一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法

摘要

本发明涉及一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法，属于生物技术领域。包括：棉籽浸种、取种胚，利用Cry1Ab/Ac的ELISA试剂盒进行Bt毒蛋白的提取，毒蛋白含量测定，采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级。本发明提供了一种抗虫棉抗性强度的早期预测方法，即通过检测棉种胚的毒蛋白含量水平来早期预测抗虫棉株未来整体抗虫性的强弱。该方法只需少量棉种，通过利用其种胚在室内检测其毒蛋白含量，即可对棉种的抗虫性进行快速评判，为提升转Bt基因抗虫棉的育种效率提供技术支持。

说明书

 

一、技术领域

本发明涉及利用棉种胚预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

转基因抗虫棉表达的抗虫性强度是维持品种对棉铃虫持久抗性的重要保障。因此，检测抗虫棉的抗虫性强度也就成了转基因抗虫棉安全性评价的一项重要指标。一个可以在生产上推广应用的抗虫棉品种，其综合抗虫性强度一般要达抗级水平。国内现有检测转Bt基因抗虫棉抗虫性主要有以下2种方法：

1、叶片毒蛋白表达量检测：在蕾期，取抗株棉花顶端叶片，按ELISA方法测定Bt毒蛋白定量含量，确定Bt表达量水平（全国农业技术推广中心. 中国棉花新品种动态. 中国农业科学技术出版社，2013年版，P139）。其中：不表达，Bt蛋白≤5ng/g鲜重; 低表达，5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重；中表达，150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重；中高表达，300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重；高表达，Bt蛋白＞450ng/g鲜重。

2、综合生物学抗虫性检测：包括（1）苗期抗虫性鉴定，采取室内棉苗叶片接虫法；(2）蕾铃期抗虫性鉴定，采用田间罩笼接蛾法。而后根据室内、室外抗性鉴定进行量化，按单次高抗的赋值4，抗的赋值3，低抗的赋值2，不抗的赋值1，累计各项次鉴定结果的抗性值，得到该品种综合抗性值（K）、平均抗性值(PK)。抗性等级的综合评判根据PK值的大小进行量化。其抗级评判标准为：PK值小于等于1.5为不抗，PK值大于1.5小于等于2.5为低抗，PK值大于2.5小于等于3.5为抗，PK值大于等于3.5为高抗（柏立新，束春娥，张龙娃，等. 棉花新品种（系）抗棉铃虫鉴定与综合量化评估. 中国棉花，2004，31（1）：19-22）。

上述两种方法用于已经定型的少量品系检测有其独特的应用价值；但对于大量早期育种材料——比如单株、株行等的鉴定，以上两种方法具有明显的局限性：（1）时效性较差：必须在蕾期以后才能取组织样品来检测品种的抗虫性；（2）耗财费力：需将检测材料进行播种出苗，而后移栽到大田，待棉株长到现蕾期才能取样检测，需大量人力、物力的投入。

对于棉花育种者来说，寻找一种早期快速检测抗虫棉抗性的技术至关重要。这样可以大大节省育种人力、物力的投入，提高抗虫棉育种的目的性与选择效率。

一般说来，抗虫棉的整体抗性强度与Bt毒蛋白的整体组成型表达量密切相关。由于在棉株在发育过程中，Bt毒蛋白的表达具有一定的时空动态变化（陈松，吴敬音，何小兰，等. 转基因抗虫棉组织中Bt毒蛋白表达量的       ELISA测定，江苏农业学报，1997，13（3）：154-156），能否通过棉种早期器官的毒蛋白含量测定来比较准确地预测后来棉株整体的抗性水平，乃是本发明重点要解决的问题所在。

不同棉种的籽指大小存在一定差异，对应其种仁大小也存在一定差异。已知棉种的种仁 = 子叶+种胚（胚芽+胚轴+胚根）（中国农业科学院棉花研究所主编. 中国棉花栽培学.上海科学技术出版社，P115-116）。其中子叶约占整个种仁的95%的比重，种胚约占5%左右。与子叶相比，单个种胚在不同品种间，其重量差异相对较小，具有相互比较的物质基础。当棉花长出5-6片真叶后，子叶完成其生命周期自行脱落。去除子叶后，构建后来棉株整体的其实就是种胚（即：胚芽+胚轴+胚根）。棉种胚尽管占的比重很少，但却是形成棉花未来成体的“微型植株”，是棉株未来整体在早期的缩影，是后来棉株整体的“微缩版”。它们的生化物质构成特点基本可以反映出未来成株组成型生化物质的基本构成特点。基于以上认知，本发明拟采用棉种胚的毒蛋白表达量来预测后来棉株整体的毒蛋白表达水平，即通过对种胚毒蛋白含量的定量检测来早期预测抗虫棉株未来整体的抗性水平。

三、发明内容

技术问题

本发明目的是拟提供一种可在早期进行快速检测的技术，一种抗虫棉抗性强度的早期预测方法，即通过检测棉种胚的毒蛋白含量水平来早期预测抗虫棉株未来整体抗虫性的强弱。该方法只需少量棉种，通过利用其种胚在室内检测其毒蛋白含量，即可对棉种的抗虫性进行快速评判，为提升转Bt基因抗虫棉的育种效率提供技术支持。

技术方案

利用棉种胚预测转Bt基因棉花抗虫性的方法，包括：

    1、棉种在25℃的温室浸种20-28小时，取浸种后的种子20粒，用手按棉种，在珠孔端挤出完整种胚或剥出种胚；

2、每个材料称取0.10-0.15g种胚或数15个种胚，加0.25-0.5ml Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒样品提取液，用组织研磨器匀浆3min，转入1.5ml离心管，6000转/min，离心10 min，取上清液待检，残渣弃去；

3、加标样及待测样：将Bt标样（由Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒提供）用样品稀释液配成 45、15、5、1.7 ng/ml。将系列标准样加入96孔的Cry1Ab/Ac的酶标板的前两列，每个浓度加2孔，每孔50μl。其余孔加待测样，每个样本依次2倍稀释2个浓度。（按预试验结果，若某样品测得的OD值超阈值，则补做更高浓度稀释，直到该样品的OD在标准曲线范围内）。每孔均加50μl。

4、加抗体：用样品稀释液1:1000稀释Bt毒蛋白抗体，混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始反应， 37℃条件下 90 min；

5、洗板：将反应液甩干并在纸上拍净用洗板机洗涤四次；

6、显色：在每孔中加100μl TMB，37℃ 15 min，每孔加入100μl盐酸终止反应；

7、比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品450nm处的OD值；

8、结果计算

根据标准样品2次测定数据的平均值，绘制标准曲线。其中横坐标X为各浓度显色OD₄₅₀值表示，纵坐标Y为蛋白标样各浓度值（ng/ml），拟合标准曲线方程。

待测样品毒蛋白含量计算：根据以上标准品曲线方程，从显色OD₄₅₀值，计算出被测样品的蛋白浓度（ng/ml）；而后乘稀释倍数，计算待测样品的平均毒蛋白含量（ng/ml）。最后依据公式：样品平均毒蛋白浓度（ng/ml）×样品原体积／样品胚重量，即得样品每克种胚鲜重的毒蛋白含量（ng/g）。

9、按毒蛋白划分抗性等级

采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级，具体标准如下：

不抗——Bt蛋白≤5ng/g鲜重; 

低抗——5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重；

中抗——150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重；

中高抗——300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重；

高抗——Bt蛋白＞450ng/g鲜重。

 

有益效果

本发明提供了一种抗虫棉抗性强度的早期预测方法，即通过检测棉种胚的毒蛋白含量水平来早期预测抗虫棉株未来整体抗虫性的强弱。该方法只需少量棉种，通过利用其种胚在室内检测其毒蛋白含量，即可对棉种的抗虫性进行快速评判，为提升转Bt基因抗虫棉的育种效率提供技术支持。试验证明，根据胚组织与叶组织的抗性级别量化值，两者进行相关分析，结果显示：两者抗性级别的相关系数R=0.783**，达极显著相关水平，表明可以利用种胚的毒蛋白表达量来早期预测转Bt基因抗虫棉的抗虫性强度。利用种胚毒蛋白预测抗性与生物学综合抗虫鉴定结果列于表3。在测定的9个品系中，两者抗性级别的吻合度高达88.9%。该研究结果显示：测定种胚毒蛋白表达量也可以在早期快速预测转Bt基因抗虫棉的生物学抗虫性级别。

 

具体实施方式

一、利用棉种胚预测转Bt基因棉花抗虫性的方法，包括：

   （一）棉籽浸种

棉种（非脱绒毛子、脱绒光子皆可），在25℃的温室浸种24小时左右。通过浸种有利于种胚的快速挤出。

（二）取种胚

取浸种后的种子20粒，用手按棉种，在珠孔端挤出完整种胚（或剥出种胚）。每个材料称种胚0.1克，约合15个种胚。

（三）Bt毒蛋白ELISA检测

1．实验器材

组织碾磨机，冷冻离心机，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板，可调微量液体加样器（10μl、40μl、200μl、1000μl）。

2．试剂

(1) Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒（由上海佑隆生物技术有限公司提供）

(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH₂PO₄ , 2.96g Na₂HPO₄·12H₂O，用蒸馏水定容至1 000 ml（pH 7.5）。

(3) 洗涤液：PBS，0.05% Tween 20

(4) 样品提取液：专用Bt毒蛋白提取液（由Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒提供）

(5) 稀释液：PBST-1% BSA

(6) TMB显色液：试剂盒提供

(7) 终止液：1M HCL

3．Bt毒蛋白的提取

（1） 称取0.1g种胚，加0.5ml样品提取液，用组织研磨器匀浆3min，转入1.5ml离心管，6000转/min，离心10 min，

（2） 取上清液待检，残渣弃去。

4．毒蛋白含量测定

（1）加标样及待测样：将Bt标样（由Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒提供）用样品稀释液配成 45、15、5、1.7 ng/ml。将系列标准样加入96孔的Cry1Ab/Ac的酶标板的前两列，每个浓度加2孔，每孔50μl。其余孔加待测样：按预试验结果，依次做2个浓度稀释，保证各样品的OD值均在标准曲线范围内，每孔加样50μl。

（2）加抗体：用样品稀释液1:1000稀释抗体（由Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒提供），混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始反应， 37℃条件下 90 min。

（3）洗板：将反应液甩干并在纸上拍净用洗板机洗涤四次。

（4）显色：在每孔中加100μl TMB，37℃ 15 min，每孔加入100μl盐酸终止反应。

（5）比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品450nm处的OD值。

（四）结果计算

1、根据标准样品，绘制标准曲线。其中横坐标X为各浓度显色OD₄₅₀值表示，纵坐标Y为蛋白标样各浓度值（ng/ml），拟合标准曲线方程：Y = 0.6339X ² + 19.275X - 1.3305（R²=0.9998）。

2、待测样品毒蛋白含量计算：根据以上标准品曲线方程，从显色OD₄₅₀值，计算出被测样品的蛋白浓度（ng/ml）；而后乘稀释倍数，计算待测样品的平均毒蛋白含量（ng/ml）。最后依据公式：样品平均毒蛋白浓度（ng/ml）×样品原体积（0.5ml）／样品胚重量（0.1g），得样品每克种胚鲜重的毒蛋白含量（ng/g）。

（五）按毒蛋白划分抗性等级

采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级。具体标准如下：

不抗——Bt蛋白≤5ng/g鲜重; 

低抗——5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重；

中抗——150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重；

中高抗——300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重；

高抗——Bt蛋白＞450ng/g鲜重。

 

二、种胚预测抗性级别与叶片检测抗性级别之间的相关性

试验材料：（1）2013年5月8号将9个材料的棉种在25℃条件下做浸种24小时，5月9号挤出种胚，取样测定。（2）2013年7月8号在大田取9个材料的倒1-2嫩叶，测定叶片毒蛋白。

利用Bt毒蛋白试纸盒（即Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒）测定各材料的毒蛋白表达量结果，并按标准确定各材料的抗性级别（见表1）。由表可见：按种胚毒蛋白测定结果确定的抗性级别与测定叶片毒蛋白确定的抗性抗性级别——9个材料中有6个材料确定的抗性级别完全一致。

同时对胚组织与叶组织的检测结果，按毒蛋白含量进行抗性等级量化赋值，其标准如下：

0——不抗（Bt蛋白≤5ng/g鲜重）; 

1——低抗（5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重）；

2——中抗（150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重）；

3——中高抗（300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重）；

4——高抗（Bt蛋白＞450ng/g鲜重）。

根据胚组织与叶组织的抗性级别量化值，两者进行相关分析，结果显示：两者抗性级别的相关系数R=0.783**，达极显著相关水平。该研究表明：可以利用种胚的毒蛋白表达量来早期预测转Bt基因抗虫棉的抗虫性强度。

 

表1、转基因棉花的种胚与顶叶的毒蛋白含量及抗性级别

抗虫材料编号ng蛋白/g胚样品抗性级别量化赋值ng蛋白/ g叶样品抗性级别量化赋值32B536高抗（4）1664.6高抗（4）99B592高抗（4）2464.6高抗（4）33B1528高抗（4）1123.9高抗（4）鲁棉研283480高抗（4）1671.1高抗（4）苏杂6号900.6高抗（4）1404.2高抗（4）星杂棉168474.2高抗（4）369中高抗（3）冀棉958499.3高抗（4）128.5中抗（2）苏杂118200中抗（2）60.4低抗（1）苏杂3号474.7高抗（4）1413.1高抗（4）

（注：R_0.05(7)=0.553；R_0.01(7)=0.684）

三、种胚预测抗虫性与叶片测定生物学抗虫性的相关性

1、生物学抗虫性鉴定

（1）供试棉花材料

    参试的9个棉花新品种（系），选用非抗虫品种“苏棉9号”作对照品种。试验设在南京江苏省农科院试验地。所有试验材料均于4月26日播种，地膜覆盖。随机区组排列，二次重复。区组内每个棉花试验材料（处理）种植1行，每行30～35株左右。试验田各处理统一按高产栽培措施进行肥水管理等，害虫防治也根据棉田发生实况与试验要求统一进行。

（2）鉴定虫源准备

    从棉田采集棉铃虫，在恒温养虫室内用人工饲料饲养形成标准虫种。养虫室内温光条件控制为：光照16h，温度为26℃。

（3）抗虫性鉴定

采取室内棉叶接虫测定法。于6月9日（4～5片真叶期）及7月3日（蕾铃期）接虫测定，各区组每品种采回10张嫩叶（每株最多采1张），每培养皿放2张嫩叶，用脱脂棉保湿，接龄期整齐的棉铃虫低龄幼虫6头。3、5天后观察其死虫数、活虫数、活虫龄期及叶片被害程度等。

（4）生物抗性检测结果

根据室内、室外抗性鉴定进行量化，按单次高抗的赋值4，抗的赋值3，低抗的赋值2，不抗的赋值1，累计各项次鉴定结果的抗性值，得到该品种综合抗性值（K）、平均抗性值(PK)。抗性等级的综合评判根据PK值的大小来量化。其抗级评判标准为：PK值小于等于1.5为不抗，PK值大于1.5小于等于2.5为低抗，PK值大于2.5小于3.5为抗，PK值大于等于3.5为高抗（柏立新，束春娥，张龙娃，等. 棉花新品种（系）抗棉铃虫鉴定与综合量化评估. 中国棉花，2004，31（1）：19-22）。

本试验通过上述室内接虫鉴定方法所得到的不同指标的动态抗性信息与综合抗性信息汇总于表2。

表2 供试棉花品种对棉铃虫抗性值的时空动态及其综合评价

注：综合抗性级别一栏中：HR代表高抗， R代表抗，LR代表低抗，S代表感或不抗

2、相关性分析

利用种胚毒蛋白预测抗性与生物学综合抗虫鉴定结果列于表3。由表可见：在测定的9个品系中，两者抗性级别的吻合度高达88.9%。该研究结果显示：测定种胚毒蛋白表达量也可以在早期快速预测转Bt基因抗虫棉的生物学抗虫性级别。

 

表3、胚毒蛋白测定抗性与生物学综合抗虫级别的关系

抗虫材料编号ng蛋白/g胚样品按Bt表达量确定抗性级别生物学平均抗性值PK综合抗性级别32B536高抗3.33R99B592高抗3.00R33B1528高抗3.42R鲁棉研283480高抗3.42R苏杂6号900.6高抗3.33R星杂棉168474.2高抗2.75R冀棉958499.3高抗2.75R苏杂118200中抗2.67R苏杂3号474.7高抗3.67HR

以上材料均为公知公用，见参考文献来源：

[1]周尤付,邓守炳. 保铃棉32B的品种特性及栽培技术. 安徽农业，2001（4）：16；

[2]苏涛. 抗虫棉99B高产栽培技术探讨. 新疆农垦科技, 2007(5) : 11-12；

[3]仲维珍,刘素娟. 转Bt基因抗虫棉33B种子繁育推广技术.中国棉花，1999,26（1）:45；

[4]王留明,王家宝,白林红,杨静,陈莹,王秀丽. 抗虫棉鲁棉研28号的选育及栽培技术要点. 山东农业科学, 2008(2): 110-111；

[5]陈旭升,狄佳春,许乃银,刘剑光,肖松华. 转基因抗虫杂交棉新品种——苏杂6号. 江苏农业科学, 2008,(6):100；

[6]安徽省农作物品种审定委员会四届十一次会议审定通过品种“星杂棉168”， 安徽省农业委员会公告（第23号）第42页, 2014年1月17日；

[7]孟建朝 葛朝红 尹晓琳. 冀棉958品种特性及其高产栽培. 种子科技, 2008,26(2): 61-62

[8]陈旭升,狄佳春,许乃银,肖松华,刘剑光. 杂交棉新品种——苏杂118. 中国棉花, 2006,33(8): 26-27；

[9]陈旭升,郭三堆,许乃银,狄佳春,肖松华,刘剑光. 转基因双价抗虫杂交棉新品种——苏杂3号. 江苏农业学报, 2005, 21(3):190。