用于生物和化学分析的集成式传感器阵列

摘要

本发明涉及一种集成式传感器阵列。所述集成式传感器阵列包含：在电路支持基底中形成的多个传感器，每个传感器包含化学场效应晶体管，所述传感器以大于100个传感器/mm2的密度存在于大于256个传感器的平面阵列中，阵列中的每个传感器设置成提供与其附近的化学或生物样品的浓度或存在相关的至少一个输出信号，对于阵列中的每个传感器而言，响应于相同化学或生物样品的相同浓度或存在，这种输出信号是基本上相同的。

说明书

本申请是申请日为2009年10月22、申请号为200980151407.1、发 明名称为“用于生物和化学分析的集成式传感器阵列”的专利申请的分案 申请。

相关申请

本申请在35U.S.C.§119(e)下要求分别在2008年10月22日、2008 年11月4日和2009年1月22日提交的美国临时申请61/196953、 61/198222、61/205626的优先权，并在35U.S.C.§120下要求2009年5 月29日提交的美国非临时申请12/474897和12/475311的优先权，它们的 所有内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开内容一般地涉及用于进行化学测量的半导体芯片，更具体地， 涉及用于监测一种或多种分析物的单芯片ISFET阵列(和单芯片ISFET 阵列的阵列)。

背景技术

生物和化学分析物的快速且准确的测量在许多领域中是重要的，所述 领域从诊断到工业过程控制、环境监测、科学研究。化学敏感的（特别是 离子敏感的）场效应晶体管(分别是“chemically-sensitive field effect  transistor,chemFET”和“ion-sensitive field effect transistor,ISFET”)已经 被用于这样的测量许多年，例如Bergveld,Sensors and Actuators,88: 1-20(2003);Yuqing等人,Biotechnology Advances,21:527-534(2003); 等。最近，已经尝试使用集成电路技术来制造这种传感器的阵列，以得到 使用单个装置进行的空间上分散的且多分析物的测量，例如，Yeow等人, Sensors and Actuators B44:434-440(1997);Martinoia等人,Biosensors  &Bioelectronics,16:1043-1050(2001);Milgrew等人,Sensors and  Actuators B103:37-42(2004);Milgrew等人,Sensors and Actuators B, 111-112:347-353(2005);Hizawa等人,Sensors and Actuators B,117: 509-515(2006);Heer等人,Biosensors and Bioelectronics,22:2546-2553 (2007);等。这样的努力面临几个困难的技术挑战，特别当ISFET传感器 阵列具有超过数千个传感器元件的规模和超过数百个传感器元件/mm²的 密度时。这样的挑战包括使用在该阵列内的传感器之间具有均一性能特征 的传感器元件制备大规模阵列，和用能产生信号的微米级足迹（footprint） 制备传感器元件，所述信号可在来自传感器阵列自身和流控系统（其将反 应物或含有分析物的样品运输至阵列）的许多噪声源的背景之上被检测 到。对于包含具有电荷敏感组件（诸如浮动栅（floating gate））之传感器 元件的ISFET阵列，前一个挑战由于俘获在这些组件中或其附近的电荷 的积累而恶化，所述积累是半导体制造技术的常见副产物。后一个挑战由 于下述要求恶化：即目标分析物直接地或间接地产生带电荷物质，所述物 质积累在ISFET传感器的电荷敏感组件处或之上。在非常密集的阵列中， 扩散、分析物或其代用物反应性、来自邻近传感器的交叉污染，以及样品 流体中的电噪声，都可以不利地影响测量。克服了这些挑战的大规模 ISFET阵列的可用性在上述领域将是非常有用的，特别是在需要非常高 度平行的多路化学测量的情况下，诸如在基因组的大规模遗传分析中。

发明内容

本发明的一些方面部分地涉及chemFET（或更具体地ISFET）的大 阵列，其用于监测反应（包括例如核酸(例如，DNA)测序反应），所述监 测基于监测在反应过程中存在、产生或使用的分析物。更一般地，包括 chemFET的大阵列在内的阵列可以用于检测和测量在众多化学和/或生物 学过程(例如，生物学或化学反应、细胞或组织培养或监测、神经活性、 核酸测序等)中多种分析物(例如，氢离子、其它离子、非离子分子或化合 物等)的静态和/或动态的量或浓度，其中基于这样的分析物测量可以得到 有价值的信息。这样的阵列可以用于检测分析物的方法中和/或用于通过 阵列中传感器表面处的电荷变化（通过带电荷的产物的直接积累，或通过 与目标分析物的浓度或存在有关的带电荷物质的间接产生或捕获）来监测 生物或化学过程的方法中。在许多实现方式和应用中例证了本发明，它们 中的一些总结在下面。

在一个方面，本发明涉及一种装置，其包含在电路支持基底中的化学 场效应晶体管阵列，这样的晶体管阵列已经在其表面上设置了样品保留区 的阵列，所述样品保留区能保留来自样品流体的化学或生物样品，其中这 样的晶体管阵列具有10μm或更小的间距，且每个样品保留区放置在至 少一个化学场效应晶体管上，所述化学场效应晶体管设置成产生至少一个 输出信号，所述信号与这样的样品保留区中的化学或生物样品的特征有 关。在一个实施方案中，所述化学或生物样品的特征是带电荷物质的浓度 或量，且其中每个所述化学场效应晶体管是离子敏感场效应晶体管，其具 有在其表面上含有电介质层的浮动栅，所述电介质层接触所述样品流体， 且能与所述样品流体中的带电荷物质的浓度成比例地积累电荷。在一个实 施方案中，这样的带电荷物质是氢离子，因而传感器测量其样品保留区中 或附近的样品流体的pH变化。在这样的实施方案的一个方面，所述电介 质层具有这样的厚度，其选择成使跨它的电容尽可能大，并符合其它要求。 可以在1至1000纳米(nm)的范围，或在10至500nm的范围，或在20 至100nm的范围，选择这样的厚度。在一个实施方案中，所述电介质层 包含金属氧化物。在一个实施方案中，所述金属氧化物选自：氧化铝、氧 化钽、氮化硅、氮氧化硅、五氧化二钽、氧化锡和二氧化锡。在一个实施 方案中，所述电介质层包含双层，所述双层由与所述样品流体流体接触的 电荷敏感层和设置在所述浮动栅上的粘附层组成，所述粘附层用于使所述 电荷敏感层结合至所述浮动栅。在一个实施方案中，所述电荷敏感层是氧 化钽，且所述粘附层是二氧化铝（aluminum dioxide）。在一个实施方案 中，所述样品保留区的所述阵列是在所述化学场效应晶体管阵列上形成的 且与其集成在一起的微孔阵列，所述阵列中的每个微孔具有包围微孔体积 的壁，且每个微孔体积能容纳所述化学或生物样品。在一个实施方案中， 所述微孔阵列被密封地与所述化学场效应晶体管阵列连接的流动池包围， 所述流动池设置成向所述微孔递送试剂，且所述流动池具有入口、出口， 并与所述阵列形成室，所述室限定所述试剂的流动通道，使得每个微孔与 所述室流体连通。在一个实施方案中，所述室设置成提供在每个所述微孔 处基本上相等的所述试剂的流速。在一个实施方案中，所述电路支持基底 另外包括控制电路，其与所述化学场效应晶体管阵列耦联，从而以至少1 帧/秒的速率接收来自所述化学场效应晶体管的所述输出信号的样值。

在另一个方面，本发明涉及一种集成传感器阵列，其包含多个形成在 电路支持基底中的传感器，每个传感器包含化学场效应晶体管，所述传感 器以大于100个传感器/mm²的密度存在于大于256个传感器的平面阵列 中，所述阵列的每个传感器设置成提供与其邻近的化学或生物样品的浓度 或存在有关的至少一个输出信号，对于阵列中的每个传感器而言，响应于 相同化学或生物样品的相同浓度或存在的这种输出信号是基本上相同的。 在该方面的一个实施方案中，所述集成传感器阵列另外包括在所述电路支 持基底中的多个样品保留区，每个样品保留区位于所述传感器中的至少一 个的上面(或在下面或在侧面)，且与所述传感器中的至少一个可操作地相 关联。在另一个实施方案中，这样的样品保留区各自是微孔，所述微孔设 置成容纳在样品流体体积内的样品。在另一个实施方案中，集成传感器阵 列的传感器检测或测量带电荷物质的浓度，且每个传感器是离子敏感场效 应晶体管，其具有在其表面上含有电介质层的浮动栅，所述电介质层接触 含有所述化学或生物样品的样品流体，且能与其邻近的样品流体中的带电 荷物质的浓度成比例地积累电荷。所述电介质层具有这样的厚度，其选择 成使跨它的电容尽可能大，并符合其它要求。

在另一个方面，本发明涉及一种单芯片化学测定装置，其包含：(a)在 电路支持基底中形成的传感器阵列，阵列中的每个传感器包含化学场效应 晶体管，且设置成提供与其邻近的化学或生物样品的浓度或存在有关的至 少一个输出信号，对于阵列中的每个传感器而言，响应于相同化学或生物 样品的相同浓度或存在，这种输出信号是基本上相同的；(b)在电路支持 基底中的多个样品保留区，每个样品保留区设置在至少一个传感器上；和 (c)在电路支持基底中的控制电路，其与传感器阵列耦联，以至少1帧 (frame)/秒的速率接收来自所述化学场效应晶体管的输出信号的样值 （sample）。在一个实施方案中，所述浓度包括带电荷物质的浓度，且其 中每个所述化学场效应晶体管是离子敏感场效应晶体管，所述离子敏感场 效应晶体管具有浮动栅，所述浮动栅在其表面上具有电介质层，所述电介 质层接触含有所述化学或生物样品的样品流体，且能与其附近的样品流体 中带电荷物质的浓度成比例地积累电荷。在一个实施方案中，所述电介质 层的厚度选择成使跨过它的电容尽可能大。在一个实施方案中，所述电介 质层的所述厚度包含金属氧化物，且为1至1000纳米。在一个实施方案 中，所述电介质层包含双层，所述双层由与所述样品流体流体接触的电荷 敏感层和设置在所述浮动栅上的粘附层组成，所述粘附层用于使所述电荷 敏感层结合至所述浮动栅。在一个实施方案中，所述电荷敏感层是氧化钽， 且所述粘附层是二氧化铝。在一个实施方案中，所述样品保留区的所述阵 列是在所述化学场效应晶体管阵列上形成的且与其集成在一起的微孔阵 列，所述阵列中的每个微孔具有包围微孔体积的壁，且每个微孔体积能容 纳所述化学或生物样品。

在另一个方面，本发明涉及一种单芯片核酸测定装置，其包含：(a)在 电路支持基底中形成的传感器阵列，阵列中的每个传感器包含化学场效应 晶体管，且设置成提供与其邻近的化学或生物样品的浓度或存在有关的至 少一个输出信号，对于阵列中的每个传感器而言，响应于相同化学或生物 样品的相同浓度或存在，这种输出信号是基本上相同的；(b)在电路支持 基底中的多个样品保留区，每个样品保留区设置在至少一个传感器上;(c) 设置在样品保留区上的支持物，包括诸如颗粒固体支持物等固体支持物， 每个支持物具有与其连接的串联化的模板；和(d)在电路支持基底中的控 制电路，其与传感器阵列耦联，以至少1帧/秒的速率接收来自所述化学 场效应晶体管的输出信号的样值。支持物可以包括珠子，包括具有实心或 多孔心和/或实体表面或多孔表面的珠子、微球、微粒、凝胶微滴和用于 连接DNA模板（特别是作为克隆群体）的其它可分离的颗粒支持物。这 样的支持物可以是微米或纳米级，取决于用途。例如，珠子可以是微米珠， 或它们可以是纳米珠。在一个实施方案中，所述浓度包括与所述串联的模 板的特征相关的带电荷物质的浓度，且其中每个所述化学场效应晶体管是 离子敏感场效应晶体管，所述离子敏感场效应晶体管具有浮动栅，所述浮 动栅在其表面上具有电介质层，所述电介质层接触含有所述化学或生物样 品的样品流体，且能与其附近的样品流体中带电荷物质的浓度成比例地积 累电荷。在一个实施方案中，所述电介质层的厚度选择成使跨过它的电容 尽可能大。在一个实施方案中，所述电介质层的所述厚度包含金属氧化物， 且是1至1000纳米。在一个实施方案中，所述样品保留区的阵列是在所 述化学场效应晶体管阵列上形成的且与其集成在一起的微孔阵列，所述阵 列中的每个微孔具有包围微孔体积的壁，且每个微孔体积能容纳所述颗粒 固体支持物。

在许多例证的实施方案和应用中解释了本发明的这些上面表征的方 面以及其它方面，它们中的一些显示在附图中，并在随后的权利要求书部 分中表征。但是，上面的概述无意描述每个例证的实施方案或本发明的每 个实现方式。

附图说明

在附图中，相似的附图标记通常表示在不同视图中的相同部分。另外， 附图不一定按照比例尺绘制，相反，重点在于一般地阐述本文讨论的不同 概念。

图1一般地解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，包含大规模 chemFET阵列的核酸处理系统。

图2解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，与图1所示的阵 列类似的chemFET阵列的一列。

图3显示了根据本公开内容的另一个发明实施方案，多个邻近像素 的复合横截面视图，它解释了像素制造的叠层(layer-by-layer)视图。

图4A-4L是在图3所示的传感器的制造中指定的对应材料层的模式 的顶视图。

图5A-5B解释了用于生产具有在传感器浮动栅上的薄电介质层的阵 列的工艺步骤，且电介质层包含电荷敏感层和粘附层。

图6是本发明的一个实施方案的电子组件的一个实施方案的框图。

图7是图6所示组件的一个示例性的时序图。

图8A是高水平的部分框图部分电路图，它显示了基础的无源传感器 像素，其中ISFET源和排出装置(drain)上的电压变化将噪声引入分析物， 造成感测值的误差。

图8B是高水平的部分框图部分电路图，它显示了基础的无源传感器 像素，其中ISFET排出装置上的电压变化通过将它接地而消除，通过列 缓冲器得到像素输出，且将CDS用于列缓冲器的输出，以减少相关噪声。

图8C是高水平的部分框图部分电路图，它显示了二晶体管无源传感 器像素，ISFET排出装置和源上的电压变化基本上被消除，通过缓冲器 得到像素输出，且将CDS用于列缓冲器的输出，以减少相关噪声。

图9是流动池的横截面视图。

图10A和B的图显示了来自ISFET装置的迹线(A)和来自23-mer 合成寡核苷酸的测序反应的核苷酸读出(B)。

图11A和B的图显示了来自ISFET装置的迹线(A)和来自25-mer PCR产物的测序反应的核苷酸读出(B)。

具体实施方式

尽管本发明适合于不同的修改和替代形式，借助于实施例已经在附图 中显示了其细节，并予以详细描述。但是，应当理解，本发明不将发明限 于所述的具体实施方案。相反，本发明意在覆盖落入本发明的精神和范围 内的所有修改方案、等同方案和替代方案。例如，为了解释的目的，装置 和阵列的微电子学部分以CMOS技术实现。但是，应当理解，公开内容 无意在这方面受到限制，因为其它基于半导体的技术可以用于实现本文讨 论的系统的微电子学部分的不同方面。关于制备本发明的阵列的指导，参 见许多可得到的关于集成电路设计和生产和微型机械加工 （micromachining）的参考文献和论文，包括、但不限于,Allen等人, CMOS Analog Circuit Design(Oxford University Press,第2版,2002); Levinson,Principles of Lithography,第2版(SPIE Press,2005);Doering 和Nishi编,Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology,第2 版(CRC Press,2007);Baker,CMOS Circuit Design,Layout,and  Simulation(IEEE Press,Wiley-Interscience,2008);Veendrick, Deep-Submicron CMOS ICs(Kluwer-Deventer,1998);Cao, Nanostructures&Nanomaterials(Imperial College Press,2004);等，它们 的相关部分通过引用并入本文。

在一个方面，本发明涉及化学敏感场效应晶体管(chemFET)的集成传 感器阵列(例如，二维阵列)，其中所述阵列的单个chemFET传感器元件 或“像素”设置成检测样品流体中的分析物存在(或缺失)、分析物水平(或量) 和/或分析物浓度。“样品流体”是指这样的流体，其用于递送样品或试剂 到样品保留区，或从样品保留区去除产物或反应物，诸如多步反应中的洗 涤流体。在阵列上发生的分析过程中，样品流体可以保持相同，或可以变 化。由本发明的阵列检测或监测的分析过程包括在阵列附近发生的化学和 /或生物过程(例如，化学反应、细胞培养、神经活性、核酸测序反应等)。 下面更详细地讨论的不同实施方案所预见到的chemFET的实施例包括但 不限于：离子敏感场效应晶体管(ion-sensitive field effect transistor,ISFET) 和酶敏感场效应晶体管(enzyme-sensitive field effect transistor,EnFET)。 在一个示例性实现方式中，将一个或多个微流体结构制造在chemFET传 感器阵列的上面，以提供生物或化学反应的保留、控制和/或限制，其中 可以捕获、产生或消耗（视情况而定）目标分析物。这样的结构在阵列上 界定了在本文中称作“样品保留区”的区域。例如，在一个实现方式中，所 述微流体结构可以设置成一个或多个“孔”(或微孔、或反应室、或反应孔， 这些术语在本文中互换使用)，所述孔设置在阵列的一个或多个传感器上 面，使其上面设置有给定孔的一个或多个传感器检测和测量给定孔中的分 析物存在、水平和/或浓度。优选地，孔和传感器的比例是1:1。

可以针对对多种分析物中的任意一种或多种的灵敏度，设置根据本公 开内容的不同发明实施方案的chemFET阵列。在一个实施方案中，可以 针对对一种或多种分析物的灵敏度，特别地设置阵列的一个或多个 chemFET，且在另一些实施方案中，可以针对对不同分析物的灵敏度， 设置给定阵列的不同的chemFET。例如，在一个实施方案中，阵列的一 个或多个传感器(像素)可以包括设置成对第一分析物敏感的第一类 chemFET，且阵列的一个或多个其它传感器可以包括设置成对不同于第 一分析物的第二分析物敏感的第二类chemFET。在一个实施方案中，第 一和第二分析物可以彼此相关。作为一个实例，第一和第二分析物可以是 相同生物或化学反应/过程的副产物，因此可以同时检测它们，以证实反 应的发生(或不发生)。这种冗余在某些分析物检测方法中是优选的。当然， 应当理解，超过2种不同类型的chemFET可以用于任意给定的阵列中， 以检测和/或测量不同类型的分析物，和任选地监测生物或化学过程，诸 如结合事件。一般而言，应当理解，在本文讨论的传感器阵列的任意实施 方案中，给出的传感器阵列可以是“均质的”，因此由基本上类似或相同类 型的检测和/或测量相同分析物(例如，pH或其它离子浓度)的chemFET 组成，或者传感器阵列可以是“异质的”，包括用于检测和/或测量不同分 析物的不同类型的chemFET。在另一个实施方案中，阵列中的传感器可 以设置成检测和/或测量单一类型(或种类)的分析物，尽管检测和/或测量 的物质的类型(或种类)在传感器之间可能不同。作为一个实例，阵列中的 所有传感器可以设置成检测和/或测量核酸，但是每个传感器检测和/或测 量不同的核酸。

如本文使用的，阵列是元件（诸如传感器或孔）的平面排列。阵列可 以是一维或二维的。一维阵列是这样的阵列，其具有在第一维的一列(或 行)元件和在第二维的多个列(或行)。一维阵列的实例是1x5阵列。二维 阵列是这样的阵列，其具有在第一维和第二维的多个列(或行)。在第一维 和第二维的列(或行)的数目可以相同或不同。二维阵列的实例是5x10阵 列。

因此，一个实施方案涉及这样的装置，其包含CMOS制造的传感器 的阵列，每个传感器包含一个化学敏感场效应晶体管(chemFET)，并占据 阵列表面上10μm²或更小、9μm²或更小、8μm²或更小、7μm²或更小、 6μm²或更小、5μm²或更小、4μm²或更小、3μm²或更小、或2μm²或 更小的面积。本发明的另一个实施方案涉及这样的装置，其包含CMOS- 制造的传感器的平面阵列，密度为至少100个传感器/mm²、或至少250 个传感器/mm²、或至少1000个传感器/mm²、或至少5000个传感器/mm²、 或至少10000个传感器/mm²。

另一个实施方案涉及这样的装置，其包含CMOS制造的传感器的阵 列，每个传感器包含一个化学敏感场效应晶体管(chemFET)。CMOS制造 的传感器的阵列包括超过256个传感器，且来自该阵列所有chemFET的 chemFET输出信号的集合构成一帧数据。该装置另外包含控制电路，该 电路与阵列耦联，并设置成产生至少一个阵列输出信号，以提供来自该阵 列的多帧数据，帧率为至少1帧/秒。在一个方面，帧率可以是至少10帧 /秒。在另一个方面，帧率可以是至少20帧/秒。在另一些方面，帧率可以 是至少30、40、50、70或多达100帧/秒。由传感器测得的化学或生物现 象可以产生电信号，通常是电流或电压水平变化，其具有多样的持续时间 和幅度。在有些实施方案中，这样的信号可以具有在几毫秒（例如10毫 秒）至几秒（例如10-20秒）范围的持续时间。对于阵列所监测的周期或 顺序进程，这样的信号可以几分钟、几小时或几天的间隔基本重复。此外， 所述信号可以具有重叠的不同类型的噪声，包括来自阵列自身的闪烁噪声 和热噪声（特别是来自样品流体）。装置的控制电路设置成从阵列的每个 传感器取样每个信号，用于一帧完整的数据。这样的取样可以持续短时间， 例如1-100微秒等，使得可以以上面列出的帧/秒值读出完整数据帧。

如下面更充分解释的，已经以减少所捕获电荷的影响的方式制造本发 明的阵列，所述影响包括相同阵列中的传感器对相同或类似感知条件的响 应在传感器之间缺乏稳定性和一致性。在一个实施方案中，通过将阵列的 传感器暴露于预定的pH变化，可以测量这样的响应。在一个实施方案中， 阵列中至少95%的传感器的响应在pH7-9的范围是基本上线性的，且具 有灵敏度为至少40mV/pH单位的电压输出信号。在另一个实施方案中， 阵列中至少98%的传感器具有这样的性能。“基本上线性的”是指，在这 样的pH范围测得的pH值偏离线性的变异系数为至少10%或至少5%或 至少2%。在另一个实施方案中，这样的阵列中至少95%的传感器各自具 有小于200毫秒的对pH变化的响应时间。

另一个实施方案涉及这样的传感器阵列，其包含多个电子传感器，它 们排列成多行和多列。每个传感器包含一个化学敏感场效应晶体管 (chemFET)，所述chemFET设置成提供至少一个、且在某些情况下提供 至少2个输出信号，所述输出信号代表阵列表面附近的分析物的存在和/ 或浓度。对于多个列中的每个列，所述阵列另外包含列电路，所述列电路 设置成为该列中的各个chemFET提供恒定的排出装置电流(drain current) 和恒定排出装置-源电压（drain-to-source voltage），所述列电路包括2个 运算放大器和与二极管连接的FET，其与各个chemFET排列成开尔文电 桥结构，以提供恒定的排出装置-源电压。

另一个实施方案涉及这样的传感器阵列，其包含多个电子传感器，它 们排列成多行和多列。每个传感器包含一个化学敏感场效应晶体管 (chemFET)，所述chemFET设置成提供至少一个输出信号、并在某些情 况下提供至少2个输出信号，所述信号代表在阵列表面附近的溶液中的离 子浓度。所述阵列另外包含至少一个行选择移位寄存器（以实现多个行中 的各个行）和至少一个列选择移位寄存器（以从多个列中的各个列获得 chemFET输出信号）。

本发明的装置和设备可以用于检测和/或监测不同实体之间的相互作 用。这些相互作用包括生物和化学反应，且可以包含酶反应和/或非酶相 互作用，诸如但不限于结合事件。作为一个实例，本发明预见到监测这样 的酶反应，其中底物和/或试剂被消耗，且/或产生反应中间体、副产物和/ 或产物。根据本发明可以监测的反应的一个实例是核酸合成方法，诸如会 提供关于核酸序列的信息的方法。将在本文中更详细地讨论该反应。

装置

本发明的装置可以广泛变化，取决于待测分析物、是否需要含有辅助 试剂的测定反应、和是否需要顺序的或循环的反应。在一个方面，本发明 的装置包含传感器阵列以及在其表面上的样品保留区阵列（用于保留由样 品流体递送给表面的生物或化学分析物）。在一个实施方案中，样品保留 区与传感器阵列集成在一起，且可以具有多种形式。这样的区域可以由传 感器阵列表面上的化学反应基团、连接到传感器阵列表面上的对预定的分 析物具有特异性的结合化合物、疏水性或亲水性区域、或空间构造（诸如 微孔、腔、堰、坝、槽等）来界定。在另一些实施方案中，本发明的装置 可以包含样品载体（诸如珠子、颗粒、凝胶微滴）或其它支持物、结构或 物质，它们容纳目标分析物，且可以通过样品流体递送至样品保留区。这 样的样品载体可以包括结合部分或反应基团，以允许连接至样品保留区。 这样的连接可以是特异性的，其中这样的结合部分或反应基团仅与互补性 结合化合物或官能团形成连接，或所述连接可以是随机的，其中样品载体 保留在阵列中任意样品保留区中的可能性基本相等。如下面更充分描述 的，在一个实施方案中，样品保留区是微孔阵列，所述微孔各自具有壁和 用于物理地保留样品、分析物和/或一种或多种样品载体的内部。

如下面例证的，样品流体和样品或分析物可以以几种方式递送至传感 器阵列的保留区。在传感器阵列被用作一次使用性（one-use）样品表征 装置的情况下，诸如用于过程、环境或细胞监测，可通过再现、吸量、倾 泻或通过其它直接方法来递送样品。在传感器阵列用于顺序的或循环的反 应中的情况下，诸如在DNA测序中，样品流体（包括核酸模板、试剂、 洗涤溶液等）可以在计算机控制下由流体系统递送。对于这后一种用途， 本发明的实施方案可以另外包括与样品保留区和传感器阵列集成在一起 的流动池。如下面更充分描述的，在一个实施方案中，这样的流动池将样 品流体(包括测定反应物、缓冲液等)在受控条件下递送至样品保留区，所 述条件可以包括层流、在每个样品保留区的恒定流速、受控的温度、气泡 或其它流动破坏的最小化等。在一个方面，本发明装置的流动池包含入口、 出口和内部空间，当所述流动池与样品保留区和传感器的阵列连通（例如 密封地结合）时，所述内部空间形成除了入口和出口以外均密闭的室。在 有些实施方案中，将所述装置生产成使得流动池和所述阵列之一或之二彼 此集成在一起。在另一些实施方案中，流动池密封地结合至阵列。任一种 实施方案都会防止流体泄漏，所述泄漏除了其它可能的危害以外，会将电 噪声引入样品流体。在一个方面，本发明的装置包括与样品流体进行流体 接触的参比电极，从而在操作期间，在参比电极和阵列传感器之间建立电 势差。

在图1中显示了一个示例性的装置，其适合核酸测序。在下面的讨论 中，为了说明作为针对对静态和/或动态离子浓度的灵敏度而构建的 ISFET，描述了阵列的chemFET传感器，所述离子浓度包括但不限于氢 离子浓度。但是，应当理解，本公开内容在这方面不受限制，且在本文讨 论的其中采用ISFET作为例证实施例的任意实施方案中，其它类型的 chemFET可以同样地用于替代性实施方案中，如下面进一步详细讨论的。 同样地，应当理解，本发明的不同方面和实施方案可以采用ISFET作为 传感器，而检测除了氢离子以外的一个或多个离子物质。

系统1000包括半导体/微流体杂合结构300，其包含ISFET传感器阵 列100和微流体流动池200。在一个方面，流动池200可以包含许多孔(在 图1中未显示)，所述孔设置在ISFET阵列100中对应的传感器的上面。 在另一个方面，将流动池200构建成利于对置于流动池中的一个或多个相 同模板核酸进行测序，所述测序通过向流动池受控地且有序地引入许多测 序试剂272(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP（在本文中通称为dNTP）、 二价阳离子诸如但不限于Mg²⁺、洗涤溶液等)来实现。

如图1所示，测序试剂向流动池200的引入可以通过一个或多个阀 270和一个或多个泵274来实现，所述阀门和泵由计算机260控制。许多 技术可以用于使不同的加工材料(即，溶液、样品、反应试剂、洗涤溶液 等)进入(即，引入)这种流动池的孔中。如图1所示，可以使包括dNTP的 试剂进入流动池(例如，通过计算机控制的阀270和泵274)，它们从流动 池扩散进孔中，或可以通过其它方式（诸如喷墨）将试剂加入流动池。在 另一个实施例中，流动池200可以不含有任何孔，可以利用试剂的扩散特 性来限制ISFET阵列100的各个传感器之间的串扰（cross-talk），或可 以将核酸固定化在ISFET阵列100的传感器的表面上。

可以以多种方式构建图1系统中的流动池200，以在ISFET阵列100 附近提供一种或多种分析物(或一种或多种反应溶液)。例如，模板核酸可 以直接连接或施加于传感器阵列100的一个或多个像素的适当附近，或在 位于传感器阵列上面但在反应室内的支持材料(例如，一个或多个“珠子”) 中或上，或在传感器表面自身上。加工试剂(例如，诸如聚合酶等酶)也 可以直接放置在传感器上，或在传感器附近的一种或多种固体支持物上 (例如，它们可以结合到捕获珠子或其它珠子上)，或它们可以是在溶液中， 并自由流动。应当理解，所述装置可以没有孔或珠子地使用。

在图1的系统1000中，根据一个实施方案，ISFET传感器阵列100 监测离子物质，具体地，监测包括氢离子在内的离子物质的水平/量和/或 浓度的变化。在一些重要的实施方案中，所述物质是源自核酸合成或测序 反应的那些。

通过阵列控制器250(也在计算机260的操作下)，可以控制ISFET阵 列，从而获取与分析物检测和/或测量有关的数据(例如，阵列的各个ISFET 的输出信号)，且收集的数据可以由计算机260处理，以产生与模板核酸 的加工(包括测序)有关的有意义信息。

关于图1所示的系统1000的ISFET阵列100，在一个实施方案中， 阵列100实现为使用标准CMOS工艺(例如，0.35微米工艺、0.18微米工 艺)设计和制造的集成电路，其包含监测/测量一种或多种分析物和/或反应 所需的所有传感器和电子器件。再次参考图1，要与ISFET阵列100一 起使用的一个或多个参比电极76可以放置在流动池200中(例如，置于流 动池的“未使用的”孔中)，或以其它方式暴露于参照物(例如，一种或多种 测序试剂172)，以建立基线，将阵列100的各个ISFET附近的分析物浓 度的变化与该基线相比较。参比电极76可以电耦联至阵列100、阵列控 制器250或直接电耦联至计算机260，以利于基于从阵列100得到的电压 信号进行的分析物测量；在某些实现方式中，参比电极可以耦联至电地线 或其它预定电势，或可以相对于地来测量参比电极电压，以建立ISFET 输出信号测量的电参照，如下面进一步讨论的。

更一般地，可以针对对多种分析物中的任意一种或多种的敏感性，构 建根据本公开内容的不同实施方案的chemFET阵列。在一个实施方案中， 可以针对对一种或多种分析物和/或一个或多个结合事件的敏感性，特别 地构建阵列的一个或多个chemFET，且在其它实施方案中，可以针对对 不同分析物的敏感性度，构建给定阵列的不同chemFET。例如，在一个 实施方案中，阵列的一个或多个传感器(像素)可以包括构建成对第一分析 物敏感的第一类chemFET，且阵列的一个或多个其它传感器可以包括构 建成对不同于第一分析物的第二分析物敏感的第二类chemFET。在一个 示例性实现方式中，第一和第二分析物都可以指示特定反应，例如在通过 合成测序的方法中的核苷酸掺入。当然，应当理解，超过2种不同类型的 chemFET可以用于任意给定的阵列中，以检测和/或测量不同类型的分析 物和/或其它反应。一般而言，应当理解，在本文讨论的传感器阵列的任 意实施方案中，给出的传感器阵列可以是“均质的”，且包括基本上类似或 相同类型的chemFET，以检测和/或测量相同类型的分析物(例如，氢离 子)，或传感器阵列可以是“异质的”，且包括不同类型的chemFET，以检 测和/或测量不同的分析物。

在图1所示系统的其它方面，一个或多个阵列控制器250可以用于操 作ISFET阵列100(例如，选择/实现阵列的各个像素，以获得代表分析物 测量的输出信号)。在不同的实现方式中，构成一个或多个阵列控制器的 一个或多个组件可以与阵列本身的像素元件一起实现，在相同的集成电路 (IC)芯片上作为阵列，但是在IC芯片的不同部分中或在芯片外（off-chip）。 关于阵列控制，ISFET输出信号的模数转换可以通过电路来实现，所述 电路在与ISFET阵列相同的集成电路芯片上实现，但是位于传感器阵列 区域之外(使模数转换电路位于传感器阵列区域之外，会允许更小的间距 并因此允许更大数目的传感器以及减少的噪声)。在下面进一步讨论的不 同示例性实现方式中，模数转换可以是4比特、8比特、12比特、16比 特或其它比特分辨率，这取决于需要的信号动态范围。

一般而言，可以连续地或平行地或其某种组合，从阵列取出数据。在 芯片上的（On-chip）控制器(或读出放大器)可以控制整个芯片或芯片的 某一部分。因而，根据用途的需要，可以在必要时复制芯片控制器或信号 放大器。所述阵列可以、但不一定是均匀的。例如，如果信号处理或某些 其它限制需要多个更小的阵列（而不是一个大阵列），则各个阵列具有它 自己的读出放大器或控制器逻辑，这是非常可行的。

已经提供了一种示例性系统1000的chemFET(例如，ISFET)阵列100 在测量一种或多种分析物中的作用的一般概述，下面是根据本公开内容的 不同发明实施方案的示例性chemFET阵列的更详细描述，所述阵列可以 用于多种用途。同样，为了解释目的，下面讨论了根据本公开内容的 chemFET阵列，其中使用ISFET阵列的具体实施例，但是其它类型的 chemFET可以用于替代实施方案中。同样，还是为了解释目的，在核酸 测序应用的背景下讨论了chemFET阵列，但是，本发明不限于此，而是 预见到本文所述的chemFET阵列的多种用途。

传感器布局和阵列制造

在Rothberg等人,美国专利公开2009/0026082和2009/0127589中， 描述了传感器布局设计和阵列制造的方法。具体地，公开了用于减少或消 除过程中捕获的电荷的技术；因此，这些参考文献通过引用并入本文。在 一个方面，所述传感器设计和信号读出电路可以用于本发明中。例如，在 图2所示的一个实施方案中，阵列的每个chemFET包含浮动栅结构，和 具有第一半导体类型的源和排出装置，并制造在具有第二半导体类型的区 域中，其中没有将具有第二半导体类型的区域与源或排出装置电连接的电 导体。每个传感器由3个场效应晶体管(FET)（包括chemFET）组成，且 每个传感器包括电连接该3个FET的多个电导体。3个FET排列成使得 多个电导体包括不超过4个穿越每个传感器占据的区域并将阵列中多个 传感器互连的导体。每个传感器中的所有FET都属于相同通道类型，并 在阵列基底的单个半导体区域中执行。来自阵列中所有chemFET的 chemFET输出信号的集合构成一帧数据。所述装置另外包含控制电路， 该电路与阵列耦联，并设置成产生至少一个阵列输出信号，以提供多个来 自该阵列的数据帧，帧率为至少20帧/秒。

作为微孔和传感器阵列的集成的一个实例，图3显示了邻近像素的 复合横截面视图，其解释了像素制造的叠层视图以及浮动栅和微孔的相对 位置。在横截面中显示了3个邻近的像素。像素105₁的所有FET组件都 制造成单个n-型孔154中的p-通道FET。另外，在图3的复合横截面视 图中，也可以看见高度掺杂的p-型区域159，其对应着MOSFET Q2和 Q3的共有的排出装置(D)。为了说明目的，在图3中也可以看见MOSFET  Q3的多晶硅栅166。但是，为了简洁，图2所示的MOSFET Q2和Q3 的各个源以及Q2的栅在图3中未显示，因为它们位于与共有的排出装置 沿相同的轴(即，垂直于该图的平面)排列。最顶部金属层304对应于ISFET 敏感区域178，在其上面设置着分析物敏感性的钝化层172。最顶部金属 层304以及ISFET多晶硅栅164和介入导体306、308、312、316、320、 326和338，形成ISFET浮动栅结构170。但是，与ISFET排出装置的 电连接由导体340、328和318提供，其偶联至线116₁上，所述线116₁形 成在金属2层中，而不是在金属3层中。另外，在图3中也将线112₁和 114₁显示为形成在金属2层中，而不是在金属3层中。从图4A至4L的 各个图像，可以进一步理解这些线以及线118₁的结构；具体地，在图4F 中可以看出，线118₁以及金属导体322形成在金属1层中，且可以看出， 线112₁、114₁和116₁形成在金属2层中，仅将浮动栅结构170的跨接线 308保留在图4J所示的金属3层中。

因此，通过将信号线112₁、114₁、116₁和118₁连接至金属1和金属2 层，并从而增加这些信号线与金属4层中浮动栅结构170的最顶层304之 间的距离，可以至少部分地减少ISFET的寄生电容。应当理解，该一般 概念(例如，在信号线和浮动栅结构的最顶层之间包括一个或多个介入金 属层)可以在包含更大数目的金属层的其它制造工艺中实现。例如，通过 增加额外金属层(超过4个总金属层)，可以增加像素信号线和最顶部金属 层之间的距离，其中在额外金属层中仅形成与最顶部金属层的跨接线。具 体地，可以采用6金属层制造工艺，其中使用金属1和金属2层制造信号 线，浮动栅结构的最顶部金属层形成在金属6层中，且与最顶部金属层的 跨接线分别形成在金属3、金属4和金属5层中(在金属层之间具有有关的 通道（via）)。

在关于降低的电容的另一个方面，可以减少最顶部金属层304(并因 而减少ISFET敏感区域178)的尺寸“f”，从而减少邻近像素之间的交叉电 容。从图4可以看出(且如下面关于涉及在ISFET阵列上面制造孔的其它 实施方案进一步讨论的)，可以制造孔725，以使其具有锥形形状，使得在 孔顶部的尺寸“g”小于像素间距“e”，但是仍然大于孔底部的尺寸“f”。基 于这种锥形，也可以将最顶部金属层304设计成具有尺寸“f”，而不是尺 寸“g”，从而提供邻近像素的顶部金属层之间的额外空间。在一些例证性 的非限制性实现方式中，对于具有9微米左右的尺寸“e”的像素，尺寸“f” 可以是6微米左右(相对于上面讨论的7微米)，且对于具有5微米左右的 尺寸“e”的像素，尺寸“f”可以是3.5微米左右。

使用由氮化硅(Si₃N₄)、氮氧化硅(Si₂N₂O)、氧化硅(SiO₂)、氧化铝 (Al₂O₃)、五氧化钽(Ta₂O₅)、氧化锡或二氧化锡(SnO₂)等制成的钝化层， 可以进行通过本发明测定的氢离子和其它分析物的检测。

当将电介质层加到ISFET传感器排列的浮动栅结构上面时，从分析 物到ISFET栅的通道可以建模为3个电容的串联：(1)可归因于上述在分 析物-电介质层界面处的电荷双层的电容(标记的C_DL)、(2)由浮动栅电介 质层产生的电容(C_FGD)、和(3)栅氧化物电容(C_OX)。(应当指出，在上面的 文本中，浮动栅电介质层有时称作“钝化”层。在这里，我们更具体地将该 层称作浮动栅电介质层，以便避免下述任何暗示：该层的材料组成必然地 与经常用于CMOS加工(例如，PECVD氮化硅)中，用于包被和保护电路 元件)的所谓钝化材料有关。串联电容串在孔的液体分析物和ISFET栅之 间延伸。

众所周知，串联的电容形成电容性分压器。结果，仅一部分由分析物 产生或在分析物中产生的信号电压V_S被施加于栅氧化物，作为驱动 ISFET的电压V_G。如果将栅增益定义为V_G/V_S，可能理想地具有单位增 益–即，跨3个电容中的任一个没有信号损失。C_DL值是材料特性的函 数，且通常是在约10–40μF/cm²的量级。通过对比，栅氧化物电容通常 是非常小的值。因而，通过使C_FGD远远大于C_OX和C_DL的串联组合(简写 为C_FGD>>C_OX)，可以使栅增益在实践中尽可能地接近均一。

为了达到关系C_FGD>>C_OX，可以使C_OX尽可能小，使C_FGD尽可能 大，或二者兼有。通过使用高介电常数材料的薄层，或通过增加浮动栅金 属化的面积，可以实现C_FGD的最大化。电容C_FGD主要由平行的板电容器 形成，所述板电容器具有浮动栅电介质层作为它的电介质。结果，对于给 定的板(即，浮动栅金属化)面积，原则上可用于增加C_FGD值的参数是：(1) 电介质层的厚度，和(2)电介质材料的选择，以及它的介电常数。浮动栅 电介质层的电容随着它的介电常数而直接地变化，且随着它的厚度相反地 变化。因而，薄的高介电常数层是优选的，以满足获得最大栅增益的目的。

浮动栅电介质层材料的一种候选物是标准的CMOS铸造工艺所使用 的钝化材料。标准的(通常，PECVD氮化物，或更精确地，在氮氧化硅上 面的氮化硅)钝化层在形成时相对较厚(例如，约1.3μm)，且典型的钝化 材料具有有限的介电常数。通过在形成后减薄钝化层，可以实现第一种改 善。这可以如下实现：蚀刻回CMOS钝化层，诸如通过在微孔形成过程 中使用过度蚀刻步骤，以蚀刻进和消耗大量氮化物钝化层，留下更薄的层， 诸如仅约200-600埃厚度的层。

2个方案已经用于蚀刻在氮氧化硅上面沉积的氮化硅的标准CMOS 钝化层。第一个方案称作“部分蚀刻（partial etch）”技术；它包括蚀刻掉 氮化硅层和大约一半氮氧化硅层，然后沉积薄膜金属氧化物感测层。第二 个方案称作“蚀刻至金属（etch-to-metal）”技术，其包括蚀刻掉所有氮化 硅和氮氧化硅层，然后沉积薄膜金属氧化物感测层。由于ALD Ta₂O₅薄 膜感测层沉积在“部分蚀刻”上面，根据经验已经获得约0.37至约0.43的 ISFET增益，传感器灵敏度为约15.02–17.08mV/pH。

一个替代方案是，在第一个位置简单地沉积更薄的电介质(钝化)材料 层，诸如标出的200–600埃，而不是常规CMOS钝化工艺的1.3μm。 可用于浮动栅电介质层的材料是金属氧化物，诸如氧化钽、氧化钨、氧化 铝和氧化铪，但也可替换为介电常数大于常见的氮化硅钝化材料的其它材 料，条件是这样的材料是对目标离子敏感的，或可以被赋予该敏感性。蚀 刻至金属方案是优选的，其中在沉积浮动栅电介质材料层之前，CMOS 工艺的在浮动栅上的钝化氧化物被完全蚀刻掉。该电介质层可以直接地施 加于金属扩展的ISFET浮动栅电极上。这将有助于使电容C_FGD的值最大 化。图5A和5B显示了使用可容易地得到的制造技术来生产电介质层的 步骤，所述电介质层高电容耦合至阵列传感器平板。工艺步骤另外提供了 对结合垫（bondpad）结构的电接近（electrical access），用于芯片外 （off-chip）通信。首先，处理来自半导体生产商的晶片(500)，以施加用 于形成微孔的材料层(502)(在本实施例中，TEOS)，然后通过蚀刻至传感 器板(504)的金属来形成微孔。添加电介质层(506)，例如，通过原子层沉 积。在一个实施方案中，如图5B所示，电介质层(506)包含电荷敏感层(512) 和粘附层(514)。使用替代技术和单组分或多组分的材料，可以形成电介 质层。氧化钽和铝是电介质层(506)的示例性的电荷敏感的和粘附层。如 上所述，可以形成电介质层(506)的其它材料包括Ta₂O₅、Al₂O₃、HfO₃或 WO₃。具体地，这些材料响应于样品流体中的pH变化而产生更大的信号。 还可以使用氧化铱，例如如在下述文献中所述：D.O.Wipf等人, “Microscopic Measurement of pH with Iridium Oxide Microelectrodes,” Anal.Chem.2000,72,4921-4927，和Y.J.Kim等人,“Configuration for  Micro pH Sensor,”Electronics Letters,Vol.39,No.21(2003年10月16日)。

芯片控制和读出电路

多种在芯片上的结构和电路设计可以用于获取和处理由本发明的阵 列中的传感器产生的输出信号。在Rothberg等人,美国专利公开 2009/0026082和2009/0127589中，公开了几个方案，它们可以与本发明 的阵列一起使用。例如，图6说明了根据本公开内容的一个发明实施方案， 与阵列控制器250耦联的传感器阵列100的方框图。在不同示例性实现方 式中，阵列控制器250可以制造成“独立式（stand alone）”控制器，或制 造成构成计算机260的一部分的一个或多个计算机兼容“卡”。在一个方 面，阵列控制器250的功能可以由计算机260通过界面块252(例如，串 行接口、通过USB口或PCI总线、以太网连接等)来控制。在一个实施方 案中，将阵列控制器250的全部或部分制造成一个或多个印刷电路板，且 将阵列100构建成插入印刷电路板之一中，类似于常规IC芯片(例如，将 阵列100构建为ASIC，其插入印制电路板的芯片插槽，诸如零插入力的 或“ZIF”插槽)。在这种实施方案的一个方面，构建为ASIC的阵列100可 以包括一个或多个针/末端连接，其专门提供识别码，其可以被阵列控制 器250访问/读取，和/或传递至计算机260。这样的识别码可以代表阵列 100的不同属性(例如，尺寸，像素的数目，输出信号的数目，不同运行参 数诸如供应和/或偏压电压等)，且可以被处理，以确定由阵列控制器250 提供的相应运行模式、参数和/或信号，以确保许多不同类型的阵列100 中的任一个的适当运行。在一个示例性实现中，可以给构建成ASIC的阵 列100提供3个针（专用于识别码），且在制造过程中，可以编码ASIC， 以提供在这3个针的每一个处的3种可能的电压状态之一(即，三态的针 编码方案)，从而由阵列控制器250读取，由此提供27个独特的阵列识别 码。在该实施方案的另一个方面，可以实现阵列控制器250的全部或部分， 作为场可编程的门阵列(FPGA)，其构建成执行不同的阵列控制器功能， 如下面更详细地描述的。

通常，阵列控制器250会为阵列100提供不同的供给电压和偏压电压、 以及与行和列选择有关的不同信号、像素输出的取样和数据获取。具体地， 阵列控制器250读出一个或多个模拟输出信号(例如，Vout1和Vout2)， 包括来自阵列100的多路的各个像素电压信号，然后数字化这些各个像素 信号，以将测量数据提供给计算机260，后者又可以储存和/或处理数据。 在某些实现方式中，阵列控制器250也可以设置成执行或促进不同的阵 列校准和诊断功能。阵列控制器250通常会给阵列100提供模拟供给电压 和地线(VDDA、VSSA)、数字供给电压和地线(VDDD、VSSD)和缓冲器 输出供给电压和地线(VDDO、VSSO)。在一个示例性实现中方式，供给 电压VDDA、VDDD和VDDO中的每一个是大约3.3伏特。在另一个实 现方式中，供给电压VDDA、VDDD和VDDO可以低至大约1.8伏特。 如上面所讨论的，在一个方面，这些电源供给电压中的每一个通过单独的 传导途径提供给阵列100，以促进噪声分离。在另一个方面，这些供给电 压可以源自各个电源供给/调节器，或这些供给电压中的一个或多个可以 源自阵列控制器250的电源供给258中的共同来源。电源供给258也可 以提供阵列运行所需的不同偏压电压(例如，VB1、VB2、VB3、VB4、VBO0、 V_主体)和用于阵列诊断和校准的参照电压VREF。

在另一个方面，电源供给258包括一个或多个可以由计算机260控制 的数模转换器(DAC)，以允许偏压电压、参照电压和供给电压中的任一个 或全部在软件控制下变化(即，可编程的偏压设置)。例如，响应于计算机 控制(例如，通过软件执行)的电源供给258可以促进供给电压中的一个或 多个的调节(例如，在3.3伏特和1.8伏特之间切换，取决于由识别码表示 的芯片类型)和/或偏压电压VB1和VB2（对于像素排出电流）、VB3（对 于列总线驱动）、VB4（对于列放大器带宽）和VBO0（对于列输出缓冲 器电流驱动）中的一个或多个的调节。在某些方面，可以调节一个或多个 偏压电压，以优化来自所实现像素的信号的稳定时间。另外，在任选的制 造后紫外线照射处理期间，可以使阵列的所有ISFET的共同主体电压V 主体接地，以减少捕获的电荷，然后在阵列的诊断分析、校准和正常运行（用 于测量/数据获取）期间耦联至更高的电压(例如，VDDA)。同样地，可以 改变参照电压VREF，以促进多种诊断和校准功能。

如图6所示，通常与要通过阵列100测量的分析物溶液一起使用的参 比电极76可以耦联至电源供给258，以提供像素输出电压的参考电势。 例如，在一个实现方式中，可以将参比电极76耦联至供应地线(例如，模 拟地线VSSA)，以提供像素输出电压的参照。在其它示例性实现方式中， 可以如下设定参比电极电压：通过将具有已知pH水平的目标溶液/样品放 置在传感器阵列100附近，并调节参比电极电压，直到阵列输出信号Vout1 和Vout2提供希望的参照水平的像素电压，以后的像素电压从该水平的变 化会反映相对于已知参照pH水平的局部pH变化。一般而言，应当理解， 与参比电极76有关的电压不一定必须与上面讨论的参照电压VREF(其 可以用于多种阵列诊断和校准功能)相同，尽管在某些实现中，由电源供 给258提供的参照电压VREF可以用于设定参比电极76的电压。

关于来自阵列100的数据获取，在一个实施方案中，图6的阵列控制 器250可以包括一个或多个前置放大器253，以进一步缓冲一个或多个来 自传感器阵列的输出信号(例如，Vout1和Vout2)，并提供可选择的增益。 在一个方面，阵列控制器250可以包括用于每个输出信号的一个前置放大 器(例如，针对2个模拟输出信号的2个前置放大器)。在另一些方面，前 置放大器可以设置成接收0.0-1.8伏特或0.0-3.3伏特的输入电压，可以具 有可编程的/计算机可选择的增益(例如，1、2、5、10和20)和低噪声输出 (例如，<10nV/sqrtHz)，且可以提供低通滤波(例如，5MHz和25MHz 的带宽)。关于噪声减少和增加信噪比，在将阵列100构建成放入印制电 路板（其含有阵列控制器250的全部或部分）的芯片插槽中的ASIC的实 现方式中，滤波电容器可以设置在芯片插槽附近(例如，ZIF插槽的下侧)， 以促进噪声减少。在另一个方面，前置放大器可以具有输入和/或输出电 压信号的可编程的/计算机可选择的偏移距(offset)，以设定至希望的范围 的标称水平。

图6的阵列控制器250也包含一个或多个模数转换器254(ADC)，以 将传感器阵列输出信号Vout1和Vout2转换成数字输出(例如，10比特 或12比特)，从而将数据提供给计算机260。在一个方面，可以为传感器 阵列的每个模拟输出采用一个ADC，且每个ADC可以耦联至对应的前置 放大器的输出(如果在给定实现中采用前置放大器)。在另一个方面，ADC 可以具有计算机可选择的输入范围(例如，50mV、200mV、500mV、1V)， 以促进与不同范围的阵列输出信号和/或前置放大器参数的兼容性。在另 一些方面，ADC的带宽可以大于60MHz，且数据获取/转换速率大于25 MHz(例如，高达100MHz或更大)。

在图6的实施方案中，ADC采集时机以及阵列行和列选择可以由定 时发生器256控制。具体地，定时发生器会提供数字垂直数据和时钟信号 (DV、CV)（以控制行选择）、数字水平数据和时钟信号(DH、CH)（以 控制列选择）和列取样和保持信号COL SH（以取样实现的行的各个像素 电压）。定时发生器256也为ADC254提供取样时钟信号CS，从而适当 地对给定阵列模拟输出信号(例如，Vout1和Vout2)的数据流中的连续像 素值进行采样和数字化，如下面关于图7进一步讨论的。在某些实现方式 中，定时发生器256可以通过微处理器执行代码来实现，并构建为多通道 数字模式发生器，以提供适当定时的控制信号。在一个示例性实现方式中， 定时发生器256可以作为场可编程的门阵列(FPGA)来实现。

图7说明了不同阵列控制信号的一种示例性的定时简图，所述信号由 定时发生器256提供，以获取来自传感器阵列100的像素数据。为了下面 讨论的目的，将“帧”定义为包括阵列中每个像素的值(例如，像素输出信 号或电压VS)的数据集，并将“帧率”定义为可以从阵列获取连续帧的速率。 因而，帧率基本上对应着阵列中每个像素的“像素取样速率”，因为以该帧 率得到任意给定像素的数据。

在图7的实例中，选择20帧/秒的示例性帧率来说明阵列的运行(即， 行和列选择和信号获取)；但是，应当理解，根据本公开内容的阵列和阵 列控制器在这方面不受限制，因为不同的帧率（包括更低的帧率(例如，1 -10帧/秒)或更高的帧率(例如，25、30、40、50、60、70-100帧/秒等)） 以及具有相同或更高像素数的阵列是可能的。在某些示例性应用中，可以 在几秒中获取数据集，其包括许多帧，以进行给定一种或多种分析物的实 验。几个这样的实验可以连续进行，在某些情况下，其间有暂停，以允许 数据转移/处理和/或洗涤传感器阵列ASIC和准备后续实验的试剂。

例如，关于检测核苷酸掺入的方法，可以选择适当的帧率，以充分对 ISFET的输出信号采样。在一些示例性实现方式中，氢离子信号可以具 有大约1秒至大约2.5秒量级的半数最大值全宽度(full-width at  half-maximum,FWHM)，这取决于核苷酸掺入事件的数目。给出这些示 例值后，20Hz的帧率(或像素取样速率)足以可靠地分辨给定像素的输出 信号形式的信号。另外，在该实例中给出的帧率主要为了说明目的而提供， 且在其它实现中可能涉及不同的帧率。

在一个实现方式中，阵列控制器250控制阵列100来连续实现行，每 次一个。例如，通过行选择信号RowSel₁实现第一行像素。使实现的像素稳 定一段时间，然后，简短地发出（assert）COL SH信号，以关闭每列中 的样品/保持开关，并通过该列的第一个像素将电压值输出存储在该列的 样品/保持电容器C_sh上。该电压然后可用作列输出电压V_COLj，其施加于 2个(奇数和偶数列)阵列输出驱动器198₁和198₂之一(例如，参见图16)。 然后撤销（de-assert）COL SH信号，由此打开每列中的样品/保持开关， 并从列放大器107A和107B中将列输出缓冲器111j去耦联。此后不久， 通过行选择信号RowSel₂实现第二行像素。在使第二行像素稳定的时间段 期间，产生列选择信号，每次2个(一个奇数和一个偶数；奇数列选择信 号连续施加于奇数输出驱动器，偶数列选择信号连续施加于偶数输出驱动 器)，以读出与第一行有关的列输出电压。这样，在实现并稳定阵列中的 给定行的同时，读出前一行，每次2列。通过交错进行行选择和取样/读 出(例如，通过不同的垂直和水平时钟信号和列取样/保持)，和通过一次读 出给定行的多个列，可以以基本流线化的方式从阵列获取数据帧。

图7说明了20帧/秒的示例性帧率的前述过程的定时细节。在512x 512阵列中，每行必须在大约98微秒内读出，如图7中的垂直描绘所指 示的。因此，垂直时钟信号CV具有98微秒的时间段(即，超过10kHz 的时钟频率)，在CV信号的后缘(负跃迁)上实现新行。图7的左侧反映了 新帧周期的开始，在该时间点，在CV信号的第一个后缘之前发出垂直数 据信号DV，并在CV信号的下一个后缘之前撤销。另外，在紧邻CV信 号的每个后缘(即，实现的新行)之前，发出COL SH信号2微秒，在 CV信号的后缘之前剩下大约50纳秒。

在图7中，COL SH信号的第一次出现实际上是取样512x512阵列 的行512的像素值。因而，在CV信号的第一个后缘上，实现第一行，并 允许稳定(大约96微秒)直到COL SH信号第二次出现。在第一行的该稳 定时间期间，通过列选择信号读出行512的像素值。因为同时产生2个列 选择信号来读出512列，水平时钟信号CH必须在该时期内产生256个周 期，CH信号的每个后缘产生一个奇数和一个偶数列选择信号。如图7所 示，给定行的CH信号的第一个后缘在选择行后2微秒定时发生(在COL SH信号关闭后)，以允许存储在取样/保留电容器C_sh上并由列输出缓冲器 提供的电压值稳定。但是，应当理解，在其它实现方式中，在CH信号的 第一个后缘和COL SH信号的后缘(即，失活)之间的时间段可以显著小于 2微秒，且在某些情况下，小至刚超过50纳秒。也对于每行，在CH信 号的第一个后缘之前发出水平数据信号DH，并在CH信号的下一个后缘 之前撤销。在COL SH信号出现之前，选择最后2列，如上面所讨论的， 所述出现发生在实现下一行之前大约2微秒。因而，在上面的实施例中， 在大约94微秒的时间段内，读出列，每次2个(即，每行98微秒，减去 在每行开始和结尾处的2微秒)。这导致每个阵列输出信号Vout1和Vout2 的大约2.7MHz的数据速率。

被阵列的每个列中的传感器引入样品流体中的噪声可能存在于传感 器的输出信号中。当选择阵列中的一行时，列中的所有ISFET之间共有 的排出装置端电压向上或向下移动(作为源和排出装置输出器的必要要 求)。这改变列中所有未选择的ISFET的栅-排出装置电容。电容的该变化 又将每个未选择的ISFET的栅偶联进流体中，最终将它自身表现为流体 中的噪声(即，错误电荷，它不是由于监测的化学反应)。也就是说，共有 的排出装置端电压的任意变化可以视作列中每一个未选择的ISFET向流 体中注入的噪声。因此，如果在选择阵列的行时，未选择的ISFET的共 有的排出装置端电压可以保持恒定，则可以减少或甚至有效地消除这种将 噪声偶联进流体中的机制。当选择阵列的行时，列中所有未选择的ISFET 的源端电压也变化。这又改变列中所有这些ISFET的栅-源电容。这种电 容变化将每个未选择的ISFET的栅偶联进流体，再次最终将它自身显示 为流体的噪声。也就是说，列中未选择的ISFET的源端电压的任意变化 可以视作向流体中的噪声注入。因此，如果在选择阵列的行时，未选择的 ISFET的源端电压可以保持，则可以减少或甚至有效地消除这种将噪声 偶联进流体中的机制。

可以与一些无源像素设计一起使用列缓冲器，以减轻ISFET排出装 置问题，但不减轻ISFET源问题。因而，列缓冲器最可能对上述的源-排 出装置输出器是优选的。使用所示的采用源和排出装置输出器排列的3 晶体管无源像素，存在基本上2个感测节点，ISFET源和排出装置末端。 通过把像素连接至列缓冲器和将ISFET的排出装置末端接地，将存在仅 一个感测节点：ISFET源末端。所以消除了排出装置问题。

上述读出电路（其包含取样和保持模块和多路器模块）也具有小于单 位理想值的增益。此外，取样和保持模块构成总芯片噪声的重要百分比， 可能超过25%。从开关电容器理论，取样和保持“kT/C”噪声与电容成反 比。因此，通过选择更大的电容器，可以减小取样和保持噪声。减小噪声 的另一个方案是采用关联的双重抽样(CDS)，其中使用第二个取样和保 持和差分电路来抵偿相关噪声。在下面更详细地讨论该方案。

关联的双重抽样(Correlated Double Sampling,CDS)是用于测量诸如 电压或电流等电值的已知技术，其允许去除不希望的偏离。测量传感器的 输出2次：一次是在已知的条件下，一次是在未知的条件下。然后从未知 条件减去从已知条件测得的值，以产生与待测物理量具有已知关系的值。 这里的挑战是，如何有效地实现CDS以及如何解决相关噪声和使向分析 物流体中的噪声注入最小化。

起点是传感器像素和它的读出配置，如在本申请的前面部分中所表达 的。参考图8A，基础的无源传感器像素77A1是ISFET77A2和一对连接 ISFET源的行选择晶体管77A3和77A4的3晶体管排列。晶体管77A3 又连接电流源或汇点（sink）77A5。通过晶体管77A4得到读出，所述晶 体管77A4连接读出放大器77A6的输入。与另一个放大器77A8串联的 与二极管连接的晶体管77A7在来自读出放大器输出的反馈回路中连接至 ISFET的排出装置。由取样和保持电路77A9（其连接至输出放大器 77A10）捕获读出放大器输出。

如上面讨论的，在ISFET源和排出装置上的电压变化将噪声注入分 析物中，造成感测值的误差。2个结构性修改可以可感知地减少噪声水平， 如图8B所示。

第一个变化是，改变ISFET上的信号。消除与ISFET的排出装置的 反馈回路，并将排出装置连接至稳定电压，诸如地。将列缓冲器77B连 接至晶体管的发射极。

第二个变化是，在列缓冲器的输出上包括执行CDS的电路。如上所 述，CDS需要第一个参照值。这如下得到：在时钟的第一个或基准相位 （标为“SH”相位），通过开关77B2，将列缓冲器77B1的输入连接至参照 电压。组合的CDS和取样和保持电路然后对列缓冲器的输出进行双重采 样，得到参照样品和感测值，执行减法，并提供得到的减小了噪声的输出 值，因为相同的相关噪声出现在参照样品中和传感器输出中。

CDS和取样和保持电路的操作是笔直的。电路按照二相时钟操作， 第一个相位是SH相位，第二个相位是SHb相位。通常，所述相位是对 称的，因而彼此成倒值（inverted value）。在SH相位得到参照样品，并 将电荷(并由此将电压)放在电容器Cin上，当时钟相位变化时，其从列 缓冲器的输出中减去。

一个替代实施方案（仍然具有无源传感器像素）如图8C所示。该实 施方案中的传感器像素是包含ISFET的二晶体管电路，所述ISFET的排 出装置连接至固定的供给电压VSSA。没有与77A4相当的晶体管，相反， 像素输出取自晶体管77A3的发射极。CDS以及取样和保持电路已经通过 消除反馈回路而被稍微简化，但是它提供相同的功能：与在电容器Cbl 上储存电荷(电压)相关地，从传感器像素供给的信号减去电容器Cin上的 参照值。

微孔阵列

如别处所讨论的，对于许多应用，诸如在DNA测序中，希望在半导 体传感器阵列上面提供对应的微孔阵列，每个微孔足够小，优选地仅容纳 一个载有DNA的珠子，与之相关联的阵列中下面的像素将提供对应的输 出信号。

这样的微孔阵列的使用包含3个制造和准备阶段，各自分别予以讨 论：(1)建立微孔阵列以产生芯片，所述芯片具有包含微孔阵列层的涂层； (2)将有涂层的芯片固定在流体界面上；且在DNA测序的情况下，(3)将 载有DNA的珠子装载进孔中。当然，应当理解，在其它用途中，珠子可 能是不必要的，或可以采用具有不同特征的珠子。

本文所述的系统可以包括微流体反应室的阵列，所述反应室集成了包 含chemFET阵列的半导体。在有些实施方案中，本发明包括这种阵列。 所述反应室例如可以形成在玻璃、电介质、可用可光界定或蚀刻的材料中。 玻璃材料可以是二氧化硅。

本发明的不同方面或实施方案涉及这样的装置，其包含chemFET传 感器阵列，该阵列上面覆盖了反应室阵列，其中反应室的底部接触(或电 容地偶联至)chemFET传感器。在有些实施方案中，每个反应室底部接触 chemFET传感器，优选地接触单独的chemFET传感器。在有些实施方 案中，不是所有的反应室底部都接触chemFET传感器。在有些实施方案 中，阵列中的每个传感器接触反应室。在另一些实施方案中，不是所有的 传感器都接触反应室。传感器(和/或反应室)阵列可以包含2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、60、80、90、100、200、300、 400、500、1000、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或更多个chemFET传感器(和 /或反应室)。作为一个实例，本文使用的包含256个传感器或反应室的阵 列意图将含有256个或更多个(即，至少256)传感器或反应室。本文所述 的“包含”元件和/或步骤的方面和实施方案也旨在充分支持和包括由这样 的元件和/或步骤组成、或基本上由这样的元件和/或步骤组成的方面和实 施方案。

本发明的不同方面和实施方案涉及在阵列内的传感器(和/或反应室)， 它们彼此间隔下述的中心至中心距离或间隔(或“间距”，作为在本文中互 换使用的术语)：1-50微米、1-40微米、1-30微米、1-20微米、1-10微米、 或5-10微米（包括等于或小于约9微米、或等于或小于约5.1微米）、或 1-5微米（包括等于或小于约2.8微米）。反应室阵列中的邻近反应室之间 的中心至中心距离可以是约1-9微米、或约2-9微米、或约1微米、约2 微米、约3微米、约4微米、约5微米、约6微米、约7微米、约8微米、 或约9微米。

在有些实施方案中，所述反应室具有等于或小于约1皮升(pL)的体 积，包括小于0.5pL、小于0.1pL、小于0.05pL、小于0.01pL、小于0.005 pL。

所述反应室可以具有方形横截面，例如在它们的底部或底面。实例包 括8μm x8μm横截面、4μm x4μm横截面或1.5μm x1.5μm横截面。 或者，它们可以具有矩形横截面，例如在它们的底部或底面。实例包括8 μm x12μm横截面、4μm x6μm横截面或1.5μm x2.25μm横截面。

在另一个示例性实施方案中，本发明包括这样的系统，其包含反应室 的至少一个二维阵列，其中每个反应室偶联至化学敏感场效应晶体管 (“chemFET”)，且每个反应室的体积不大于10μm³(即，1pL)。优选地， 每个反应室的体积不大于0.34pL，更优选不大于0.096pL，或甚至0.012 pL。反应室在顶部的横截面面积可以任选地是2²、3²、4²、5²、6²、7²、 8²、9²或10²平方微米。优选地，所述阵列具有至少10²、10³、10⁴、10⁵、 10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或更多个反应室。反应室可以电容地偶联至chemFET， 且优选地，电容地偶联至chemFET。这样的系统可以用于高通量核酸测 序。

在有些实施方案中，反应室阵列(或等效地，微孔阵列)包含10²、10³、 10⁴、10⁵、10⁶或10⁷个微孔或反应室。在有些实施方案中，反应室阵列中 的单个反应室接触或电容地偶联至至少一个chemFET。在一个实施方案 中，阵列的反应室接触或电容地偶联至一个chemFET或一个ISFET。在 有些实施方案中，chemFET阵列可以任选地包含10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶或10⁷个chemFET。

在这些和在其它的方面和实施方案中，chemFET或ISFET阵列可以 包含256或更多个chemFET或ISFET。这些阵列的chemFET或ISFET 可以具有1-10微米的中心至中心间隔(在邻近的chemFET或ISFET之 间)。在有些实施方案中，所述中心至中心间隔是约9微米、约8微米、 约7微米、约6微米、约5微米、约4微米、约3微米、约2微米或约1 微米。在具体实施方案中，所述中心至中心间隔是约5.1微米或约2.8微 米。

在有些实施方案中，珠子是在反应室中，且任选地，仅珠子在反应室 中。在有些实施方案中，反应室接触或电容地偶联至ISFET。在有些实 施方案中，ISFET是在ISFET阵列中。在有些实施方案中，珠子具有小 于6微米、小于3微米或约1微米的直径。珠子可以具有约1微米至约7 微米、或约1微米至约3微米的直径。

在有些实施方案中，反应室具有约1微米至约10微米的中心至中心 距离。在有些实施方案中，反应室阵列包含10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶或 10⁷个反应室。

根据本发明，ISFET的栅的电介质层是ISFET的一部分。认识到， 反应室中的电荷积累在电介质的一侧，并形成电容器的一个极板(plate)， 且其具有浮动栅金属层作为它的第二个极板；因而，反应室被称作“电容 地偶联至ISFET”。

在有些实施方案中，ISFET是在ISFET阵列中。ISFET阵列可以包 含10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶或10⁷个ISFET。

在有些实施方案中，模板核酸是在接触或电容地偶联至ISFET的反 应室中。在有些实施方案中，反应室是在反应室阵列中。在有些实施方案 中，反应室阵列包含10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶或10⁷个反应室。

微孔的尺寸在阵列之间可以不同。可以用宽度(或直径)与高度之比的 方式描述这些微孔的尺寸。在有些实施方案中，该比值是1:1至1:1.5。 珠子与孔尺寸(例如，珠子直径与孔宽度、直径或高度)之比优选在0.6-0.8 的范围。

可以用横截面的方式描述微孔尺寸。横截面可以称作与孔深度(或高 度)平行的“切面”，或它可以是与孔深度(或高度)垂直的切面。微孔的横 截面可以是正方形，但是它们不限于此。微孔底部的尺寸(即，在垂直于 孔深度的横截面)可以是1.5μm x1.5μm，或它可以是1.5μm x2μm。合 适的直径包括、但不限于，在或约100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、 75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、 30μm、25μm、20μm、15μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、 4μm、3μm、2μm、1μm或更小。在某些具体实施方案中，直径可以是 在或约44μm、32μm、8μm、4μm或1.5μm。合适的高度包括、但不 限于，在或约100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、 65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、 20μm、15μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、 2μm、1μm或更小。在某些具体实施方案中，高度可以是在或约55μm、 48μm、32μm、12μm、8μm、6μm、4μm、2.25μm、1.5μm或更小。 本发明的不同实施方案预见到这些直径中的任一个与这些高度中任一个 的组合。在其它实施方案中，反应孔尺寸可以是(直径μm x高度μm)44x 55、32x32、32x48、8x8、8x12、4x4、4x6、1.5x1.5或1.5x2.25。

反应孔体积可以随孔尺寸而变化(在阵列之间，且优选不是在单个阵 列内)。该体积可以是在或约100皮升(pL)、90、80、70、60、50、40、 30、20、10或更小的pL。在一些重要的实施方案中，孔体积小于1pL， 包括等于或小于0.5pL、等于或小于0.1pL、等于或小于0.05pL、等于 或小于0.01pL、等于或小于0.005pL或者等于或小于0.001pL。体积可 以是0.001-0.9pL、0.001-0.5pL、0.001-0.1pL、0.001-0.05pL或0.005 -0.05pL。在具体实施方案中，孔体积是75pL、34pL、23pL、0.54pL、 0.36pL、0.07pL、0.045pL、0.0024pL或0.004pL。在有些实施方案中， 每个反应室具有不大于约0.39pL的体积和约49μm²表面孔，且更优选地 具有不大于约16μm²的孔和不大于约0.064pL的体积。

因而，应当理解，本发明的不同方面和实施方案一般地涉及大规模 FET阵列，其用于测量一种或多种分析物，或用于测量结合到chemFET 表面上的电荷。应当理解，chemFET和更具体地ISFET可以用于检测分 析物和/或电荷。上面讨论的ISFET是为离子检测（诸如氢离子(或质子) 检测）设置的一种具体的chemFET类型。本公开内容预见到的其它 chemFET类型包括酶FET(EnFET)，其采用酶来检测分析物。但是，应 当理解，本公开内容不限于ISFET和EnFET，而是更一般地涉及为某类 化学敏感性设置的任意FET。本文使用的化学敏感性广义地包括对任意 目标分子的敏感性，该目标分子包括但不限于：有机的、无机的、天然存 在的、非天然存在的、化学和生物化合物，诸如离子、小分子、聚合物诸 如核酸、蛋白、肽、多糖等。

在有些实施方案中，本发明包括这样的测序装置，其包含叠加在 chemFET上面的电介质层，所述电介质层具有在chemFET上面的偏心 凹陷。优选地，所述电介质层由二氧化硅制成。

在形成显示的半导体结构以后，将微孔结构施加于裸片（die）上。 也就是说，可以在裸片上形成微孔结构，或可以单独形成，然后固定到裸 片上，任一个方案都是可接受的。为了在裸片上形成微孔结构，可以使用 多种方法。例如，整个裸片可以旋转涂覆例如负性光刻胶，诸如Microchem 的SU-82015或正性阻蚀胶（resist）/聚酰亚胺诸如HD Microsystems  HD8820，以达到希望的微孔高度。通过在一个或多个层中以预定速率(这 可以通过参考文献和生产商手册来找到，或根据经验)旋涂适当的阻蚀胶， 可以达到在光刻胶层中的希望的孔高度(例如，在每孔一个像素的实例中， 约4-12μm，尽管通常不限于此)。(通常可以根据传感器像素的侧面尺寸 来选择孔高度，优选标称的1:1–1.5:1长宽比、高度:宽度或直径。基于 信噪比考虑，在尺寸和达到希望的性能水平所需的数据取样速率之间存在 相关性。因而，在选择给定用途的最佳参数时，存在许多因素)。或者， 可以施加多层不同的光刻胶，或可以沉积另一种形式的电介质材料。不同 类型的化学气相沉积也可以用于构筑适合在其中形成微孔的材料层。

一旦光刻胶层(单数形式“层”也用于包括聚集体中的多层)就位，通过 将掩蔽物(例如，铬的)放置在涂有阻蚀胶的裸片上，并将所述阻蚀胶暴露 于交联(通常是紫外线)辐射，可以产生单个孔(通常排布成每孔具有一个或 4个ISFET传感器)。暴露于辐射(即，当掩蔽物不阻断辐射时)的所有阻 蚀胶变得交联，且作为结果，将形成结合在芯片(裸片)的表面上的永久塑 料层。通过在诸如丙二醇甲基乙基醋酸酯(PGMEA)等合适溶剂(即，显影 剂)或其它适当溶剂中洗涤芯片，去除未反应的阻蚀胶(即，在未暴露的区 域中的阻蚀胶，由于掩蔽物阻断光到达阻蚀胶并阻止交联)。得到的结构 界定了微孔阵列的壁。

例如，可以采用不同分辨率的接触刻制和不同的蚀刻剂和显影剂。有 机和无机材料都可以用作在其中形成微孔的层。所述层可以在芯片上蚀 刻，所述芯片在传感器阵列中的像素结构上面具有电介质层，诸如钝化层， 或者所述层可以单独形成，然后施加于传感器阵列上面。具体选择或方法 将取决于诸如阵列尺寸、孔尺寸、可利用的制造设备、可接受的成本等因 素。

可以在某些实施方案中用于形成微孔层的不同有机材料中有上述的 SU-8型负作用光刻胶、常规的正作用光刻胶和正作用可光界定的聚酰亚 胺等。它们各自具有熟悉光刻领域的技术人员熟知的优点和缺点。

自然，在生产环境中，改进是适当的。

接触刻制具有它的局限性，且它可能不是制备最高密度孔的首选制备 方法，也就是说，它可能在侧面方向产生比希望的更高的最小间距限度。 其它技术，诸如深层紫外线分步重复（deep-UV step-and-repeat）方法， 能提供更高分辨率刻制，且可以用于产生小间距和可能更小的孔直径。当 然，对于不同的希望的规格(例如，每个芯片中传感器和孔的数目)，不同 技术可能证实是最佳的。且实际因素，诸如生产商可利用的制造工艺，可 能促进特定制造方法的使用。尽管讨论了新颖的方法，但本发明的不同方 面不限于这些新颖方法的使用。

优选地，在最终的金属化过程之后，使含有ISFET阵列的CMOS晶 片平面化。在氮化硅钝化之前的化学机械电介质平面化是合适的。这将允 许在非常平的表面上进行以后的刻制步骤，所述表面不含有后段CMOS 形貌。

通过利用深层紫外线分步重复刻制系统，可产生具有优良分辨率、重 合度（registration）和重复性的小构造。但是，这些系统的高分辨率和大 数值孔径(NA)使它们不具有大的焦点深度。这样，当使用这样的制造系统 时，可能必须使用更薄的可光界定的旋涂（spin-on）层(即，1-2μm量级 的阻蚀胶，而不是在接触刻制中使用的更厚的层)以进行图案转移，然后 在底层蚀刻微孔构造。高分辨率刻制然后可以用于制作微孔构造，且可以 使用常规的SiO2蚀刻化学法——结合垫区域各一个，然后是微孔区域— —具有选择性蚀刻停止；然后可以分别在铝结合垫和氮化硅钝化(等)上进 行蚀刻停止。或者，可以采用其它合适的替代图案转移和蚀刻工艺，以提 供无机材料的微孔。

另一个方案是在有机材料中形成微孔结构。例如，可以采用双阻蚀胶 （dual-resist）“软膜”工艺，由此在更厚的有机材料(例如，固化的聚酰 亚胺或相反作用阻蚀胶)上面使用薄的高分辨率深层紫外线阻蚀胶。顶部 阻蚀胶层被图案化。使用氧等离子体活性离子蚀刻工艺，可以转移图案。 该工艺次序有时称作“便携型掩蔽”(portable comformable mask,PCM) 技术。参见B.J.Lin等人,“Practicing the Novolac deep-UV portable  conformable masking technique”,Journal of Vacuum Science and  Technology19,No.4,1313-1319(1981);和A.Cooper等人,“Optimization  of a photosensitive spin-on dielectric process for copper inductor coil and  interconnect protection in RF SoC devices.”。

或者，可以采用“钻探-聚焦（drill-focusing）”技术，由此在不同的焦 点深度处进行几个连续的分步重复暴露，以补偿高分辨率行进机器 （stepper）的有限焦点深度(DOF)（在图案化厚阻蚀胶层时）。该技术依 赖于行进机器NA和DOF以及阻蚀胶材料的反差性质。

因而，可以通过能提供必要的厚度(例如，约4–10um)的任意高长宽 比（high aspect ratio）光可界定的或可蚀刻的薄膜工艺制造微孔。被认为 合适的材料有光敏感的聚合物、沉积的二氧化硅、非光敏感的聚合物，它 们可以使用例如等离子体蚀刻工艺等来蚀刻。在二氧化硅家族中，TEOS 和硅烷氧化亚氮(SILOX)看来是合适的。最终结构是相似的，但是不同材 料存在不同的表面组成，其可能造成目标生物学或化学发生不同的反应。

当形成微孔层时，可能必须提供蚀刻停止层，使得蚀刻工艺不会进行 到超过希望的深度。例如，可以存在要保留的底层，诸如低-K电介质。 蚀刻停止材料应当根据用途来选择。SiC和SiN材料可能是合适的，但是 这不意味着表示不可以采用其它材料。这些蚀刻停止材料也可以用于增强 驱动ISFET传感器灵敏度的表面化学，通过选择蚀刻停止材料来具有适 当的零电荷点(PZC)。除了二氧化硅和氮化硅以外，多种金属氧化物可能 是合适的。

不同金属氧化物的PZC可以在不同的教科书中找到，诸如J.Fierro 的“Metal Oxides–Chemistry and Applications”。我们已经获知，Ta₂O₅可以比Al₂O₃更优选地用于蚀刻停止，因为Al₂O₃的PZC刚好在使用的 pH(即，约8.8)处，且因此，刚好在零电荷点。另外，Ta₂O₅具有更高的 pH敏感性(即，mV/pH)，这是传感器性能的另一种重要因素。优化这些 参数可能需要恰当地选择钝化表面材料。

使用薄金属氧化物材料用于该目的(即，作为蚀刻停止层)是困难的， 因为它们实际上如此薄地沉积(通常200-500A)。微孔制造后金属氧化物沉 积技术可能允许在高长宽比微孔底部设置适当的PZC金属氧化物膜。

(a)反应性地溅射的氧化钽、(b)非反应性的化学计算的氧化钽、(c)氧 化钨或(d)氧化钒的电子束沉积可以证实具有优良的“向下入孔 （down-in-well）”覆盖，这是由于沉积过程的优良方向性。

阵列通常包含至少100个微流体孔，每个孔偶联至一个或多个 chemFET传感器。优选地，所述孔形成在玻璃(例如，SiO₂)、聚合材料、 可光界定（photodefinable）的材料或反应性离子可蚀刻的薄膜材料中的 至少一种中。优选地，所述孔具有小于约1:1的宽高比。优选地，所述传 感器是场效应晶体管，且更优选chemFET。chemFET可以任选地偶联至 PPi受体。优选地，每个chemFET占据10²微米或更小的阵列面积。

在有些实施方案中，本发明包括这样的测序装置，其包含半导体晶片 装置，后者偶联至电介质层诸如玻璃(例如，SiO₂)、聚合的、可光界定的 或反应性的可离子蚀刻的材料，在其中形成反应室。典型地，玻璃、电介 质、聚合的、可光界定的或反应性离子可蚀刻的材料与半导体晶片层集成 在一起。在某些情况下，玻璃、聚合的、可光界定的或反应性离子可蚀刻 的层是非结晶的。在某些情况下，玻璃可以是SiO₂。所述装置可以任选 地另外包含合适材料的流体递送模块，该合适材料诸如聚合材料，优选可 注塑的材料。更优选地，聚合层是聚碳酸酯。

在有些实施方案中，本发明包括制备测序装置的方法，所述方法包括： 使用光刻，在位于晶体管阵列上面的玻璃、电介质、可光界定的或反应性 离子可蚀刻的材料中产生孔。

当使用CMOS或类似的制造工艺用于阵列制造时，另一个替代方案 是，使用CMOS材料直接地形成微孔。也就是说，形成ISFET阵列的浮 动栅的CMOS顶部金属化层通常用约1.3μm厚的钝化层进行包被。通过 蚀刻掉钝化材料，可以形成1.3μm深的微孔。例如，可以形成具有1:1 长宽比的微孔，深度为1.3μm，在它们顶部的宽度是1.3μm。建模表明， 随着孔尺寸减小，实际上DNA浓度增加，因此SNR增加。所以，在其 它因素相同的情况下，这样小的孔可以证实是理想的。

流动池和流控系统

根据用途，使用传感器阵列的完整系统包括合适的流体源、阀门和控 制器（用于操作阀门使试剂和洗涤液流过微阵列或传感器阵列上）。这些 元件可从现成的（off-the-shelf）组件容易地装配，且可以容易地对控制 器进行编程使其执行希望的实验。

应当理解，在chemFET处的读出可以是电流或电压(及其变化)，且 对任一种读出的任何具体提及只是为了简单起见，而无意排除其它读出。 因此，在下文中对在chemFET处电流或电压检测的任何提及，应当理解 为预见到且也同样适用于其它读出。在一些重要的实施方案中，读出反映 了分析物浓度的快速、瞬时的变化。可以在不同时间检测超过一种分析物 的浓度。在某些情况下，这样的测量与着眼于稳态浓度测量的方法不同。

使用与微孔阵列相组合的芯片上的传感器阵列的组件来测序样品中 的DNA，这一过程被称作“实验”。进行实验需要向孔中装入结合有DNA 的珠子，并使几种不同的流体溶液(即，试剂和洗液)从孔中流过。需要 与流体界面偶联的流体递送系统(例如，阀门、导管、压力源等)，其以受 控的均匀流动使不同溶液流过孔，具有可接受的小死体积和前后溶液之间 的小交叉污染。理想情况下，与芯片(有时称作“流动池”)的流体界面会 造成流体同时到达所有微孔。为了使阵列速度最大化，必须使阵列输出尽 可能同时得到。这种理想情况显然是不可能的，但是希望使引入不同孔中 的流体的到达时间的差别或偏差尽可能小，从而使来自阵列的所有信号的 总体采集速度最大化。

许多结构的流动池设计是可能的；因而，本文提供的系统和方法不依 赖于特定流动池结构的使用。尽管希望合适的流动池基本上符合下述目标 集合：

·具有适于与流体递送系统互连的连接，例如，通过适当尺寸的管道；

·在孔上面具有适当的顶部空间；

·使流体遇到的死体积最小化；

·使死体积（dead volume）最小化(以使交叉污染最小化)，所述死体积接 触流体，但是不被会流过流动池的洗液快速地清洗干净；

·设置成在阵列上实现一致的流体运输时间；

·在孔上面的流动中产生或扩散的气泡尽可能少；

·适于将可取出的参比电极置于流动室中或离流动室尽可能近；

·易于装入珠子；

·能够以可接受的成本制备；和

·容于装配和连接到芯片包。

尽可能地满足这些标准，会积极地促进系统性能。例如，使气泡尽可 能小少重要的，以使来自阵列的信号真实地指示孔中的反应，而不是假噪 声。

将讨论几个实例设计中的每一个，它们以不同方式和程度满足这些标 准。在每个实例中，通常可以选择以两种方式之一实现设计：通过把流动 池连接至框架，并将框架粘合(或以其它方式连接)到芯片上，或通过将框 架集成在流动池结构中，并将该一体式组件连接到芯片上。此外，通过将 参比电极集成进排列中的方式，可以将设计分类。根据设计，可以将参比 电极集成进流动池中(例如，形成流动室的顶板的一部分)或在流动通道中 (通常在传感器阵列之后，在流动通道的出口或下游侧)。

在图9中，显示了整合有这样的流体界面的合适的实验装置3410的 一个实例，下面更详细地讨论了其制造和设置。所述装置包含半导体芯片 3412(通常标出，尽管被隐藏)（在其上面或在其中形成孔和传感器的阵列） 和流体组件3414（其在芯片上面，并将样品递送给芯片用于读取）。流体 组件包括部件3416（用于引入含有样品的流体）、部件3418（用于允许流 体被导出）和流动室部件3420（用于允许流体从入口流到出口，并沿着 通道与孔中的材料相互作用）。这3个部件被包含玻璃载玻片3422(例如， Erie Microarray目录号C22-5128-M20，来自Erie Scientific Company, Portsmouth,NH，其被切成3部分，每部分的尺寸是约25mm x25mm) 的界面一体化。

在玻璃载玻片的上表面固定着2个配件3424和3426，诸如纳米口配 件（nanoport fitting）Part#N-333，其来自Upchurch Scientific of Oak  Harbor,WA。一个口(例如，3424)用作递送来自泵/阀系统（在下面描述， 但是在这里未显示）的液体的入口。第二个口(例如，3426)是将液体导向 废物的出口。每个口连接导管3428、3432，诸如适当内径的柔性管道。 将纳米口安装成使得管道可以穿透对应的孔进入玻璃载玻片。管孔应当与 载玻片下表面齐平。

在玻璃载玻片底面，流动室3420可以包含不同的结构，用于促进穿 过微孔阵列的显著层流。例如，使用正性光刻胶（诸如SU-8光刻胶，其 来自Newton,MA的MicroChem Corp.），通过接触刻制，可以制作一 系列微流体通道，它们从入口管向流动室边缘散开。在下面将讨论其它结 构。

芯片3412又安装在载体3430上，用于包装和与连接插针（connector  pins）3432连接。

为了许多原因，希望实现均匀的流前线并消除有问题的流动通道区 域。一个原因是，对于许多用途、尤其基因测序而言，希望流体界面在系 统的流动池内非常快速的通行。换言之，进入流体必须在短时间段内彻底 替换以前的流体。在流动池内不均匀的流体速率和扩散、以及有问题的流 动通道可以与该需要相竞争。穿过矩形横截面导管的简单流可以在流动体 积中心附近的区域至邻近侧壁的区域中表现出显著不一致的流体速率，一 个侧壁是微孔层的顶部表面和孔中的流体。这种不一致导致在2种行进流 体之间的在空间上和时间上的大浓度梯度。此外，气泡可能在停滞区域（如 流动池内部尖锐的角）停留或产生。(表面能(亲水或疏水)可以显著影响气 泡保留。如果模塑的表面太疏水，则应当考虑在加工过程中避免表面污染， 并使用表面处理来建立更亲水的表面)。当然，流动室的物理排列可能是 最影响流动前线可达到的均匀程度的因素。

在所有情况下，在试剂周期之间，应注意确保整个流动室以及微孔的 彻底洗涤。流动扰动可能加重充分清洁流动室的挑战。

流动扰动也可能诱发或增加流体中的气泡。气泡可能阻止流体到达微 孔，或延迟它引入微孔，在微孔读出中引入误差，或使来自该微孔的输出 在处理来自阵列的输出时无用。因而，应当小心地选择流动扰动元件的结 构和尺寸，以控制这些潜在的不利因素。例如，可能在扰动元件的高度和 希望的速度谱变化之间做出折衷。

如别处所述的流动池可以由许多不同的材料制成。注塑的聚碳酸酯看 来非常合适。使用粘合层(例如，铬)，可以将传导性的金属(例如，金)沉 积在流动池顶部的下侧(流动室顶板)。优选地，将适当的低温薄膜沉积技 术用于金属参比电极的沉积，这是由于在流体池底侧处(即，ISFET阵列 的框架周围)的材料(例如，聚碳酸酯)和大分步覆盖形貌。一种可能的方案 是，使用行星系统中的电子束蒸发。

在完成装配后——传导性的环氧树脂(例如，Epo-Tek H20E或类似 的)可以对准流动池分配在密封环上，放置，压紧，并固化——ISFET 流动池准备好运行，将参考电势施加于该包的指定针。

在有些实施方案中，本发明包括用于检测pH的装置，其包含层流体 流动系统。优选地，所述装置用于对阵列中存在的多个核酸模板进行测序。

所述装置通常包括这样的流体组件，其包含含有一个或多个孔的部 件，所述孔用于非机械地引导流体流过至少100K(10万)、500K(50万) 或1M(100万)个微流体反应室的阵列，使得流体同时或基本上同时到达 所有微流体反应室。典型地，流体流平行于传感器表面。典型地，组件具 有小于1000、500、200、100、50、20或10的雷诺数。优选地，所述部 件另外包含第一孔（用于将流体导向传感器阵列）和第二孔（用于将流体 导离传感器阵列）。

在有些实施方案中，本发明包括将流体导向传感器阵列的方法，所述 方法包括：提供流体组件，其包含孔，所述孔将流体源流体偶联至传感器 阵列，并非机械地将流体导向传感器阵列。“非机械地”是指，流体在来自 气体压力源（而不是机械泵）的压力下移动。

在有些实施方案中，本发明包括孔阵列，每个孔偶联至具有入口和出 口的盖子，和流体递送系统（用于非机械地从所述入口和出口递送和去除 流体）。

在有些实施方案中，本发明包括使用上述装置测序生物聚合物（诸如 核酸）的方法，所述方法包括：将包含单体的流体导向反应室阵列，其中 所述流体具有最大2000、1000、200、100、50或20的流体流动雷诺数。 所述方法可以任选地另外包含，检测来自每个所述反应室的pH或pH变 化。这通常通过向传感器表面的离子扩散来检测。存在提供流体组件的多 种其它方式，所述流体组件用于递送经过微孔和传感器阵列组件的适当的 流体流，且前述实例因而无意是穷尽性的。

基于pH的核酸测序

本发明的装置可适于检测由于核苷酸掺入而释放出的氢离子，该检测 方法在Rothberg等人,美国专利公开2009/0026082和2009/0127589中公 开为DNA测序方法。在这些和不同的其它方面，重要的是，尽可能多的 检测释放出的氢离子，以便达到尽可能高的信号(和/或信噪比)。用于增加 最终被chemFET表面检测到的释放出的质子数的策略包括但不限于，用 孔中的反应基团限制所释放质子的相互作用，选择对质子相对惰性的材料 用于生产孔（在第一种情况下），防止释放的质子在chemFET处检测之 前脱离孔，和增加每个孔中的模板拷贝数(以便放大来自每个核苷酸掺入 的信号)，以及其它。

在一个方面，本发明提供了具有减小的缓冲容量的阵列和设备，其用 于更准确地监测和/或测量氢离子变化(或pH变化)。作为一个实例，本 发明提供了这样的仪器和设备，其用于在没有缓冲容量或缓冲容量有限的 环境下监测聚合酶延伸反应中的pH变化。缓冲减小的环境的实例包括： 在样品流体和/或反应混合物中缺少pH缓冲组分的环境；与样品流体和/ 或反应混合物接触的阵列组件的表面没有或几乎没有缓冲容量的环境；和 例如通过chemFET（更具体地，本文所述的ISFET）可检测0.01、0.05、 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6.0.7、0.8、0.9或1.0pH单位量级的pH变化 的环境。

缓冲抑制剂也可以是磷脂。磷脂可以是天然存在的或非天然存在的磷 脂。要用作缓冲抑制剂的磷脂的实例包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙 醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸。在有些实施方案中，磷脂可以包被在 chemFET表面(或反应室表面)上。这样的包被可以是共价的或非共价的。 在其它实施方案中，所述磷脂存在于溶液中。

本发明的一些实例采用这样的环境，其包括缓冲极低（如果有缓冲的 话）的反应溶液。缓冲可以通过溶液组分或接触该溶液的固体支持物来实 现。不具有缓冲容量或具有低缓冲容量(或活性)的溶液是这样的溶液，其 中可检测(例如，使用本文所述的chemFET传感器)至少约+/-0.005pH单 位、至少约+/-0.01、至少约+/-0.015、至少约+/-0.02、至少约+/-0.03、至 少约+/-0.04、至少约+/-0.05、至少约+/-0.10、至少约+/-0.15、至少约+/- 0.20、至少约+/-0.25、至少约+/-0.30、至少约+/-0.35、至少约+/-0.45、 至少约+/-0.50或更高的量级的氢离子浓度变化。在有些实施方案中，每 个核苷酸掺入的pH变化是在约0.005的量级。在有些实施方案中，每个 核苷酸掺入的pH变化是pH降低。不具有缓冲容量或具有低缓冲容量的 反应溶液可以不含有缓冲剂或含有非常低浓度的缓冲剂，或可以使用弱缓 冲剂。

串联化的模板

增加模板或引物的数目(即，拷贝数)会导致每个传感器和/或每个反应 室中更大数目的核苷酸掺入，由此导致更高的信号和信噪比。可以如下增 加拷贝数：例如通过使用串联体模板(即，包含待测序核酸的多个串联排 列的拷贝的核酸)，通过增加在珠子上或在珠子中的核酸的数目（直至并 包括使这样的珠子饱和），和通过以减小位阻和/或确保模板连接(例如，通 过共价连接模板)的方式将模板或引物连接到珠子上或传感器表面上，以 及其它。串联体模板可以固定化在珠子上或在珠子中或在其它固体支持物 （诸如传感器表面）上，但在某些实施方案中，串联体模板可以不经固定 化地存在于反应室中。例如，模板(或包含模板和引物的复合物)可以共价 地或非共价地连接到chemFET表面上，且它们的测序可以包括，在核苷 酸掺入事件后，检测释放的氢离子和/或向chemFET表面添加的负电荷。 后一种检测方案可以在缓冲环境或溶液中进行(即，chemFET不会检测任 何pH变化，因而这样的变化不会干扰对添加到chemFET表面上的负电 荷的检测)。

RCA或CCR扩增方法会产生模板核酸的串联体，其包含数十、数百、 数千或更多个串联排列的模板拷贝。这样的串联体在本文中仍然可以称作 模板核酸，尽管它们可能含有起始模板核酸的多个拷贝。在有些实施方案 中，它们也可以称作扩增的模板核酸。或者，它们在本文中可以称作包含 靶核酸片段的多个拷贝。串联体可以含有起始核酸的2、3、4、5、6、7、 8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或更多 个拷贝。它们可以含有起始核酸的10-10²、10²-10³、10³-10⁴、10³-10⁵或更 多个拷贝。使用这些或其它方法(诸如例如DNA纳米球)产生的串联体可 以用于本文所述的合成测序（sequencing-by-synthesis）方法中。串联体 可以在阵列外体外产生，然后放入阵列的反应室中，或它们可以在反应室 中产生。可以处理反应室的一个或多个内壁，以增强串联体的连接和保留， 但这不是必须的。在本发明的某些实施方案中，如果串联体连接到反应室 内壁（诸如chemFET表面）上，则至少在合成测序反应的背景下，可通 过在chemFET表面处的电荷变化（作为本文讨论的检测释放的氢离子的 替代或补充）来检测核苷酸掺入。如果串联体被沉积在chemFET表面上 和/或在反应室中，则通过本文讨论的检测释放的氢离子，可以进行合成 测序。本发明包括其它方法用于产生串联化模板的用途。一种这样的方法 是Stemmer等人在美国专利号5834252中所述的PCR，该方案的描述通 过引用并入本文。

本发明的重要方面包括同时测序多个不同的模板核酸。这可以使用本 文所述的传感器阵列来实现。在一个实施方案中，所述传感器阵列上面覆 盖(和/或集成)微孔阵列(或反应室或孔，因为这些术语在本文中互换使用)， 条件是，每个微孔中存在至少一个传感器。在多个微孔中存在的是模板核 酸的相同拷贝群体。不要求任意2个微孔携带相同的模板核酸，尽管在某 些情况下，这样的模板可以共有重叠序列。因而，每个微孔包含模板核酸 的多个相同拷贝，且微孔之间的模板可以是不同的。

因此应当理解，本发明包括用于测序未标记核酸的测序装置，其任选 地使用未标记的核苷酸，不进行光学检测，且包含至少100个反应室的阵 列。在有些实施方案中，所述阵列包含10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或更多个 反应室。间距(或邻近反应室之间的中心至中心距离)是在约1-10微米的 量级，包括1-9微米、1-8微米、1-7微米、1-6微米、1-5微米、1-4微米、 1-3微米或1-2微米。

在本发明的不同方面和实施方案中，载有核酸的珠子(它们可能是数 十个、数百个、数千个或更多)首先进入流动池，然后个体珠子进入个体 孔中。珠子可以被动地或以其它方式进入孔。例如，珠子可以通过重力进 入孔，不需要施加任何外力。珠子可以通过施加的外力进入孔，所述外力 包括但不限于磁力或离心力。在有些实施方案中，如果施加外力，在与孔 高度/深度平行（而不是与孔高度/深度横向）的方向施加外力，其目的是“捕 获”尽可能多的珠子。优选地，不搅动所述孔(或孔阵列)，因为例如可以 通过施加与孔高度/深度垂直的外力来实现。此外，在这样装载孔以后， 它们不受到会使珠子脱离孔的任何其它力。

本实施例提供了在磁珠背景下的一种示例性珠子装载方法的简单描 述。应当理解，类似的方案可以用于装载其它珠子类型。已经证实所述方 法会减少在流动室的孔中捕获空气的可能性和发生率，在流动室的所有孔 中均匀分布载有核酸的珠子，并避免多余的珠子在流动室中的存在和/或 积累。

在多种情况下，本发明包括流动室中的每个孔仅含有一个载有核酸的 珠子。这是因为，每个孔存在2个珠子会产生源自2个不同模板核酸的不 可用的测序信息。

作为测序反应的一部分，如果它的互补核苷酸存在于模板核酸的相同 位置处，dNTP将被连接至(或“掺入”，如本文使用的)新合成的链的3’(或 测序引物的3’末端，对于第一个掺入的dNTP的情况)。引入的dNTP的 掺入(和伴随的PPi释放)因此指示模板核酸中对应的核苷酸的种类。如果 还没有掺入dNTP，则不会释放氢，在chemFET表面处不会检测到信号。 因此可以得出结论，在该位置处的模板中不存在互补的核苷酸。如果引入 的dNTP已经掺入新合成的链，则chemFET将会检测到信号。信号强度 和/或曲线下面积是所掺入核苷酸数的函数(例如，这可能发生于模板中的 均聚物段中)。结果是，在模板的均聚物段(例如，聚腺苷酸、聚胸苷酸、 聚胞苷酸或聚鸟苷酸)的测序中，没有丢失序列信息。

实施例1

通过ISFET阵列上的pH迁移来检测芯片上的聚合酶延伸

将用链霉抗生物素蛋白包被的携带生物素化合成模板（测序引物和 T4DNA聚合酶与其结合）的2.8微米珠子经历4种核苷酸中的每一种的 3个连续流。每个核苷酸循环由dATP、dCTP、dGTP和dTTP的流组成， 它们各自仅夹杂缓冲液洗涤流。来自第一个循环的流显示为蓝色，来自第 二个循环的流显示为红色，第三个循环是黄色。如图10A所示，两个dATP 流二者产生的信号非常相似。图10B表明，dCTP的第一个(蓝色)迹线高 于来自后续循环的dCTP流，对应于其中聚合酶应该向每个模板分子中掺 入单个核苷酸的流。图10C表明，dGTP的第一个(蓝色)迹线比来自后续 循环的dGTP流的计数高约6(峰值比峰值)，对应于其中聚合酶应该向每 个模板分子中掺入10个核苷酸串的流。图10D表明，dTTP的第一个(蓝 色)迹线也比来自后续循环的dTTP流的计数高约6(峰值比峰值)，对应于 其中聚合酶应该向每个模板分子中掺入10个核苷酸的流。

实施例2

在封闭系统中的测序和数据操作

已经从23-mer合成寡核苷酸和25-mer PCR产物寡核苷酸得到序列。 将寡核苷酸连接到珠子上，然后将珠子装载进芯片上的单个孔中，所述芯 片具有在1348x1152阵列中的155万个传感器，所述阵列具有5.1微米 间距(38400个传感器/mm²)。每个珠子负载合成寡核苷酸的约100万个拷 贝，且每个珠子负载PCR产物的约300000至600000个拷贝。在阵列中 和在阵列上的4种核苷酸的循环是2分钟长。使用各自50微摩尔/升浓度 的核苷酸。聚合酶是在该过程中使用的唯一酶。以32帧/秒收集数据。

图11A描述了从ISFET直接测得的合成寡核苷酸的原始数据。1毫 伏相当于68个计数。在芯片上的每个传感器(在314芯片上的1550200个 传感器)处，每秒取样数据多次。该图对每个核苷酸流用颜色进行代码。 使用每个核苷酸流，进行几秒的成像。该图描述了在每个流过程中发生的 那些单个测量的拼接。Y轴是原始计数，X轴按秒计算。刚好重叠在X 轴上面的是预期的每个流的掺入。

图11B描述了每个核苷酸流的积分值，其根据成待测序模板归一化。 积分的值取自图11A所示的原始迹线测量结果，且已经选择积分边界以 使信噪比最大化。已经将结果根据每个碱基掺入的信号进行归一化，并按 照核苷酸流绘图。Y轴是掺入计数，X轴是核苷酸流编号，按TACG交 替。