙烯 苯共聚物(反相填料安捷伦PLRP-S)，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度 0.33g/mL，装填至柱床压力650psi，采用Varian色谱装填系统，370g干粉 填料，2L甲醇搅拌匀浆后，倒入75mm内径L&L4003制备柱，压缩比为3:1， 载气为N₂，调节载气压力使得油压表压力为2000psi，动态轴向压缩至柱床 高度26cm，作为反相纯化和反相脱盐方案所用的制备柱。

实施例3

(一)血管紧张素粗品原料的反相纯化

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S 10μm10nm

流动相：A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，B为体积百分比为 0.1％三氟乙酸乙腈溶液，血管紧张素粗品(专利申请CN201210131066.5公 开的采用固相法合成的血管紧张素粗品)经过体积百分比5％的乙腈水溶液 为溶剂溶解配制成10g/L溶液，过滤澄清后样液为流动相C，按实施例1的 方法测定其HPLC纯度为84.98％，，保留时间为10.34min，HPLC数据见表 2所示。

表2血管紧张素粗品HPLC检测的峰结果

峰编号 保留时间(min) 面积(微伏*秒) 高度(微伏) ％面积 1 5.723 114660 9972 0.68 2 6.470 13557 1592 0.08 3 7.598 9823 899 0.06 4 8.133 76178 7881 0.45 5 8.738 67006 7818 0.40 6 9.088 8971 1327 0.05 7 9.631 46650 4709 0.28 8 10.335 14357014 1242791 84.98 9 10.988 276934 44721 1.64 10 11.138 1118879 118916 6.62 11 11.817 131299 8221 0.78 12 12.251 21447 2115 0.13 13 12.541 30951 3707 0.18

本实施例的反相纯化条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗 脱梯度见下表3所示，对保留时间为56.5-62min目标主峰进行收集为血管 紧张素-三氟乙酸溶液，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为98.89％，保 留时间为10.51min，HPLC数据见下表4。

表3反相纯化的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～2min 95％A+5％B 2 2～22min 100％C 3 22～40min 95％A+5％B 4 40～100min 95％A+5％B→65％A+35％B 5 100～110min 40％A+60％B 6 110～120min 95％A+5％B

表4血管紧张素-三氟乙酸溶液HPLC检测的峰结果

峰编号 保留时间(min) 面积(微伏*秒) 高度(微伏) ％面积 1 5.706 3447 360 0.02 2 8.863 7995 949 0.06 3 9.808 14220 1760 0.10 4 10.514 13765923 1133552 98.89 5 11.191 129102 13699 0.93

(二)血管紧张素-三氟乙酸溶液的反相脱盐

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S 10μm10nm

流动相：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1M NaOH 溶液，流速200mL/min，220nm检测，反相脱盐的洗脱梯度见表5所示，对 保留时间为120-132min目标主峰进行收集为血管紧张素除TFA溶液，按实 施例1中方法测定其HPLC纯度为99.51％，保留时间为10.39min，HPLC数 据见表6。

表5反相脱盐所用的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～5min 95％A+5％B 2 5～45min 75％A+25％血管紧张素-三氟乙酸溶液 3 45～55min 95％A+5％B 4 55～75min 75％A+5％B+20％C 5 75～95min 95％A+5％B 6 95～155min 95％A+5％B→65％A+35％B 7 155～175min 40％A+60％B 8 175～180min 95％A+5％B

表6血管紧张素除TFA溶液HPLC检测的峰结果

峰编号 保留时间(min) 面积(微伏*秒) 高度(微伏) ％面积 1 8.799 11184 1521 0.05 2 9.730 3823 557 0.02 3 10.387 22413365 1987946 99.51 4 11.098 36099 4959 0.16 5 11.326 53415 7451 0.24 6 11.750 6245 657 0.03

实施例4(血管紧张素成盐、浓缩及冻干)

将实施例3得到的血管紧张素除TFA溶液1L，加入2mL冰醋酸，得到 血管紧张素醋酸盐溶液，在-0.1MPa、30℃条件下减压旋转浓缩除去溶液中 的部分乙腈，分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布 送入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计 好的冻干曲线进行冷冻干燥，经冷冻干燥得到血管紧张素醋酸盐冻干粉固体 13.3g，按投料40g血管紧张素粗品计算收率为33.2％，按实施例1的方法测 定其HPLC纯度为99.18％，保留时间为10.53min，HPLC数据见表7所示。

表7血管紧张素醋酸盐冻干粉的HPLC检测的峰结果

峰编号 保留时间(min) 面积(微伏*秒) 高度(微伏) ％面积 1 8.864 7464 921 0.06 2 10.529 11398620 1121376 99.18 3 11.176 23762 2733 0.21 4 11.406 51069 5939 0.44 5 11.797 11452 642 0.10

实施例5(血管紧张素醋酸盐质谱检测)

采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定血管 紧张素醋酸盐样品分子量，结果显示分子质量峰[M+1]⁺测定值1031.93，主 要离子碎片峰[M+2]²⁺测定值516.65，都符合理论值1031.18。

实施例6(离子色谱法测定血管紧张素醋酸盐样品中醋酸含量及TFA残 留)

仪器：美国Dionex500离子色谱仪

分离柱：IonPacAS₁₄-AG₁₄

检测方式：电导

淋洗液：1.0mM NaHCO₃+3.0mM>2CO₃

取样品100mg加入10mL淋洗液溶解后过DionexOnGuardⅡRP前处理 预柱，进离子色谱仪检测含量。检测结果显示，醋酸含量为9.35％(质量百 分比)，TFA含量为未检出(检测限5μg/g)。

实施例7(HPLC法检测加压素粗品原料和纯化中间体溶液纯度)

仪器：Waters2695/2489高效液相色谱仪

分离柱：Agilent XDB-C184.6×250mm，5μm

流动相：A为体积百分比为0.1％TFA水溶液，B为体积百分比为0.1％TFA -50％的乙腈水溶液

流速为1.0mL/min，检测波长为214nm，室温检测，

洗脱梯度见下表8所示，百分比为体积百分比。

表8流动相洗脱梯度

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～5min 95％A+5％B 2 5～25min 95％A+5％B→50％A+50％B 3 25～30min 100％B 4 30～35min 95％A+5％B

实施例8

(一)加压素粗品原料的反相纯化

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S 10μm10nm

流动相：A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，B为体积百分比为 0.1％三氟乙酸乙腈溶液，加压素粗品(专利申请CN201210131067.X公开的 采用固相法合成的加压素粗品)经过体积百分比5％的乙腈水溶液为溶剂溶 解配制成10g/L溶液，过滤澄清后样液为流动相C，按实施例7的方法测定 其HPLC纯度为88.13％，保留时间为14.40min。

本实施例的反相纯化条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗 脱梯度见下表9所示，对保留时间为48-54min目标主峰进行收集为加压素- 三氟乙酸溶液，按实施例7的方法测定其HPLC纯度为99.19％，保留时间 为14.60min。

表9反相纯化的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～2min 95％A+5％B 2 2～22min 100％C 3 22～40min 95％A+5％B 4 40～100min 95％A+5％B→65％A+35％B

5 100～110min 40％A+60％B 6 110～120min 95％A+5％B

(二)加压素-三氟乙酸溶液的反相脱盐

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S 10μm10nm

流动相：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1M NaOH 溶液，流速200mL/min，220nm检测，反相脱盐的洗脱梯度见下表10所示， 对保留时间为102-112min目标主峰进行收集为加压素除TFA溶液，按实施 例7中方法测定其HPLC纯度为99.81％，保留时间为14.51min。

表10反相脱盐所用的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～5min 95％A+5％B 2 5～45min 75％A+25％加压素-三氟乙酸溶液 3 45～55min 95％A+5％B 4 55～75min 75％A+5％B+20％C 5 75～95min 95％A+5％B 6 95～155min 95％A+5％B→65％A+35％B 7 155～175min 40％A+60％B 8 175～180min 95％A+5％B

采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定其分 子质量峰[M+1]⁺测定值1084.40，主要离子碎片峰[M+2]²⁺测定值542.75，都 符合理论值1084.24。按实施例6测得加压素除TFA溶液中TFA含量为未检 出(检测限5μg/g)。

实施例9(加压素成盐、浓缩及冻干)

将实施例8得到的加压素除TFA溶液1L，在-0.1MPa、30℃条件下减压 旋转浓缩除去溶液中的部分乙腈，缓慢加入质量体积比为20％的鞣酸水溶 液，鞣酸用量按每一万单位加压素加一克鞣酸计，边加搅拌，得到加压素鞣 酸盐溶液，分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送 入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好 的冻干曲线进行冷冻干燥，经冷冻干燥得到鞣酸加压素冻干粉固体10.2g， 按投料40g加压素粗品计算收率为25.5％。

实施例10(HPLC法检测奥曲肽粗品原料和纯化中间体溶液纯度)

仪器：Waters2695/2489高效液相色谱仪

分离柱：Kromasil100-3.5C18column4.6×100mm

流动相：A为10％四甲基氢氧化铵:水:乙腈体积百分比为2:88:10的水溶 液，B为10％四甲基氢氧化铵:水:乙腈体积百分比为2:38:60的水溶液。

流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，室温检测，

洗脱梯度见下表11所示，百分比为体积百分比。

表11流动相洗脱梯度

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～30min 73％A+27％B 2 30～31min 73％A+27％B→55％A+45％B 3 31～37min 73％A+27％B

实施例11

(一)奥曲肽粗品原料的反相纯化

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S 10μm10nm

流动相：A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，B为体积百分比为 0.1％三氟乙酸乙腈溶液，奥曲肽粗品(采用固相法合成制得)经过体积百分 比5％的乙腈水溶液为溶剂溶解配制成10g/L溶液，过滤澄清后样液为流动 相C，按实施例10的方法测定其HPLC纯度为85.13％，保留时间为8.59min。

本实施例的反相纯化条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗 脱梯度见下表12所示，对保留时间为86-92min目标主峰进行收集为奥曲肽 -三氟乙酸溶液，按实施例10的方法测定其HPLC纯度为99.49％，保留时间 为8.66min。

表12反相纯化的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～2min 95％A+5％B 2 2～22min 100％C 3 22～40min 95％A+5％B 4 40～100min 95％A+5％B→65％A+35％B 5 100～110min 40％A+60％B 6 110～120min 95％A+5％B

(二)奥曲肽-三氟乙酸溶液的反相脱盐

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S 10μm10nm

流动相：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1M NaOH 溶液，流速200mL/min，220nm检测，反相脱盐的洗脱梯度见表13所示， 对保留时间为142-152min目标主峰进行收集为奥曲肽除TFA溶液，按实施 例10中方法测定其HPLC纯度为99.91％，保留时间为8.62min。

表13反相脱盐所用的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～5min 95％A+5％B 2 5～45min 75％A+25％奥曲肽-三氟乙酸溶液 3 45～55min 95％A+5％B

4 55～75min 75％A+5％B+20％C 5 75～95min 95％A+5％B 6 95～155min 95％A+5％B→65％A+35％B 7 155～175min 40％A+60％B 8 175～180min 95％A+5％B

实施例12(奥曲肽成盐、浓缩及冻干)

将实施例11得到的奥曲肽除TFA溶液1L，加入2mL冰醋酸，得到奥 曲肽醋酸盐溶液，在-0.1MPa、30℃条件下减压旋转浓缩除去溶液中的部分 乙腈，分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送入真 空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好的冻 干曲线进行冷冻干燥，经冷冻干燥得到醋酸奥曲肽冻干粉固体12.3g，按投 料40g奥曲肽粗品计算收率为30.8％，按实施例10的方法测定其HPLC纯 度为99.68％，保留时间为8.60min。采用waters micromass ZQ单重四级杆电 喷雾质谱(ESI-MS)测定其分子质量峰[M+1]⁺测定值1019.86，主要离子碎 片峰[M+2]²⁺测定值510.67，都符合理论值1019.26。按实施例6检测醋酸奥 曲肽冻干粉结果显示，醋酸含量为8.35％(质量百分比)，TFA含量为未检 出(检测限5μg/g)。