NOTCH通路信号转导抑制剂化合物

摘要

本发明提供了用作治疗癌症的Notch通路信号转导抑制剂的化合物或药物可接受的盐或水合物以及包含所述化合物或药物可接受的盐或水合物的药物组合物。

说明书

Notch信号转导是在哺乳动物的发育和组织稳态中发挥不可或缺作用的进化保守通路。Notch受体和配体包含单次跨膜结构域，在细胞表面上表达，因此，Notch信号转导对于调节表达受体和配体的邻近细胞之间的通信特别重要。在啮齿动物和人中发现存在四种已知的Notch受体，称为Notch 1至Notch 4。Notch受体是由最初以单一多肽形式合成的细胞外和细胞内结构域构成的异源二聚体蛋白质。受体-配体相互作用触发一系列其中与γ-分泌酶活动有关的Notch受体多肽的蛋白酶切。γ-分泌酶活动裂解来自细胞表面的Notch胞内结构域，其转移至细胞核以形成转录因子复合体。Notch胞内结构域(NICD)是蛋白质的活性形式。各种Notch信号转导功能包括增殖、分化、细胞凋亡、血管生成、迁移和自我更新。在正常组织的发育和维持过程中Notch信号转导的这些不同角色在不同形式的癌症中被异常激活。Notch信号转导的致癌功能包括抑制细胞凋亡和促进细胞增殖。

γ-分泌酶在Notch激活级联中发挥关键作用。因此，已经积极研究γ-分泌酶的抑制剂的阻止Notch受体激活的潜力。WO 98/28268中例示的化合物如7C-203是这类γ-分泌酶抑制剂的代表。尽管有前景，但仍没有出现商业Notch抑制剂化学治疗剂。

亟需找到具有Notch通路信号转导抑制活性的化合物。还亟需找到具有γ-分泌酶抑制活性的化合物。还亟需找到具有可能有助于Notch通路信号转导抑制活性的独特结构特征的化合物。还亟需找到显示Notch通路信号转导抑制活性和期望的体内分布、代谢和排泄性质的化合物。

图1是实施例2化合物的代表性X射线粉末衍射图。

本发明的一个方面是提供下列结构的Notch信号转导抑制剂化合物或其药物可接受的盐或水合物：

。

本发明的第二方面提供了药物组合物，其包含4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物以及药物可接受的载体。在特殊的实施方案中，药物组合物包含4,4,4-三氟-N-[(1S)-2[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物以及药物可接受的载体和任选其它的治疗成分。

本发明的第三方面提供了抑制需要其的癌症患者中的Notch信号转导的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物。

本发明的第四方面提供了治疗患者中的癌症的方法，所述癌症为T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、结直肠癌、头颈癌、子宫颈癌、前列腺癌、肝癌、鳞状细胞癌(口腔)、皮肤癌或成神经管细胞瘤，所述方法包括给予需要其的患者治疗有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物。

本发明的第五方面提供了治疗患者中的癌症的方法，所述癌症为T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤或结直肠癌，所述方法包括给予需要其的患者治疗有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物。

本发明的第六方面提供了化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物，其用于治疗。

本发明的第七方面提供了化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物，其用于治疗癌症，所述癌症为T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、结直肠癌、头颈癌、子宫颈癌、前列腺癌、肝癌、鳞状细胞癌(口腔)、皮肤癌或成神经管细胞瘤。

本发明的第八方面提供了化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物，其用于治疗癌症，所述癌症为T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤或结直肠癌。

本发明的第九方面提供了化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症为T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、结直肠癌、头颈癌、子宫颈癌、前列腺癌、肝癌、鳞状细胞癌(口腔)、皮肤癌或成神经管细胞瘤。

本发明的第十方面提供了化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症为T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤或结直肠癌。

术语“患者”是指哺乳动物并且“哺乳动物”包括但不限于人。

“治疗有效量”或“有效量”是指抑制癌症患者中的Notch信号转导和破坏患者中靶标癌症细胞或者减慢或抑制癌症的发展必需的化合物或其药物可接受的盐或水合物，或包含所述化合物或其药物可接受的盐或水合物的药物组合物的剂量。化合物1或其药物可接受的盐或水合物的预期剂量为0.1至200 mg/患者/天。预期优选剂量为1至175 mg/患者/天。预期最优选剂量为5至150 mg/患者/天。治疗患者所需的精确剂量和治疗时间长度由医生根据疾病的阶段和严重程度以及个别患者的特殊需要和反应确定。尽管表示为基于每天的剂量，但可调整给药方案以提供患者更优的治疗益处并且控制和减轻黏液性肠病(胃肠道中黏液分泌过多和累积)。除了每天给药之外，每隔一天给药(Q2D)；五天内每隔一天给药随后两天不给药(T.I.W.)；或者每三天(Q3D)可能合适。优选每隔一天、T.I.W.或每三天的给药方案连同给予地塞米松(化合物1的给药前、共同给药或给药后)以控制或减轻黏液性肠病。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”意思包括患者遭受的癌症的全方位介入，例如活性化合物的给药以减轻至减慢或逆转一个或多个症状并且延迟癌症的发展，即使实际上没有根除癌症。待治疗的患者为哺乳动物，特别是人。

优选地，使用药物可接受的载体将本发明的化合物配制为药物组合物并通过多种途径给药。优选地，这类组合物用于口服给药。这类药物组合物和制备它们的方法是本领域熟知的。参见例如REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(A. Gennaro等人编辑，第19版，Mack Publishing Co.，1995)。在特殊的实施方案中，药物组合物包含4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其药物可接受的盐或水合物连同药物可接受的载体以及任选其它治疗成分，特别地用于治疗一般或特殊癌症类型的癌症。

本发明的化合物能够与许多无机和有机酸反应以形成药物可接受的酸加成盐。这类药物可接受的盐和用于制备它们的常规方法是本领域熟知的。参见例如，P. Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE(VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S.M. Berge等人，“Pharmaceutical Salts “Journal　of　Pharmaceutical　Sciences，Vol. 66，No.1，1977年1月。

可通过本领域已知的多种步骤以及下面描述的那些制备化合物1或其药物可接受的盐或水合物。可以不同方式组合具体合成步骤以制备化合物1或其药物可接受的盐或水合物。

化合物1被命名为：4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺；并且还可被命名为：N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-二氢-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-5H-吡啶并[3,2-a][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代乙基]-4,4,4-三氟丁酰胺；并且其它名称可用于明确识别化合物1。

应当理解，化合物1被描述为单一立体异构体。存在两个手性中心，产生四个立体异构体。如本文使用的，提及化合物1是指还包括包含化合物1的外消旋混合物。此处，(R)-和(S)-的Cahn-Ingold-Prelog命名用于是指特定的异构体。能使用对映异构体纯的或富集的起始材料通过立体专一性合成制备特定的立体异构体。能通过本领域熟知的技术如在Stereochemistry of Organic Compounds，E. I. Eliel和S. H. Wilen(Wiley 1994)和Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J., Jacques, A. Collet和S. H. Wilen(Wiley 1991)中获悉的那些拆分起始材料、中间体或包含化合物1的外消旋混合物的特定的立体异构体，包括手性固定相上的色谱、酶拆分或分级结晶或为该目的形成的非对映异构体（如非对映异构体盐）色谱。尽管在本发明范围内包括所有包含本发明化合物的混合物，但优选的实施方案是化合物1。

还发现，化合物1以阻转异构体或特定构象异构体形式存在。在水溶液中，在24小时后，在环境温度下通过¹H NMR和LC-MS检测到与阻转异构体1(大量阻转异构体)平衡的8-9%的阻转异构体2(微量阻转异构体)。在有机溶剂中，在24小时后，在环境温度下，通过¹H NMR和LC-MS检测到与阻转异构体1平衡的约1-2%的阻转异构体2。尽管通过¹H NMR和LC-MS分析可检测，但阻转异构体2不可分离。

在本发明化合物的合成中以最初起始材料形式使用的化合物是熟知的，并且对于不可商购的程度，使用提供的特定参考文献通过本领域一般技术人员通常使用的或在一般参考文献中获悉的标准步骤容易合成。

已知步骤和方法的实例包括在一般参考文献如Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers Inc，1989；Compendium of Organic Synthetic Methods，第1-10卷，1974-2002，Wiley Interscience；Advanced Organic Chemistry，Reactions Mechanisms, and Structure，第5版，Michael B. Smith和Jerry March，Wiley Interscience，2001；Advanced Organic Chemistry，第4版，部分B，Reactions and Synthesis，Francis A. Carey和Richard J. Sundberg，Kluwer Academic / Plenum Publishers，2000等和其中引用的参考文献中描述的那些。

使用SymaxDraw版本3.2绘图程序从结构命名中间体和化合物1，如一贯使用的IUPAC命名。

制备1

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸苄酯

在氮气下，在环境温度下向4,4,4-三氟丁酸(7.131 g, 48.7 mmol)的二氯甲烷(162 mL)溶液相继添加L-丙氨酸苄酯盐酸盐(7.00 g, 32.5 mmol)、二异丙基乙胺(28.30 mL, 162.3 mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(7.46 g, 48.7 mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(9.33 g 48.7 mmol)并搅拌20小时。添加20%的柠檬酸水溶液(150 mL, 162 mmol)，搅拌混合物5分钟并分离层。使用二氯甲烷(100 mL)从水中萃取。使用饱和碳酸氢钠水溶液(150 mL)洗涤合并的有机物，在硫酸镁上干燥并浓缩。通过使用己烷:乙酸乙酯(4:1至2:1)洗脱的快速色谱纯化剩余物以产生白色固体形式的标题化合物(9.22 g, 30.4 mmol, 94%)。MS(m/z):304(M+1)；[α]_Na²⁵ = -44.6°(c=5.0, 甲醇)。

制备2

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸

在环境温度下，向(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸苄酯(8.80 g, 29 mmol)的甲醇(88 mL)溶液一次加入钯/碳(5%, 1.76 g, 0.8 mmol)。将混合物脱气(真空/氮气)，填充氢气(一个大气压)并在氢气(29 mmol)下搅拌5小时。通过Celite?过滤，使用甲醇冲洗滤饼并浓缩滤液以获得白色固体形式的标题化合物(6.11g, 28.7 mmol, 99%)。MS(m/z):214(M+1)；[α]_Na²⁵ = -24.7°(c=5.0, 甲醇)。

制备3

2-(2-溴苯基)乙酸甲酯

向使用环境温度水浴冷却的2-溴苯基乙酸(150.0 g, 683.6 mmol)的二氯甲烷(1.50 L)溶液添加二甲基甲酰胺(2.1mL, 27.3 mmol)，随后添加亚硫酰氯(52.3 mL, 717.8 mmol)时间为7分钟。搅拌混合物5小时，添加甲醇(41.5 mL, 1.0 mol)时间为5分钟。鼓氮气泡通过溶液过夜。浓缩以定量产率获得无色油状物形式的标题化合物(166.0 g, 724.7 mmol)。1H NMR(300 MHz, CDCl₃)：7.57(d, J= 7.9 Hz, 1H), 7.30-7.26(m, 2H), 7.19-7.12(m, 1H), 3.80(s, 2H), 3.72(s, 3H)。

制备4

2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]乙酸甲酯

使用三次真空/氮气循环脱气2-(2-溴苯基)乙酸甲酯(156.6 g, 684 mmol)、双戊酰二硼(194.9 g, 752 mmol)和乙酸钾(135.6 g, 1.4 mol)的N-甲基吡咯烷酮(940 mL)悬浮液。添加(1,1’-双(二苯基膦)二茂铁)氯化钯(II)(11.4 g, 13.7 mmol)并在80℃下加热。在15小时之后，添加(1,1’-双(二苯基膦)二茂铁)氯化钯(II)(11.4 g, 13.7 mmol)并在90℃下搅拌24小时。冷却至环境温度并倾倒在冰和水的混合物(3 L)上，并添加甲基叔丁基醚(1 L)。搅拌混合物，通过Celite?垫过滤并分离层。使用甲基叔丁基醚(2 × 500 mL)从水溶液中萃取。使用水(2 × 500 mL)、盐水(500 mL)洗涤合并的有机物，在硫酸钠上干燥并浓缩。通过使用己烷:乙酸乙酯(9:1)洗脱的快速色谱纯化剩余物以产生白色固体形式的标题化合物(160.6 g, 581.6 mmol, 85%)。MS(m/z):277(M+1)。

制备5

5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

向2-氨基-3-溴吡啶(88.5 g, 511.7 mmol)的1,4-二氧杂环己烷(550 mL)和水(550 mL)溶液添加碳酸钾(235.7 g, 1.71 mol)。使用三次真空/氮气循环脱气混合物，在88℃下在氮气下添加乙酸钯(II)(6.4 g, 28.4 mmol)和三叔丁基膦鎓四氟硼酸盐(16.5 g, 56.9 mmol)并搅拌。在3分钟内滴加2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]乙酸甲酯(157.0 g, 568.5 mmol)的1,4-二氧杂环己烷(550 mL)溶液并在88℃下搅拌混合物20分钟。冷却混合物至50℃，添加水(100 mL)并分离层。使用乙酸乙酯(2 × 100 mL)从水溶液中萃取，在硫酸钠上干燥合并的有机物并浓缩。在N-甲基吡咯烷酮(314 mL)中溶解浓缩的物质，在冰浴中冷却并滴加硫酸(314 mL, 5.9 mol)以保持温度为约45℃。在140℃下搅拌混合物90分钟。冷却至环境温度，添加冰(4 kg)并使用分批添加的50% NaOH水溶液碱化直至溶液为pH 7-8。冷却悬浮液至10-15℃，滤出固体并使用水(2 L)、己烷(1 L)和甲基叔丁基醚(1 L)洗涤。在40℃下在真空下干燥。使用10%甲醇/二氯甲烷溶液的回流混合物处理物质并热过滤(×4)。浓缩合并的滤液以产生浅褐色固体形式的标题化合物(85 g, 404.3 mmol, 71%)。MS(m/z):211(M+1)。

制备6

5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

向5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(86.0 g, 409.1 mmol)的二甲基甲酰胺(860 mL)悬浮液添加碳酸铯(186.6 g, 572.7 mmol)、(2-溴乙氧基)-叔丁基二甲基甲硅烷(88.0 mL, 409.1 mmol)和碘化钠(6.1 g, 40.9 mmol)并在70℃下搅拌20小时。冷却混合物至环境温度，倾倒在冰和水(100 mL)上，添加乙酸乙酯(200 mL)。通过Celite?过滤混合物，然后使用乙酸乙酯(100 mL)洗涤。分离滤液层，使用乙酸乙酯(2 × 50 mL)从水溶液中萃取。使用水(2 × 100 mL)、盐水(100 mL)洗涤合并的有机物，在硫酸钠上干燥并浓缩。在四氢呋喃(1.28 L)中溶解物质，添加Silia?结合钯清除剂(16.7 g)并在环境温度下搅拌20小时。通过二氧化硅垫过滤，使用四氢呋喃(200 mL)洗涤并浓缩以获得浅褐色油状物形式的标题化合物，其以定量产率结晶(155 g, 420.6 mmol)。MS(m/z):369(M+1)。

方法2：

加热5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(22.5 g, 106.9 mmol)和二甲基甲酰胺(500 mL)的混合物至100℃达5分钟。冷却至40℃，添加碳酸铯(104.3 g, 320.1 mmol)和(2-溴乙氧基)-叔丁基二甲基甲硅烷(29.9 mL, 138.9 mmol)并在环境温度下搅拌过夜。加热至60℃约2小时，然后冷却至环境温度。将剩余物在乙酸乙酯(1 L)和水(3 L)之间分层，使用乙酸乙酯(2 × 500 mL)从水层中反萃，使用盐水(2 × 500 mL)洗涤合并的有机物。在硫酸钠上干燥合并的有机物并浓缩。通过使用乙酸乙酯:己烷(0:100至100:0)洗脱的快速色谱纯化剩余物以产生油状物形式的标题化合物(39.4 g, 106.9 mmol, 89%)。MS(m/z):369(M+1)。

制备7

5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7-羟基亚氨基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

在-5℃下，向5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(155.0 g, 420.6 mmol)的四氢呋喃(1.6 L)溶液添加2-甲基丙烷-2-醇钾(66.1 g, 588.8 mmol)并搅拌10分钟。在-5℃下滴加亚硝酸异戊酯(61.9 mL, 462.6 mmol)并搅拌混合物10分钟。倾倒在冰/水(2 L)上并使用乙酸乙酯(3 × 200 mL)萃取。使用盐水(200 mL)洗涤合并的有机物，在硫酸钠上干燥。添加甲苯(1 L)并浓缩(×3)以获得粘稠褐色油状物形式的标题化合物(160.0 g, 402.5 mmol, 96%)。MS(m/z):398(M+1)。

制备8

(7S)-7-氨基-5-(2-羟基乙基)-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

在环境温度的水浴中，向5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7-羟基亚氨基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(155.0 g, 389.9 mmol)的二氯甲烷(620 mL)和甲醇(310 mL)的混合物溶液分批添加三氟乙酸(124.0 mL, 1.64 mol)。分批添加锌(76.5 g, 1.2 mol)使得内温保持在33-38℃。在环境温度下搅拌15小时。通过Celite?过滤混合物，使用10%甲醇/二氯甲烷(100 mL)洗涤并浓缩滤液。添加二氯甲烷(0.5 L)和冰(500 g)，搅拌并使用50% NaOH水溶液碱化。滤出固体，分离滤液层。使用二氯甲烷(2 × 100 mL)从水溶液中萃取，并浓缩合并的有机物。在己烷中将固体制浆，然后过滤并在高真空下干燥以获得浅黄色固体形式的标题化合物的外消旋体(74.0 g, 274.8 mmol, 71%)。在使用乙醇(0.2%二甲基乙胺):乙腈(0:100至100:0)洗脱的Chiralpak? AD柱上纯化物质以获得白色固体形式的标题化合物(35.0 g, 130 mmol, 33.3%)。MS(m/z):270(M+1)；[α]_Na²⁵= +187.83°(c=6.9, 甲醇)。

制备9

7-叠氮基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

使用己烷洗涤氢化钾(约2勺, 35重量%于矿物油中)并轻轻倒出以去除油，添加四氢呋喃(60 mL)并冷却至-78℃。在硫酸钠上干燥2,4,6-三(1-甲基乙基)-苯磺酰叠氮化物(37.6 g, 121.6 mmol)的四氢呋喃(60 mL)溶液45分钟。轻轻倒出叠氮化物溶液至氢化钾悬浮液中时间为15分钟。去除冷却浴并使其升温至环境温度时间为45分钟；将干燥溶液放在一边。冷却二异丙基胺(17.0 mL, 121.0 mmol)和四氢呋喃(50 mL)溶液至-78℃，滴加正丁基锂(52.1 mL, 130.3 mmol)时间为5分钟。去除冷却浴并使其升温15分钟，然后冷却回至-78℃。插管至5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(34.3 g, 93.1 mmol)的四氢呋喃(400 mL)的-78℃溶液时间为5-10分钟。在-78℃下搅拌1小时，然后去除冷却浴并使其升温15分钟(至约-45℃)。冷却至-78℃并通过插管添加干燥的2,4,6-三(1-甲基乙基)-苯磺酰叠氮化物溶液时间为5-10分钟。去除冷却浴并使其升温至-5至0℃时间为1小时。在冰/水浴中冷却并滴加乙酸(26.7 mL, 465.3 mmol)时间为13分钟。使其升温至环境温度时间为65分钟并使用饱和碳酸氢钠溶液(1L)淬灭。使用乙酸乙酯(600 mL)和水(2L)稀释反应，分离层，使用乙酸乙酯(2 × 400 mL)从水溶液中反萃。使用饱和碳酸氢钠水溶液(500 mL)和盐水(500 mL)洗涤合并的有机物，在硫酸钠上干燥并浓缩。通过使用乙酸乙酯:己烷(0:100至100:0)洗脱的快速色谱纯化剩余物以产生油状物形式的标题化合物(39.8 g, 92.3 mmol, 99%)。MS(m/z):410(M+1)。

制备10

7-氨基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

向氮气净化的7-叠氮基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(39.8 g, 92.3 mmol)的乙醇(923 mL)溶液添加钯/碳(2.2 g, 1.0 mmol, 5%，于碳上)。排空/填充氢气三次并在在环境温度下在氢气(一个大气压)下搅拌过夜。在Celite?上过滤，使用乙醇和乙酸乙酯冲洗并浓缩以获得透明油状物形式的标题化合物(36.6 g, 89.9 mmol, 97%)。MS(m/z):384(M+1)。

制备11

N-[(1S)-2-[[5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

冷却7-氨基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(36.3 g, 89.9 mmol)、二氯甲烷(360 mL)、三乙胺(16.3 mL, 116.9 mmol)、3-羟基三唑并[4,5-b]吡啶(15.9 g, 116.9 mmol)和(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(22.5 g, 116.9 mmol)的混合物至0℃。添加1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(22.4 g, 116.9 mmol)并在5分钟之后使其升温至环境温度过夜。使用水(500 mL × 2)、饱和碳酸氢钠水溶液(2 × 300 mL)、盐水(300 mL)洗涤，然后在硫酸钠上干燥并浓缩。通过使用异丙醇:己烷(5:95至10:90)洗脱的快速色谱纯化剩余物以产生白色泡沫形式的标题化合物(43.14 g, 77.77 mmol, 86.50%)。MS(m/z):555(M+1)。

制备12

(2S)-2-氨基-N-[5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]丙酰胺

在5分钟内向N-[(1S)-2-[[5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(5.56 g, 10.0 mmol)和二氯甲烷(30 mL)的0℃溶液添加三氟乙酸(30 mL, 396.76 mmol)并使其升温并在环境温度下搅拌5小时。通过使用甲醇，随后乙酸乙酯:甲醇(2N氨水)(1:1)洗脱的SCX?柱(Isolute SCX-2 × 6)的快速色谱纯化剩余物以定量产率获得白色固体形式的标题化合物(3.48 g, 10.2 mmol)。MS(m/z):341(M+1)。

实施例1

4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺

在0℃下，向(7S)-7-氨基-5-(2-羟基乙基)-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(34.8 g, 129.2 mmol)的二氯甲烷(696 mL)悬浮液相继添加(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸(28.9 g, 135.7 mmol；基本上按照上述制备2中的描述制备)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(29.7 g, 155.1 mmol)，搅拌5分钟。添加1-羟基苯并三唑一水合物(24.7g, 155.1 mmol)，使其搅拌1小时，然后升温至环境温度。添加(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸(0.6 g, 2.6 mmol)并在环境温度下搅拌15分钟。添加水(600 ml)，滤出白色固体并分离滤液层。使用水(3 × 200 mL)洗涤有机层，在硫酸钠上干燥并浓缩以提供浅褐色泡沫。在50%甲基叔丁基醚/己烷(500 mL)中制浆物质，滤出固体，在高真空下干燥以获得65 g固体。

向前面获得的固体(65.0 g, 140.0 mmol)的甲醇(195 mL)的10℃溶液添加水(195 mL)和碳酸氢钾(14.0 g, 140.0 mmol)并在环境温度下搅拌29小时。浓缩并使用二氯甲烷(3 × 50 mL)萃取。使用水(3 × 20 mL)洗涤合并的有机物，在硫酸钠上干燥并浓缩。通过使用甲醇:二氯甲烷(98:2, 7N的氨水溶液)洗脱的快速色谱纯化剩余物。从50%甲基叔丁基醚/己烷中研磨物质，然后从甲基叔丁基醚(500 ml)中研磨。使用甲基叔丁基醚(200 mL)和己烷(200 mL)洗涤固体并在高真空下干燥固体以获得浅白色固体形式的标题化合物(42.0 g, 90.4 mmol, 65%)。MS(m/z):270(M+1)；[α]_Na²⁵= -153.40°(c=5.0, 甲醇)。

方法2:

向(2S)-2-氨基-N-[5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]丙酰胺(3.4 g, 10.0 mmol)、二氯甲烷(40 mL)、3-羟基三唑并[4,5-b]吡啶(1.8 g, 13.0 mmol)、4,4,4-三氟丁酸(1.9 g, 13.0 mmol)和三乙胺(1.8 mL, 13.0 mmol)的0℃混合物添加1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.50 g, 13.0 mmol)。使其搅拌并升温至环境温度过夜。添加水(40 mL)并在二氯甲烷(100 mL)和水(50 mL)之间分层。分离层，使用二氯甲烷从水溶液中反萃，使用饱和碳酸氢钠水溶液(2 × 100 mL)洗涤合并的有机层。使用二氯甲烷(25 mL)从碳酸氢盐层中反萃，在硫酸钠上干燥合并的有机层并浓缩。通过使用甲醇(2N氨水):二氯甲烷(0:100至5:95)洗脱的快速色谱纯化剩余物以产生3.77 g的非对映异构体混合物。在使用乙醇(0.2%二甲基乙胺):乙腈(0:100至100:0)洗脱的Chiralpak? AD柱上纯化物质以获得白色固体形式的标题化合物(1.7 g, 3.7 mmol, 37%)。MS(m/z):465(M+1)。

制备13

2-(2-溴苯基)乙酸甲酯

在氮气环境下混合2-溴苯基乙酸(500.0 g, 2.33 mol)与甲醇(5.0 L)。在20-35℃下滴加浓硫酸(185.8 mL)然后伴随搅拌升温至60-65℃时间为3-4小时。冷却反应混合物至45℃并在低于45℃减压下浓缩至体积为约750 mL。冷却反应混合物至10-30℃并添加二氯甲烷(2.5 L)。使用氢氧化钠(7%, 380.0 mL)调整pH至7-8并分离层。在低于45℃减压下浓缩有机相至干燥以获得黄色油状物形式的标题化合物(516.5 g, 97.0%)。

制备14

5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

在室温下，伴随搅拌混合2-(2-溴苯基)乙酸甲酯(1.0 kg, 4.36 mol)、二氧杂环己烷(11.0 L)和N-甲基-2-吡咯烷酮(7.0 L)。向混合物添加双戊酰二硼(1.2 kg, 4.58 mol)和乙酸钾(855.9 g, 8.72 mol)，然后通过传送氮气通过溶液2-3小时使溶液脱气。在氮气环境下装载[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷加合物(71.2 g, 97.2 mmol)，然后加热反应混合物至80-90℃时间为18-20小时以获得溶液形式的2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]乙酸甲酯，不经分离使用它。冷却反应混合物至15-25℃并添加2-氨基-3-溴吡啶(675.0 g, 3.90 mol)和磷酸三钾(2.41 kg, 11.3 mol)的水(3.0 L)溶液。通过传送氮气通过溶液2-3小时使溶液脱气，并添加[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷加合物(106.8 g, 130.8 mmol)，然后加热反应混合物至80-90℃时间为18-40小时。冷却反应混合物至50-60℃，并缓慢添加由饱和碳酸氢钠(13.0 L)、饱和氯化钠(13.0 L)和水(13.0 L)组成的溶液。在50-60℃下搅拌混合物2-3小时，冷却至15-25℃并搅拌另外18-20小时。过滤产生的固体并用水(2 × 2.0 L)洗涤滤饼。转移固体至干净反应容器，添加乙酸乙酯(5.0 L)，并加热混合物至60-70℃时间为2-3小时。冷却溶液至15-25℃并搅拌它1-2小时并过滤产生的固体。使用乙酸乙酯(2 × 750 mL)洗涤滤饼并在真空下干燥产生的固体以提供浅白色固体形式的标题化合物(644.0 g, 68.1%)。

制备15

5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

添加5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(33.8 g, 0.16 mol)的乙腈(340.0 mL)溶液并在20-30℃下搅拌0.5-1小时。添加碳酸铯(104.6 g, 0.32 mol)和(2-溴乙氧基)-叔丁基二甲基甲硅烷(42.2 g, 0.18 mol)并加热反应混合物至70-80℃时间为18-20小时。冷却反应混合物至20-25℃并通过硅藻土(50.6 g)过滤。使用乙腈(2 × 50.6 mL)洗涤滤饼并在减压下浓缩滤液以达到约67.5 mL的总体积。添加甲苯(152 mL)、活性碳(2.53 g)并加热混合物至60-70℃时间为1-2小时。冷却混合物至25-35℃并在硅藻土(50.6 g)上过滤反应混合物。使用甲苯(17.0 mL)冲洗滤饼并在减压下浓缩以获得浅褐色油状物形式的标题化合物，其静置时结晶(56.8 g, 92.2%)。

制备16

5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7-羟基亚氨基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

混合5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(30.0 g, 0.08 mol)和甲苯(300.0 mL)，冷却反应混合物至-10-0℃。添加叔丁醇钾(18.2 g, 0.16 mol)、亚硝酸异戊酯(13.34 g, 0.11 mol)，然后搅拌3-5小时。转移反应混合物至乙酸乙酯(210 mL)和水(510 mL)的冷却(0-5℃)的两相溶液并搅拌15-30分钟。升温反应混合物至15-25℃并分离层。使用另外的乙酸乙酯(120 mL)和甲基叔丁基醚(120 mL)萃取水层并混合有机层。在减压下浓缩有机物至约60-90 mL的溶液体积，然后添加甲苯(240 mL)和乙酸乙酯(75 mL)。通过硅胶(45.0 g)过滤溶液，使用甲苯(210 mL)和乙酸乙酯(60 mL)的混合物冲洗硅胶，并在减压下浓缩滤液至约75 mL的体积。添加庚烷(120 mL)并浓缩混合物至约60 mL的体积并过滤产生的固体。使用庚烷(25 mL)洗涤滤饼并在真空下干燥以提供黄色固体形式的标题化合物(28.3 g, 72.5%)。

制备17

7-氨基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮

在氮气环境下，混合5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7-羟基亚氨基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(206.0 g, 0.52 mol)和四氢呋喃(2.3 L)进入高压釜中。向反应混合物添加雷尼镍(232.0 g, 1.13 wt/wt当量)并引入氢气环境(87 psi)。在60-65℃下搅拌反应混合物24小时。在硅藻土上过滤混合物并使用四氢呋喃(500 mL)洗涤助滤剂。浓缩滤液以获得褐色油状物形式的标题化合物(196.0 g, 93.2%)。MS(m/z):384(M+1)。

制备18

N-[(1S)-2-[[5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

在氮气环境下，混合7-氨基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-6-酮(166.0 g, 0.43 mol)、二氯甲烷(2.2 L)和L-Boc-丙氨酸(106.4 g, 0.56 mol)。添加羟基苯并三唑(1.46 g, 10.8 mmol)和三乙胺(102.5 mL, 0.74 mol)，保持内温低于30℃。分批添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(128.2 g, 0.67 mol)并在20-30℃下搅拌16-18小时。通过使用二氯甲烷(498 mL × 2)洗脱的硅胶色谱(300 g硅胶)纯化反应混合物。混合二氯甲烷溶液并使用水(2 × 3.3 L)洗涤它。在减压下浓缩有机相至300-400 mL的体积并添加乙酸乙酯(664.0 mL)。在减压下浓缩混合物至300-400 mL的体积并添加乙酸乙酯(664 mL)。在减压下浓缩混合物至300-400 mL的体积，并添加乙酸乙酯(1.3 L)。添加四正丁基氟化铵三水合物(149.4 g, 0.47 mol)并在20-30℃下搅拌16-18小时。添加氯化钠水溶液(20%, 1.6 L)，分离层，并使用氯化钠水溶液(20%, 1.6 L)再次洗涤有机相。浓缩有机物至约800-900 mL的体积并在20-30℃下搅拌混合物12-16小时。过滤产生的固体，使用乙酸乙酯(91.3 mL)洗涤滤饼。使用乙酸乙酯(2 × 500 mL)洗脱的硅胶色谱(300 g硅胶)纯化滤液以提供黄色油状物形式的标题化合物(82.6 g, 85.2% de, 100%ee, 51.2%产率)。MS(m/z):441(M+1)。

制备19

(2S)-2-氨基-N-[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]丙酰胺

在氮气环境下，混合N-[(1S)-2-[[5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(54.0 g, 0.12 mol)和乙腈(212.7 mL)。滴加盐酸(317.5 mL, 4N, 1.27 mol)以保持内温低于30℃，并在20-30℃下搅拌反应混合物16-18小时。添加水(324.0 mL)和二氯甲烷(430 mL)并分离层。丢弃有机层并向水相添加二氯甲烷(645 mL)并使用氢氧化钠水溶液(20%, 252 mL)调整pH至约10。分离层，使用另外的二氯甲烷(2 × 430 mL)萃取水层，并混合有机相。在低于45℃在减压下浓缩有机物至约130-150 mL的体积，并添加四氢呋喃(322 mL)。在低于45℃在减压下浓缩溶液至约200-220 mL的体积，并添加另外的四氢呋喃(213 mL)。在减压下浓缩反应混合物至约250-270 mL的体积，并加热至60-65℃时间为2-3小时。缓慢冷却反应混合物至5-15℃并搅拌5-8小时。过滤产生的固体，使用乙酸乙酯(56 mL)洗涤滤饼。转移固体至干净的反应容器，添加乙酸乙酯(150 mL)，并加热至60-65℃时间为2-3小时，然后缓慢冷却溶液至5-15℃。在该温度下搅拌2-3小时并通过过滤收集产生的固体。使用乙酸乙酯(45 mL)洗涤滤饼并在低于60℃在减压下在烘箱中干燥固体以提供浅白色固体形式的标题化合物(21.0 g, 99.2%de, 100%ee,51.0%产率)。MS(m/z):341(M+1)。

实施例2

4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺水合物

在氮气环境下混合(2S)-2-氨基-N-[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]丙酰胺(45.0 g, 132.2 mmol)和二甲基甲酰胺(452.9 mL)。冷却至0-5℃并添加N-乙基二异丙基胺(77.4 mL, 444.0 mmol)、4,4,4-三氟丁酸(19.9 g, 139.3 mmol)和羟基苯并三唑一水合物(22.3 g, 153.1 mmol)。搅拌溶液5-10 min并一次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(30.6 g, 159.6 mmol)。升温反应混合物至20-25℃并搅拌1-2小时。添加乙酸乙酯(1.4 L)和水(1.8 L)并搅拌0.5-1小时。分离相并使用碳酸氢钠水溶液(5%, 1.0 L)洗涤有机层并在减压下浓缩溶液以获得200-300 mL的体积。添加乙醇(522 mL)并在减压下浓缩溶液以获得200-300 mL的体积。重复三次。添加乙醇(180 mL)和5%碳酸钾溶液(34.6 mL)并在20~25℃下搅拌0.5-1小时。添加水(667 mL)和4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟基乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺水合物(0.4 g, 0.86 mmol)的晶种(晶种能从前面批次的产物中获得的固体产生，或能使用本领域技术人员通常已知和使用的其它方法如小等份重结晶获得)并在20-25℃下搅拌2-3小时。过滤并使用乙醇(63 mL)和水(42 mL)的混合物洗涤滤饼两次。在低于40℃在减压下在烘箱中干燥产生的固体以提供白色至浅白色固体形式的标题化合物(41.9 g, 99.6%de, 100%ee, 65.3%产率)。MS(m/z):465(M-H₂O+1)。

实施例2的XRPD

在35 kV和50 mA下运行的装备有CuKα源(λ = 1.54060 ?)和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上获得结晶固体的XRPD图。在4至40°的2θ之间扫描样品，2θ的步长为0.0087°且扫描速率为0.5秒/步，并且具有0.6 mm的散度，5.28 mm固定防散射和9.5 mm检测器狭缝。将干燥粉末装在石英样品保持器上并使用载玻片获得光滑表面。晶体学领域熟知对于任意给定的晶形，衍射峰的相对强度可能由于因素如晶体形态和晶习产生的择优取向而变化。在存在择优取向效应的情况下，峰强度改变，但多晶型物的特征峰位置不变。(例如，参见U. S. Pharmacopia 33 - National Formulary 28 Chapter < 941> Characterization of Crystalline Solids by X-ray Powder Diffraction (XRPD) 官方10月1日，2010-2月1日，2011)。此外，晶体学领域还熟知对于任意给定的晶型，角峰位置可能轻微变化。例如，由于分析样品的温度或湿度的变化，样品替换或存在或不存在内标，峰位置可能移动。在目前的情况下，± 0.2 (2θ)的峰位置变化将考虑这些潜在的变化而不妨碍指出的晶形的明确识别。可基于区别峰(单位为°，2θ)的任何独特组合进行晶形的确定，通常更多的主峰。在环境温度(19-25℃)和相对湿度(20-60%)下收集晶形衍射图。

因此，使用CuKα辐射通过XRPD图表征实施例2化合物的制备样品，其具有下表1中描述的衍射峰(2θ值)。形式为结晶并且包含2θ为22.97°的峰以及一个或多个选自2θ为11.96°、18.81°、20.78°和21.07°的峰，具有0.2°的衍射角公差。

表1：实施例2的X射线粉末衍射峰：

峰角(2θ°)强度%17.5730.829.1772.3311.9650.4413.06324.6514.03621.5614.3522.9715.22332.4816.84515.8917.1211.81017.82823.41118.48110.61218.80925.31319.39611.71420.102281520.77844.21621.06863.81722.71336.81822.9671001923.4077.42023.6252.42124.115.32224.772492325.0286.52425.31111.52525.8681.82626.58614.62727.97925.62828.276.62929.0333.63029.5414.33129.912.23230.5569.93330.76611.53431.7031.33532.18610.13633.0151.43733.8223.43834.00723934.4511.14034.7280.54135.3812.74235.6015.84336.0523.24436.2723.54536.8667.24637.730.84738.2320.24838.6081.24939.1391.5

实施例2的固态NMR

使用在100.622 MHz的碳频率下运行并且装备有Bruker 4 mm三重共振探针(K299551)的Bruker Avance II 400 MHz NMR光谱仪(Lilly tag K299547)获得¹³C交叉极化/魔角旋转(CP/MAS) NMR(固态NMR或SSNMR)光谱。使用TOSS边带抑制以及使用SPINAL64去耦(70.8瓦特)和RAMP100成形H-核CP脉冲的交叉极化。获取参数如下：2.5 μs的90°质子射频脉冲宽度，接触时间为3.5 ms，脉冲重复时间为5 s，MAS频率为10 kHz，光谱宽度为30 kHz，采集时间为34 ms且扫描次数为10,587。化学位移参照单独实验中的金刚烷(δ = 29.5 ppm)。¹³ C NMR(固态)：δ(ppm) 18.65, 27.52, 28.76, 47.66, 49.96, 55.02, 58.88, 122.87, 126.49, 129.73, 131.37, 132.31, 137.28, 145.01, 149.17, 168.53, 170.30, 175.55。

实施例2的Karl Fischer滴定

使用Brinkmann Methrohm 756 KF电量计获得Karl Fischer滴定。使用Hydranol?作为水标准重复两次测定对照标准。重复三次运行样品并记录水的平均百分比以测定样品中水的量。实施例2的Karl Fischer滴定平均结果为3.9%水。实施例2中1摩尔当量的水的理论百分比为3.7%。

癌症越来越被认为是疾病的异类集合，所述疾病的开始和发展通过一种或多种调节细胞和组织微环境中的DNA修复、基因组稳定性、细胞增殖、细胞死亡、粘附、血管生成、侵入和转移的基因的异常功能诱导。“癌症”基因的变异或异常功能可能由天然存在的DNA多态性、基因组拷贝数的变化(通过扩增、缺失、染色体缺失或复制)、基因和染色体结构的变化(通过染色体易位、倒位或其它导致失控的基因表达的重排)和点突变产生。癌肿瘤可能由一种异常基因功能诱导，并由相同的异常基因功能维持，或者维持和发展由另外的异常基因功能加重。

除了上述遗传染色体畸变之外，各个癌症还可包括基因组的表观遗传修饰，包括DNA甲基化，基因组印迹和通过乙酰化、甲基化或磷酸化进行的组蛋白修饰。表观遗传修饰可在恶性肿瘤的诱导和/或维持中发挥作用。

人癌症中细胞遗传学异常的广泛目录已被汇集并被在线维护和定期更新(参见The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US National Cancer Institute(NCI) Cancer Genome Anatomy Project(CGAP) Web site: http://cgap.nci.nih.gov)。数据库包括至少一些本发明的恶性肿瘤的染色体畸变。Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project维护了与肿瘤发生有因果联系的所有人基因的详细在线“癌症基因普查”(参见http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census)以及人癌症中的体细胞突变的COSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)数据库(参见http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic)。包含与多种癌症有因果联系的细胞遗传学变化的丰富信息的另外来源为Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology (http://atlasgeneticsoncology.org//Anomalies/Anomliste.html#MDS)。这些数据库还包括至少一些本发明的恶性肿瘤的染色体畸变。

通过活组织检查、免疫表型和其它试验诊断癌症恶性肿瘤是已知和常规使用的。除了高分辨率染色体显带和高级染色体成像技术之外，能通过细胞遗传学分析如荧光原位杂交(FISH)、核型分析、光谱核型分析(SKY)、多重FISH(M-FISH)、比较基因组杂交(CGH)、单核苷酸多态性阵列(SNP芯片)和本领域技术人员已知和使用的其它诊断和分析试验确定癌症疑似病例中的染色体畸变。

Notch的致癌作用最早在人T-细胞白血病中报道，其涉及Notch1胞内结构域易位至T-细胞受体-β启动子区域，这导致Notch1胞内结构域的过度表达(Grabher等人，Nature Review Cancer，2006(6):347-359；Weng等人，Science，2004(306):269-271)。Notch1胞内结构域在小鼠造血祖细胞中的过度表达导致小鼠表现与人类相似的T-细胞急性淋巴细胞白血病。除了T-细胞急性淋巴细胞白血病之外，有越来越多的证据表明Notch信号通过包括受体扩增和配体和/或受体的过度表达的多重机制而在其它癌症中是致癌的，所述癌症包括急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病和红白血病。由于配体和/或受体的突变或过度表达产生的异常组成型Notch信号转导还与许多实体瘤恶性肿瘤有关，所述实体瘤恶性肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌(Park等人，Cancer Research，2006(66):6312-6318)、黑素瘤(Gast等人，Genes, Chromosomes & Cancer，2010(49):733-745)、肺癌、非小细胞肺癌(Westhoff等人，PNAS，2009(106):22293-22298)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、结直肠癌、头颈癌、子宫颈癌、前列腺癌、肝癌、鳞状细胞癌(口腔)、皮肤癌和成神经管细胞瘤(Ranganathan等人，Nature Review Cancer，2011(11):338-351和补充信息S1(表))。Notch信号转导的抑制显示为向由组成型Notch信号转导通路的异常激活诱导的疾病的癌症患者提供治疗益处的有吸引力的目标。Shih等人，Cancer Research，2007(67)1879-1882。

下列体外和体内研究证明化合物1对多种特定癌症细胞系的Notch通路信号转导抑制活性和功效。这些试验通常被本领域技术人员公认为人临床化疗活性的指示。认为通过γ-分泌酶抑制Notch胞内结构域裂解对各个Notch 1、Notch 2、Notch 3和Notch 4受体有效。可基本上如下所述或通过产生相似数据的相似试验进行证实Notch通路信号转导抑制活性和功效的试验。

Notch1 N1ICD核积累细胞成像试验

在96孔板中，将HEK293ΔE12细胞(设计HEK293细胞稳定表达小鼠Notch1 cDNA，其编码氨基酸1703-2183、NP_032740.3，其中23个氨基酸信号肽序列，MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR(SEQ ID NO:1)，在它的N-端)以5000细胞/孔制板，在37℃，5% CO₂下在达尔伯克改良伊格尔培养基-具有5%胎牛血清的高葡萄糖中孵育24小时。用试验化合物处理细胞，在1000 nM至0.05 nM的范围内以1:3稀释在10点给予，并且最终二甲基亚砜(DMSO)浓度为0.2%。在24小时处理之后，相继通过下列步骤处理细胞板：在室温(RT)下使用100μl/孔PREFER?固定剂固定细胞30分钟；在室温下使用100 μl/孔 0.1% TRITON? X100（于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中）渗透细胞20 min；每个使用100 μl/孔 PBS洗涤3次；以1:2000添加在具有1%牛血清白蛋白的PBS中的50 μl/孔兔抗N1ICD(Notch1胞内结构域)抗体并在37℃下孵育1.5小时；每个使用100 μl/孔 PBS洗涤3次；使用在具有1%牛血清白蛋白的PBS中的以1:1000稀释的50 μl/孔山羊抗兔IgG Alexa 488孵育并在37℃下孵育1小时；每个使用100 μl/孔 PBS洗涤3次并添加100 μl/孔的具有50μg/ml RNAse的15 μM碘化丙啶达30分钟以染色核。使用ACUMEN EXPLORER?激光扫描荧光微孔板细胞分析仪(TTP LABTECH LTD)扫描板以测定总细胞核计数/孔和总核面积/孔，荧光为655 nm-705 nm(DNA结合碘化丙啶的发射)和在505 nm-530 nm的与核区域中的N1ICD结合的抗体的荧光。主要试验产物为核N1ICD的总荧光与总核面积的比，归一化核N1ICD信号。以相对0.2% DMSO对照细胞的%细胞数形式收集相对细胞毒性分析。使识别裂解的Notch1或N1ICD的抗体成为相应于在Val1744处人Notch1的氨基端裂解位点的人肽。在未处理的对照细胞中，从Notch1产生的N1ICD在核中易位和积累。当通过Notch 1裂解抑制化合物处理细胞时，核N1ICD的信号减少。通过对核N1ICD信号曲线拟合为四参数对数测定浓度反应和IC₅₀，同时在相同的曲线图中绘制%细胞数用于细胞毒性分析。基本上如上所述进行试验，化合物1的平均IC₅₀为0.41 nM(n=7)。化合物不影响细胞数，高达1000 nM浓度。

这些数据证明化合物1具有对Notch 1的亲合力并且抑制Notch 1胞内结构域细胞信号转导肽的细胞内积累。

人肿瘤细胞系中N1ICD裂解的抑制

为了评价化合物1的抑制N1ICD裂解的能力的效力，使用几种人肿瘤细胞系。A2780是人卵巢细胞系(Sigma-Aldrich, No. 93112519)；MIA PaCa-2是人胰腺细胞系(ATCC No. CRL-1420)；BxPC-3是人胰腺细胞系(ATCC No. CRL-1687)；SW480是人结直肠细胞系(ATCC No. CCL-228)；HCT 116是人结直肠细胞系(ATCC No. CCL-247)；DLD-1是人结直肠细胞系(ATCC No. CCL-221)；MDA-MB-231是人乳腺细胞系(ATCC No. HTB-26)；U-87 MG是人成胶质细胞瘤细胞系(ATCC No. HTB-14)；A375是人恶性黑素瘤细胞系(ATCC No. CRL-1619)；CCRF-CEM是人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系(ATCC No. CCL-119)；SUP-T1是人T-细胞淋巴细胞白血病细胞系(ATCC No. CRL-1942)；K-562是特征为存在由Bcr和Abl1基因组成的融合转录物的人慢性髓细胞白血病(CML)细胞系(ATCC No. CCL-243)；Jurkat, Clone E6-1是人急性T-细胞白血病细胞系(ATCC No. TIB-152)；MOLT-3是人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系(ATCC No. CRL-1552)；MOLT-4是人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系(ATCC No. CRL-1582)；HEL 92.1.7是人红白血病细胞系(ATCC No. TIB-180)。从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC)以规定的ATCC编号获得各个细胞系，除了A2780细胞系之外，其从Sigma-Aldrich以规定的目录号获得。细胞在环境湿度，5% CO₂，37℃下在它们各自的培养基中生长。A2780人卵巢癌的细胞培养基为添加了2 mM L-谷氨酰胺、0.01 mg/ml胰岛素和10%肽牛血清(FBS)的具有2.05 mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640(没有酚红)；对于HCT 116人结直肠癌为具有1.5 mM L-谷氨酰胺、0.075%碳酸氢钠和10% FBS的McCoy’s 5A；对于SW480人结直肠癌为具有2.05 mM L-谷氨酰胺、20 mM HEPES和10% FBS的RPMI-1640；U-87 MG人成胶质细胞瘤为具有2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM非必需氨基酸(NEAA)、1 mM丙酮酸钠和10% FBS的最小必需培养基/Earl氏平衡盐溶液；对于MIA PaCa-2人胰腺癌为没有丙酮酸钠，具有高葡萄糖(4500 mg/ml)、4 mM L-谷氨酰胺、2.5%马血清和10% FBS的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)；对于K-562人CML为具有高葡萄糖(4500 mg/ml)、4 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、0.1 mM NEAA、1 mM 丙酮酸钠和10% FBS的DMEM；对于Jurkat, Clone E6-1人急性T细胞白血病为具有2.05 mM L-谷氨酰胺、2.5 g/L 葡萄糖、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、0.075% 碳酸氢钠和10% FBS的RPMI-1640；对于A-375人恶性黑素瘤和MDA-MB-231人乳腺癌为具有高葡萄糖(4500 mg/ml)、4 mM L-谷氨酰胺和10% FBS的DMEM；对于BxPC-3人胰腺癌、DLD-1人结直肠腺癌、SUP-T1人淋巴细胞白血病、MOLT-3人ALL、Molt-4人ALL、CCRF-CEM人ALL和HEL 92.1.7人红白血病为具有2.05 mM L-谷氨酰胺、2.5 g/L 葡萄糖、20 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠和10% FBS的RPMI-1640。当80-90%融合时，使用化合物处理细胞，在50 nM至0.0025 nM范围内以1:3稀释在10点给予，并且最终二甲基亚砜(DMSO)浓度为0.01%。在24小时处理之后，基本上相继通过下列步骤处理细胞板：在胰蛋白酶化之后收集细胞，使用冰冷的PBS洗涤一次，并在100 μl包含1XComplete片(Roche Complete? No. 11 697 498 001)和1X蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich P8340)的冰冷XY裂解缓冲液(25 mM Tris pH 7.5、10 μg/ml胰蛋白酶/糜蛋白酶抑制剂、10 μg/ml抑肽酶、60 mM β-甘油磷酸、1% Triton? X-100、10 mM NaF、2.5 mM焦磷酸盐、150 mM NaCl、15 mM 乙二胺四乙酸(EDTA) pH 8.0、5 mM 乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA) pH 8.0、1 mM钒酸钠、10 μg/ml 亮抑肽酶、1 mM二硫苏糖醇、1 μM微囊藻素LR、10 μg/ml N-对甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(TPCK)、2 mM Nα-对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(TAME)、15 mM 4-硝基苯基磷酸二(三)盐(PNPP)、0.1 mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰基氟盐酸盐(AEBSF)、5 mM苄脒、1 μM 冈田酸)中裂解。将裂解物在冰上孵育15 min并每5 min短暂涡流并在冰上超声处理1分钟。样品在4℃eppendorf离心机中以30,000 rpm旋转30分钟并收集80 μl的上清液用于分析。使用Thermomax?读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)，用Pierce BCA蛋白质检验试剂盒?(Thermo Scientific, Rockford, IL)测定总蛋白质浓度。使用定制N1ICD酶联免疫吸附试验(ELISA)测定N1ICD水平。使用裂解的Notch1(Val1744)-特异性定制兔单克隆抗体捕获分析物并使用C-端Notch1 SULFO-TAG?(Meso Scale Diagnostics, Gaithersburg, Maryland)多克隆羊抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN)检测。在包含1X Complete片(Roche Complete? mini No. 11 836 153 001)和1X蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich P8340)的冰冷ELISA tris裂解缓冲液R60TX(Meso Scale Diagnostics, Gaithersburg, Maryland)中将裂解物稀释至1 μg/μl，并将25 μl加入至ELISA板。在室温下进行各个25 μg蛋白质裂解物的孵育1小时以捕获分析物和检测抗体。在Sector Imager 6000?(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland)上读板。背景去除的N1ICD归一化为总蛋白质并且表示为相对于溶媒处理组的%抑制。使用GraphPad Prism? 4软件通过拟合浓度反应数据为“4-参数S形剂量反应(可变斜率)”模型测定IC₅₀值。各个肿瘤细胞系中化合物1的IC₅₀值在表1中示出。

表1

细胞系IC₅₀(nM)A27801.03MIA PaCa-20.71BxPC-30.39SW4800.10HCT 1160.72DLD-10.98MDA-MB-2310.50U-87 MG0.28A-3750.48CCRF-CEM0.76SUP-T11.24K-5620.74Jurkat5.95MOLT-30.61MOLT-40.74HEL 92.1.70.23

表1中的数据证实化合物1通过抑制γ-分泌酶活性抑制N1ICD信号转导肽产生，并因此抑制在特定人肿瘤细胞系中N1ICD信号转导肽积累的能力的效力。

体内功效和靶标抑制研究

动物研究

为了评价化合物1对抑制Notch处理药效学(PD)的体内功效和影响，使用几种细胞系-和患者-衍生的异种移植模型。通过皮下注射在6-8周大的无胸腺裸雌性小鼠(Harlan Laboratories)的后腿中植入1:1基质胶混合物(0.2 mL体积)中的A2780(2 × 10⁶)、SW480(6 × 10⁶)、HCT 116(6 × 10⁶)、U-87 MG(6 × 10⁶)和A-375(10 × 10⁶)细胞。通过皮下注射在6-8周大的CD1 nμ/nμ雌性小鼠(Charles River Laboratories)的后腿中植入1:1基质胶混合物(0.2 mL体积)中的K-562(6 × 10⁶)细胞。通过皮下注射在6-8周大的CB17严重联合免疫缺陷雌性小鼠(Taconic Farms)的后腿中植入1:1基质胶混合物(0.2 mL体积)中的HEL 92.1.7(7 × 10⁶)。将患者衍生的肿瘤切碎成1-2 mm块并与0.2 ml体积的基质胶(1:1)混合并通过皮下注射在6-8周大的无胸腺裸雌性小鼠(Harlan Laboratories)的后腿中植入。患者衍生的肿瘤模型包括：人成胶质细胞瘤(EL2144)、人三阴性浸润性导管乳腺癌(EL1997)和人结肠癌(EL1989, EL 1986和EL 2056)，样品为在患者同意之后和IU Health, Methodist Hospital, Indianapolis, Indiana, USA 46206批准的医院获得。总共7至10只小鼠用于各个组。就在移植A2780、SW480、HEL 92.1.7、A-375、K-562和患者衍生的肿瘤模型之前，辐射动物(450全身辐射)。小鼠自由采食正常食物。当肿瘤尺寸达到150 ± 50 mm³时，从口服给药(灌胃) 0.2 mL体积的化合物或溶媒(1% Na-CMC的0.25% Tween-80溶液)开始治疗。在治疗后的指定时间点，通过CO₂窒息和颈椎脱位将动物致死。去除肿瘤并用于PD反应分析。随时间监测肿瘤生长和体重以评价毒性的效力和症状。每周进行两次肿瘤的二维检测并基于下列公式计算肿瘤体积：(肿瘤体积) = [(L) ×(W2) ×(Π/6)]，其中L为中间轴长度且W为中间轴宽度。将肿瘤体积数据转换为log等级以平衡时间和治疗组之间的差异。使用SAS?软件(版本8.2)中的MIXED?程序通过时间和治疗的双因素重复测量方差分析来分析log体积数据。重复测量的相关模型为空间功效。在各个时间点比较治疗组与对照组。MIXED?程序还单独用于各个治疗组以计算各个时间点的校正平均值和标准误差。两种分析解释各个动物内的自相关和当在早期从研究中去除具有大肿瘤的动物时发生的数据丢失。绘制各个治疗组对时间的校正平均值和标准误差。抗肿瘤活性表示为肿瘤生长抑制百分比(TGI %)并通过比较治疗组与溶媒治疗组中的肿瘤体积计算。基本上如上所述测定化合物1的肿瘤生长抑制百分比(%TGI)和统计显著值(p值)并在表2中概述。

　N1ICD分析

为了评价肿瘤中的N1ICD水平，从冷冻肿瘤中切下约75 mg并在均质化(记录实际质量)之前切碎。将冷冻肿瘤样品转移至裂解Matrix-D?管并以75 mg/ml缓冲液的质量:体积比重新悬浮在包含1X Complete片(Roche Complete? No. 11697 498 001)和1X蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich P8340)的冰冷XY裂解缓冲液(25 mM Tris pH 7.5、10 μg/ml胰蛋白酶/糜蛋白酶抑制剂、10 μg/ml抑肽酶、60 mM β-甘油磷酸、1% Triton? X-100、10 mM NaF、2.5 mM焦磷酸盐、150 mM NaCl、15 mM 乙二胺四乙酸(EDTA) pH 8.0、5 mM 乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA) pH 8.0、1 mM钒酸钠、10 μg/ml 亮抑肽酶、1 mM二硫苏糖醇、1 μM微囊藻素LR、10 μg/ml N-对甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(TPCK)、2 mM Nα-对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(TAME)、15 mM 4-硝基苯基磷酸二(三)盐(PNPP)、0.1 mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰基氟盐酸盐(AEBSF)、5 mM苄脒、1 μM 冈田酸)中。在4℃下将组织在Fast Prep FP120均质机(Thermo Scientific, Rockford, IL)中以6.0的速率均质30秒，随后在冰上孵育15分钟。将该操作重复总共2-3个循环直至均质完全。将裂解物在4℃eppendorf离心机中以30,000 rpm旋转15分钟以去除碎片。去除400 μl的上清液并转移至新的eppendorf管并使其进行冷冻/解冻循环。将样品在4℃eppendorf离心机中以30,000 rpm再旋转30分钟并收集120 μl的上清液用于分析。使用Thermomax?读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)，用Pierce BCA蛋白质检验试剂盒?(Thermo Scientific, Rockford, IL)测定总蛋白质浓度。使用定制N1ICD ELISA测定N1ICD水平。使用裂解的Notch1(Val1744)-特异性定制兔单克隆抗体捕获分析物并使用C-端Notch1 SULFO-TAG?(Meso Scale Diagnostics, Gaithersburg, Maryland)多克隆羊抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN)检测。在包含1X Complete片(Roche Complete? mini No. 11 836 153 001)和1X蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich P8340)的冰冷ELISA tris裂解缓冲液(R6OTX)(Meso Scale Diagnostics, Gaithersburg, Maryland)中将裂解物稀释至2 μg/μl，并将25 μl加入至ELISA板。在室温下进行各个50 μg蛋白质裂解物的孵育1小时以捕获分析物和检测抗体。在Sector Imager 6000?(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland)上读板。背景去除的N1ICD归一化为总蛋白质并且表示为相对于溶媒处理组的%抑制。基本上如上所述分析在最后给予化合物1之后4小时收获的肿瘤中通过Dunett方法测定的N1ICD%抑制和统计显著性(p值)并在表2中概述。

表2中的数据证实在各种人肿瘤的异种移植模型中化合物1的肿瘤生长抑制和N1ICD裂解抑制。表2中的数据还提供了与表1中描述的功能活性细胞数据的体内相关性。

代谢和排泄

显示低的或没有细胞色素P450(CYP450)代谢和调节的化合物具有减少的与患者服用的其它药物的不良相互作用的可能性，所述不良相互作用可能导致剂量改变或需要完全停止药物。当CYP450代谢导致患者对活性代谢物的明显暴露时，功效和安全问题可能由与多种活性物质的贡献有关的较大可变性产生；因此，通常缺乏活性代谢物的药物是优选的。显示低的或没有CYP450代谢和调节的治疗剂是期望的并且在患者中并且对于患者可能具有优异的安全特性。Lynch等人，Am. Fam. Physician, 76, 391(2007)。仅基于活性药剂的结构不能预测CYP450酶相互作用的潜能。

化合物1不是大多数CYP450酶的抑制剂或诱导物并且不被对氧化CYP450代谢最佳的肝微粒体代谢至任何明显程度。在活体大鼠和狗中，在循环或排泄物中没有观察到大量氧化代谢物。因此，化合物1具有低的与其它药物的基于CYP450的相互作用的可能性，所述相互作用能导致治疗癌症的患者中的剂量调整或需要限制或停止额外的药物。

在胆管插管的大鼠中体内评价化合物1以研究全身药代动力学(PK)、排泄和代谢。体内51%的IV剂量被未改变地排泄，在尿中占优势，具有低的(2%的母体)全身暴露于活性N-脱烷基化代谢物，4,4,4-三氟-N-[(1S)-1-甲基-2-氧代-2-[[(7S)-6-氧代-5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂环庚三烯-7-基]氨基]乙基]丁酰胺。对于代谢物的大鼠血浆分析，表明没有额外循环代谢物。胆管完好狗中另外的研究还支持通过母体化合物的排泄进行的明显清除以及没有大量循环活性代谢物。

化合物1的总代谢和排泄数据证实期望的清除机制(母体化合物的尿排泄和酰胺水解为惰性和非循环片段，其在对于CYP450代谢最佳的肝微粒体的孵育中没有形成)以及没有大量活性循环代谢物。

在临床环境中，临床前观察到的化合物1的清除性质是期望的。已知主要通过氧化代谢排除的化合物显示由于与伴随药物和某些果汁/草药的药物相互作用导致的可变暴露、肝疾病和酶活性的患者间差异。多重清除机制是优选的，因为他们减小在任何一种排除途径发生的药物相互作用的影响。因此，通过排泄(51%)和代谢(酰胺水解)二者进行化合物1的清除，而不产生大量活性循环代谢物对于患者是有益的。总之，这些清除性质减少了临床剂量调整的可能性，以及最小化与大量活性循环代谢物，伴随药物的给药和CYP450活性的患者间差异有关的安全和功效担忧。