法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-03-02
授权
授权
2014-09-24
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K31/10 申请日:20140528
实质审查的生效
2014-08-27
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种化合物的新应用,特别涉及苯乙烯基-磺酰胺类化合物在制备抗HIV-1病毒药物中的应用。
背景技术
HIV-1病毒最初发现于1981年在美国发现,由一系列不明原因的,以细胞免疫缺陷为特征的综合征出现以后,研究人员开始了对其致病源的寻找。1983年法国研究小组从一淋巴肿大综合征病人的淋巴结中,分离出HIV-1病毒。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒,该病毒破坏人体的免疫力,导致免疫系统失去抵抗力,而导致各种疾病以及癌症得以在人体内生存,从而导致获得性免疫缺陷综合症——艾滋病。目前,由于对艾滋病教育的普及不充分,全球的HIV感染仍呈上升趋势,尤其在中国更是进入了快速增长期。尽快阻止艾滋病在我国的流行已成了一件刻不容缓的大事。因此,继续扩大我们对HIV-1致病机制的认识,开发出更有效,更经济,更少副作用的抗病毒药物以完全清除残余的HIV-1复制,以及开发出强有力而又长效的抗HIV-1的疫苗以保护易感人群,仍将是我们能否最终战胜艾滋病的关键。
具有如下通式的苯乙烯基-磺酰胺类化合物:
式中,R为H、甲基或乙基,位于苯环上1’~5’位中的任一个,-NO2位于苯环的1~3号位中的任一个,如(1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯,(E)-1-nitro-4-(styrylsulfonyl)benzene)可购自Enamine公司或在其基础上进行人工合成,目前没有报道该类化合物用于抗病毒实验或其他可能的功效。
发明内容
本发明的目的在于提供苯乙烯基-磺酰胺类化合物在制备抗HIV-1病毒药物中应用。
本发明所使用的苯乙烯基-磺酰胺类化合物具有如下通式:
式中,R为H、甲基或乙基,位于苯环上1’~5’位中的任一个,-NO2位于苯环的1~3号位中的任一个。
优选的,上述苯乙烯基-磺酰胺类化合物中的R为甲基或乙基,位于苯环上2’~4’位中的任一个。
优选的,上述苯乙烯基-磺酰胺类化合物中的R为H。
优选的,上述苯乙烯基-磺酰胺类化合物中的-NO2位于苯环的2号位。
优选的,上述苯乙烯基-磺酰胺类化合物中的R为H,-NO2位于苯环的2号位。
发明人基于Vif-APOBEC3G的相互作用,证实上述通式的苯乙烯基-磺酰胺类化合物,特别是证实1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯能够抑制Vif蛋白降解A3G的活性,导致筛选系统中绿色荧光蛋白的表达量将回升。通过在人的原代CD4+ T淋巴细胞以及H9、SupT 1等CD4+ T淋巴细胞系中进行野生型HIV-1病毒的感染实验证实,1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯具有较好的抗病毒作用,为进一步的抗病毒药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础,具有重要的研发价值和开发意义。
附图说明
图1: 细胞筛选模型的构建原理;
图2:1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯具有抑制Vif活性的作用;
图3:1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯在表达A3G蛋白的H9细胞和不表达A3G蛋白的SupT1细胞中抑制野生型HIV-1的复制效果;
图4:1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯在H9细胞中抑制野生型HIV-1的复制的IC50的滴定。
具体实施方式
Vif是HIV的必需蛋白之一,其主要功能是拮抗宿主中天然的抗病毒因子APOBEC3G。APOBEC3G是H IV-1病毒的一大威胁,它存在于HIV-1天然的宿主细胞(如CD4+ T细胞和巨噬细胞)中,能被包裹入HIV-1病毒颗粒,在HIV-1逆转录过程中发挥其极强的抗病毒作用。为此, HIV-1自身编码了Vif蛋白来特异性对抗APOBEC3G的抗病毒活性,它可将APOBEC3G导入泛素系统并将其降解(图1A)。因此,如何灭活Vif,是研发抗HIV-1病毒药物的一个十分重要的靶标。
根据Vif拮抗APOBEC3G的分子机理,筛选出若干可让HIV的Vif无法降解 APOBEC3G的小分子药物。为此我们将建立一种简便的活细胞筛选系统,如图1 B所示,将表达APOBEC3G-GFP融合蛋白和表达Vif的 质粒共转染到细胞中。以APOBEC3G-GFP融合蛋白是否被降解为指标。只要某种化合物在Vif存在的情况下还能使APOBEC3G-GFP融合蛋白不被降解(即GFP荧光还在),该化合物就是Vif的抑制剂。通过对Vif靶标的进一步鉴定,确认化合物是作用于宿主细胞还是作用在病毒蛋白的Vif上。
为了更好地理解本发明的实质,下面结合实验和结果来说明1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯在制备抗HIV-1病毒药物中应用。
实验一
1) 取生长良好的人肾上细胞株239t细胞,接种于96孔透明平底板中,每孔5×104细胞。使用的培养基是完全培养基:高糖DMEM,10%胎牛血清以及1%双抗,培养条件是5%二氧化碳、37℃;
2) 24h贴壁后,共转染PEGFP-A3G和pcDNA3.1-Vif两种质粒。转染采用脂质体包裹转染,试剂使用lipo2000,转染液20μl;
3) 转染4h后,加入待筛选的化合物,每孔2μl,终浓度为50μM;
4) 培养48h后,检测绿色荧光蛋白GFP的表达情况。如果出现绿色荧光蛋白GFP表达上升的情形,该化合物可能成为抗病毒候选药物。
实验结果如图2所示,从实验结果可以看出,1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯均具有抑制Vif活性的作用。
实验二
Vif蛋白在HIV-1病毒复制过程中具有重要作用,vif缺陷的HIV病毒不能在CD4+T细胞、巨噬细胞内复制,即不能在上述“非允许”细胞内复制;而含有vif基因的野生株病毒可在上述细胞内复制。Vif缺失株病毒进入某些靶细胞后可进行反转录,但不能合成前病毒DNA。研究显示HIV复制处决于一种细胞抑制因子的出现或缺失,这种内源性的抑制因子是APOBEC3G,它属于细胞内RNA编辑酶,能使mRNA中的胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶,导致G和A突变体的累积,进而是病毒DNA降解,vif通过与APOBEC3G结合形成复合物阻断APOBEC3G的抑制活性。在APOBEC3G存在的细胞系如H9细胞中,APOBEC3G与vif蛋白结合通过泛素化系统降解,如果化合物能够抑制APOBEC3G被vif蛋白降解,宿主细胞将不能够被HIV-1感染;而在APOBEC3G不存在的情细胞系如SupT1细胞中,HIV-1蛋白可以正常感染该宿主细胞;那么这个化合物将有可能成为抗HIV-1 Vif蛋白的化合物。
APOBEC3G是细胞的自我保护机制,但vif是HIV-1病毒对抗APOBEC3G功能的蛋白,导致HIV-1病毒逃避细胞内自我清除过程。利用HIV-1的允许细胞和不允许细胞中的抗病毒实验的效果比较,从而能进一步在野生型病毒实验中确定靶标化合物可以拮抗HIV-1的Vif蛋白,抑制HIV-1病毒的复制。
1) 取生长良好的淋巴细胞系H9和Supt 1,细胞用量为2×105/孔,分别感染包装好的HIV-1病毒上清,病毒用量为10ng/1×106细胞;(感染时使用促感染试剂polybrene);
2) 感染3h后换液,使用PBS清洗三次,弃上清,使用1640培养基(10%胎牛血清,1%双抗)培养,培养基每孔200μl,化合物每孔2μl(终浓度50μM);
3) 使用2%Triton X-100处理收样的上清,收培养了4day的细胞上清,测P24 Elisa。
实验结果如图3所示。从实验结果可以看出,1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯在H9细胞中具有良好的抗HIV-1病毒作用,而在SupT1细胞中没有效果。
实验三
1) 取生长良好的淋巴细胞系H9,细胞用量为2×105/孔,感染包装好的HIV-1病毒上清,病毒用量为10ng/1×106细胞;(感染时使用促感染试剂polybrene);
2) 感染3h后换液,使用PBS清洗三次,弃上清,使用1640培养基(10%胎牛血清,1%双抗)培养,培养基每孔200μl,加入化合物每孔2μl,终浓度分别为50μM,5μM,0.5μM,0.05μM,0.005μM,0.0005μM,0μM;
3) 使用2%Triton X-100处理收样的上清,收样4day,测P24 Elisa。
实验结果如图4所示。从实验结果可以看出,1-硝基-4-[(2-苯乙烯基)磺酰基]苯在H9细胞中的IC50为518nM,具有较好的抑制病毒的效果。
机译: 卤代核苷衍生物,用于抗腺病毒感染的这类化合物,该化合物在制备抗腺病毒感染的药物中的用途,含有该化合物的药物组合物和制备该化合物的方法
机译: 用于上皮伤口预防和治疗的药物组合物,免疫调节药物组合物,药物组合物,杀虫剂,杀虫剂组合物,凝集素KM +杀虫剂在瘢痕形成中的用途,凝集素KM +在制备免疫调节药物中的用途,凝集素KM +的用途在制备抗菌药物中,凝集素KM +在抗病毒药中的应用,凝集素KM +在抗真菌药中的应用,凝集素KM +在抗寄生虫药中的应用,表达方法,DNA载体,重组生物,核苷酸序列,抗体,蛋白质和核外基因
机译: 苯环糊精应用中具有β-肾上腺素阻断作用的药物的制备方法和适用于该方法的苯乙酮类化合物的制备方法。