新型泌酸调节肽衍生物和包含该泌酸调节肽衍生物的用于治疗肥胖的药物组合物

摘要

本发明涉及对胰高血糖素样肽-1受体和胰高血糖素受体显示比天然泌酸调节肽更优异的活性的新型肽和包括该肽作为活性成分的用于预防或治疗肥胖的组合物。不同于天然泌酸调节肽，本发明的新型肽减少食物摄入，抑制胃排空，和促进脂解，并降低副作用，还显示出优异的受体激活作用。因此，其可安全并且有效地广泛用于治疗肥胖。

说明书

技术领域

本发明涉及对类胰高血糖素肽-1受体和胰高血糖素受体显示高于天然泌酸调 节肽的优异活性的新型肽、和包括该肽作为活性成分的用于预防或治疗肥胖的组 合物。

背景技术

近来，经济的增长和生活方式的变化导致饮食习惯改变。当代人超重和肥胖 率升高的主要原因是食用高卡路里食品如快餐食品和缺乏锻炼。世界卫生组织 （WHO）估测，世界上10亿以上人超重，并且其中至少3亿是临床上的肥胖。具 体地，在欧洲每年250,000人并且在世界上每年250万以上人因超重而死亡（世界 卫生组织，Global Strategy on Diet，Physical Activity and Health，2004）。

超重和肥胖使血压和胆固醇水平增加，从而引起多种疾病如心血管疾病、糖 尿病和关节炎发生或恶化，并且也是儿童或青少年以及成年人动脉硬化、高血压、 高脂血或心血管疾病发病率升高的主要原因。

肥胖是引起世界上多种疾病的严重病症。据认为其通过个人努力克服，并且 还认为肥胖患者缺乏自制。但是，肥胖难以治疗，因为肥胖是涉及食欲调节和能 量代谢的复杂病症。就肥胖治疗而言，应当结合肥胖患者的努力治疗与食欲调节 和能量代谢有关的异常表现。已经做出多种尝试以开发能够治疗异常表现的药物。 基于这些努力，药物如利莫那班（Rimonabant，Sanofi-Aventis）、西布曲明 （Sibutramin，Abbott）、Contrave（Takeda）和奥利司他（Orlistat，Roche）已被开 发，但其具有严重副作用或极微弱抗肥胖效果的缺陷。例如，据报告，利莫那班 （Sanofi-Aventis）显示中枢神经病症的副作用，西布曲明（Abbott）和Contrave （Takeda）显示心血管副作用，和奥利司他（Roche）显示服用1年仅减重4kg。 不幸地，没有可为肥胖患者安全配药的肥胖治疗剂。

已进行多项研究以开发不具有常规抗肥胖药物问题的肥胖治疗剂。近来，胰 高血糖素衍生物已经获得大量关注。当血液中的葡萄糖水平由于其他药物或疾病、 激素或酶缺乏而下降时，胰腺产生胰高血糖素。胰高血糖素刺激糖原在肝脏中分 解，并且促进葡萄糖释放，以使血糖水平升高至正常范围。除增加血糖水平的作 用以外，胰高血糖素还抑制食欲和激活脂肪细胞的激素敏感性脂酶（HSL），以促 进脂解，从而显示抗肥胖作用。胰高血糖素衍生物之一，类胰高血糖素肽-1 （GLP-1），正被开发为糖尿病患者的高血糖治疗剂，并且其发挥作用以刺激胰岛 素合成和分泌，抑制胰高血糖素分泌，减缓胃排空，增加葡萄糖利用率，和抑制 食物摄入。艾塞那肽-4（Exendin-4）从蜥蜴的毒素中分离，其与GLP-1共有约50% 的氨基酸同源性，并且也被报告为激活GLP-1受体，从而缓解糖尿病患者的高血 糖。但是，据报告包括GLP-1的抗肥胖药物显示副作用，如呕吐和恶心。

因此，作为GLP-1的替代选择，大量关注已集中于泌酸调节肽——衍生自胰 高血糖素前体即前胰高血糖素的肽，其结合于两种肽——GLP-1和胰高血糖素的 受体。泌酸调节肽是有效的抗肥胖治疗手段，因为其如同GLP-1抑制食物摄入， 促进饱足感，并且如同胰高血糖素具有脂解活性。

基于泌酸调节肽的双功能，其已被积极地研究作为治疗肥胖的药物。例如， 韩国专利号925017公开了包括泌酸调节肽作为治疗超重人的活性成分的药物组合 物，其通过口服、胃肠外、粘膜、直肠、皮下或经皮途径给予。但是，已经报告， 包括泌酸调节肽的这种抗肥胖药物的体内半衰期短并且治疗效力微弱——即使以 高剂量一日三次给予。因此，已经做出多种努力以通过对其修饰提高泌酸调节肽 的体内半衰期或对肥胖的治疗作用。

例如，双重激动剂泌酸调节肽（Merck）通过如下制备：用D-丝氨酸替代泌酸 调节肽位置2的L-丝氨酸，以增加对二肽基肽酶-IV（DPP-IV）的耐受性；同时在 C端连接胆固醇部分，以增加血液半衰期。ZP2929（Zealand）通过如下制备：用 D-丝氨酸替代位置2的L-丝氨酸，以增强对DPP-IV的耐受性；用丙氨酸替代位 置17的精氨酸，以增强对蛋白酶的耐受性；用赖氨酸替代位置27的蛋氨酸，以 增强氧化稳定性；和用天冬氨酸和丙氨酸替代位置20和24的谷氨酰胺并且用丝 氨酸替代位置28的天冬酰胺，以增强脱酰胺稳定性。但是，即使增加双重激动剂 泌酸调节肽（Merck）的半衰期至显示半衰期比天然泌酸调节肽长8～12分钟，其 仍具有很短的体内半衰期1.7hr，并且其给予剂量还高达若干mg/kg。不幸地，由 于半衰期短和效力低，泌酸调节肽或其衍生物具有每日高剂量给予的缺陷。

发明内容

技术问题

因此，发明人已经开发了通过修饰天然泌酸调节肽的氨基酸序列制备的泌酸 调节肽衍生物，以增强其对肥胖的治疗作用和降低其给予剂量。因此，发现泌酸 调节肽衍生物对胰高血糖素受体和GLP-1受体显示出比天然泌酸调节肽更优异的 活性，从而完成本发明。

问题解决方案

本发明的一个目标是提供对肥胖显示出优异的治疗作用的新型肽。

本发明的另一目标是提供包括该肽的预防或治疗肥胖的组合物。

本发明的再一目标是提供通过给予对象肽或组合物以预防或治疗肥胖的方 法。

本发明的再一目标是提供肽在制备用于预防或治疗肥胖的药物中的应用。

发明的有益作用

不同于天然泌酸调节肽，本发明的新型肽减少食物摄入、抑制胃排空和促进 脂解，而无副作用，还显示出优异的受体激活作用。因此，其可安全并且有效地 广泛用于治疗肥胖。

附图简述

图1是显示根据泌酸调节肽或泌酸调节肽衍生物给予剂量的食物摄入变化的 图。

发明最佳实施方式

在实现上述目标的一方面中，本发明提供包括下式1的氨基酸序列的新型肽。

R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X1 6-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2（式1）

其中R1是组氨酸、脱氨基-组氨酰、二甲基-组氨酰（N-二甲基-组氨酰）、β- 羟基咪唑基丙酰、4-咪唑基乙酰、β-羧基咪唑基丙酰或酪氨酸；

X1是Aib（氨基异丁酸）、d-丙氨酸、甘氨酸、Sar（N-甲基甘氨酸）、丝氨酸、 或d-丝氨酸；

X2是谷氨酸或谷氨酰胺；

X3是亮氨酸或酪氨酸；

X4是丝氨酸或丙氨酸；

X5是赖氨酸或精氨酸；

X6是谷氨酰胺或酪氨酸；

X7是亮氨酸或蛋氨酸；

X8是天冬氨酸或谷氨酸；

X9是谷氨酸、丝氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；

X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或被删除；

X11是丙氨酸、精氨酸、缬氨酸或被删除；

X12是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸或被删除；

X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；

X14是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或被删除；

X15是苯丙氨酸或被删除；

X16是异亮氨酸、缬氨酸或被删除；

X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或被 删除；

X18是色氨酸或被删除；

X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸或被删除；

X20是丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或被删除；

X21是天冬酰胺或被删除；

X22是丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或被删除；

X23是半胱氨酸、赖氨酸或被删除；

X24是由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成的具有2至10个氨基酸的肽、 或被删除；和

R2是KRNRNNIA（SEQ ID NO.32）、GPSSGAPPPS（SEQ ID NO.33）、 GPSSGAPPPSK（SEQ ID NO.34）、HSQGTFTSDYSKYLD（SEQ ID NO.35）、 HSQGTFTSDYSRYLDK（SEQ ID NO.36）、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK（SEQ ID  NO.37）或被删除（如果式1的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，则被排除）。

如本文所用，术语“肽”意为通过肽键连接的两个或更多个α-氨基酸的化合 物。在本发明的目标方面，其意为激活GLP-1受体和胰高血糖素受体以显示抗肥 胖作用的肽。根据本发明的肽包括通过添加、删除或替代泌酸调节肽的氨基酸制 备、从而与天然泌酸调节肽相比以高水平激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的肽、 肽衍生物或肽类似物。

本文述及的氨基酸是根据IUPAC-IUB的命名规则的简写形式，如下：

在本发明中，肽包括任何通过在泌酸调节肽的氨基酸序列 （HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA，SEQ ID NO.1）中替 代、添加、删除或翻译后修饰（例如，甲基化、酰基化、泛素化、分子内共价键 合）而制备、从而同时激活胰高血糖素和GLP-1受体的肽。在替代或添加氨基酸 时，可应用人蛋白质中常见的20种氨基酸中的任一种以及非典型或非天然存在的 氨基酸。非典型氨基酸的商购来源包括Sigma-Aldrich，ChemPep Inc.，和Genzyme  Pharmaceuticals。包括这些氨基酸和非典型肽序列的肽可被合成和购自供应商，例 如，American Peptide Company或Bachem（USA）或Anygen（Korea）。

为增强野生型泌酸调节肽对于胰高血糖素受体和GLP-1受体的的活性，本发 明的肽可用下列替代：4-咪唑基乙酰，其中SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的位置 1的组氨酸的α碳被删除；脱氨基-组氨酰，其中N端氨基被删除；二甲基-组氨酰 （N-二甲基-组氨酰），其中N端氨基被两个甲基修饰；β-羟基咪唑基丙酰，其中N 端氨基被羟基替代；或β-羧基咪唑基丙酰，其中N端氨基被羧基替代。此外，GLP-1 受体结合区可被增强疏水键和离子键或其组合的氨基酸替代。部分泌酸调节肽序 列可被GLP-1或艾塞那肽-4的氨基酸序列替代，以增强对GLP-1受体的活性。

进一步，部分泌酸调节肽序列可被稳定α螺旋的序列替代。优选地，在式1 氨基酸序列的位置10、14、16、20、24和28处的氨基酸可被已知稳定α螺旋的 氨基酸或氨基酸衍生物替代，包括：Tyr（4-Me）、Phe、Phe（4-Me）、Phe（4-Cl）、 Phe（4-CN）、Phe（4-NO₂）、Phe（4-NH₂）、Phg、Pal、Nal、Ala（2-噻吩基）和 Ala（苯并噻吩基），并且对所要插入的α螺旋稳定氨基酸或氨基酸衍生物的类型 和数量没有限制。优选地，在位置10和14、12和16、16和20、20和24以及24 和28处的氨基酸还可分别被谷氨酸或赖氨酸替代，以形成环，并且对所要插入的 环的数量没有限制。最优选地，肽可以是具有选自下式2至6的氨基酸序列的肽。

在一个具体实施方式中，本发明的肽是包括下式2的氨基酸序列的泌酸调节 肽衍生物，其中泌酸调节肽的氨基酸序列被艾塞那肽或GLP-1的氨基酸序列替代。

R1-A-R3  （式2）

在另一具体实施方式中，本发明的肽是包括下式3的氨基酸序列的泌酸调节 肽衍生物，其通过经由适当的氨基酸连接体连接泌酸调节肽的部分氨基酸序列与 艾塞那肽或GLP-1的部分氨基酸序列而制备。

R1-B-C-R4  （式3）

在再一具体实施方式中，本发明的肽是包括下式4的氨基酸序列的泌酸调节 肽衍生物，其中泌酸调节肽的部分氨基酸序列被能够增强与GLP-1受体的结合亲 和力的氨基酸替代，例如，位置26处的Leu——其通过疏水性相互作用结合GLP-1 受体，被疏水性残基Ile或Val替代。

R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3  （式4）

在再一具体实施方式中，本发明的肽是包括下式5的泌酸调节肽衍生物，其 中部分氨基酸序列被删除、添加、或被其他氨基酸替代，以增强天然泌酸调节肽 对GLP-1受体和胰高血糖素受体的活性。

R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5  （式5）

在式2至5中，R1与式1所述相同；

A选自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT（SEQ ID NO.38）、 SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT（SEQ ID NO.39）、 SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT（SEQ ID NO.40）、 GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG（SEQ ID NO.41）、 GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG（SEQ ID NO.42）、 GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA（SEQ ID NO.43）、和 SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG（SEQ ID NO.44）；

B选自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT（SEQ ID NO.38）、 SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT（SEQ ID NO.39）、 SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT（SEQ ID NO.40）、 GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG（SEQ ID NO.41）、 GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG（SEQ ID NO.42）、 GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA（SEQ ID NO.43）、 SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG（SEQ ID NO.44）、 GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW（SEQ ID NO.45）、和SQGTFTSDYSRYLD （SEQ ID NO.46）；

C是由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成的具有2至10个氨基酸的肽；

D1是丝氨酸、谷氨酸或精氨酸；

D2是精氨酸、谷氨酸或丝氨酸；

D3是精氨酸、丙氨酸或缬氨酸；

D4是精氨酸、缬氨酸或丝氨酸；

D5是谷氨酰胺、精氨酸或赖氨酸；

D6是异亮氨酸、缬氨酸或丝氨酸；

D7是蛋氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；

D8是苏氨酸、甘氨酸或丙氨酸；

E1是丝氨酸、Aib、Sar、d-丙氨酸或d-丝氨酸；

E2是丝氨酸或谷氨酸；

E3是精氨酸或赖氨酸；

E4是谷氨酰胺或赖氨酸；

E5是天冬氨酸或谷氨酸；

E6是谷氨酰胺、半胱氨酸或赖氨酸；

E7是半胱氨酸、赖氨酸或被删除；

R3是KRNRNNIA（SEQ ID NO.32）、GPSSGAPPPS（SEQ ID NO.33）或 GPSSGAPPPSK（SEQ ID NO.34）；

R4是HSQGTFTSDYSKYLD（SEQ ID NO.35）、HSQGTFTSDYSRYLDK（SEQ  ID NO.36）或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK（SEQ ID NO.37）；和，

R5是KRNRNNIA（SEQ ID NO.32）、GPSSGAPPPS（SEQ ID NO.33）、 GPSSGAPPPSK（SEQ ID NO.34）或被删除（如果式2至5的氨基酸序列与SEQ ID  NO.1相同，则被排除）。

优选地，本发明的新型肽可以是下式6的肽。

R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X1 6-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2（式6）

其中R1是组氨酸、脱氨基-组氨酰、4-咪唑基乙酰或酪氨酸；

X1是Aib（氨基异丁酸）、甘氨酸或丝氨酸；

X2是谷氨酸或谷氨酰胺；

X3是亮氨酸或酪氨酸；

X4是丝氨酸或丙氨酸；

X5是赖氨酸或精氨酸；

X6是谷氨酰胺或酪氨酸；

X7是亮氨酸或蛋氨酸；

X8是天冬氨酸或谷氨酸；

X9是谷氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；

X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或被删除；

X11是丙氨酸、精氨酸或被删除；

X12是丙氨酸、缬氨酸或被删除；

X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；

X14是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或被删除；

X15是苯丙氨酸或被删除；

X16是异亮氨酸、缬氨酸或被删除；

X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或被删除；

X18是色氨酸或被删除；

X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或被删除；

X20是丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸或被删除；

X21是天冬酰胺或被删除；

X22是苏氨酸或被剔除；

X23是半胱氨酸、赖氨酸或被删除；

X24是由甘氨酸组成的具有2至10个氨基酸的肽或被删除；和

R2是KRNRNNIA（SEQ ID NO.32）、GPSSGAPPPS（SEQ ID NO.33）、 GPSSGAPPPSK（SEQ ID NO.34）、HSQGTFTSDYSKYLD（SEQ ID NO.35）、 HSQGTFTSDYSRYLDK（SEQ ID NO.36）、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK（SEQ ID  NO.37）或被删除（如果式6的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，则被排除）。

更优选地，本发明的肽可选自SEQ ID NOs.1至31的肽。还更优选地，本发 明的肽可以是实施例2-1的表1中所述的泌酸调节肽衍生物。

泌酸调节肽具有两种肽——GLP-1和胰高血糖素的活性。GLP-1降低血糖、 减少食物摄入，和抑制胃排空，而胰高血糖素通过增加能量代谢增加血糖、促进 脂解和降低体重。两种肽的不同生物学作用可导致不被期望的效应，如，如果胰 高血糖素显示比GLP-1更强支配作用则增加血糖，或如果GLP-1显示比胰高血糖 素更强支配性作用则导致恶心和呕吐。因此，本发明的泌酸调节肽衍生物不仅旨 在增加这些活性，例如，抑制胰高血糖素活性的泌酸调节肽的位置1和11处的氨 基酸可被修饰以平衡胰高血糖素和GLP-1的活性比。

发明人进行了体外实验以证明本发明的肽与泌酸调节肽相比对GLP-1受体和 胰高血糖素受体显示优异的活性。因此，表明本发明的肽激活GLP-1受体和胰高 血糖素受体，从而比常规泌酸调节肽显示出对肥胖更优异的治疗作用。此外，考 察了其对体内食物摄入的抑制作用，并且其比常规泌酸调节肽显示出对食物摄入 更优异的抑制作用（图1）。

对于本领域技术人员显而易见的是，当利用一般技术修饰本发明的泌酸调节 肽衍生物时——包括通过聚合物如PEG和糖链或与白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸和 免疫球蛋白融合的修饰以提高泌酸调节肽衍生物的治疗作用，其显示的治疗作用 优于天然泌酸调节肽。因此，修饰过的泌酸调节肽衍生物也被包括在本发明的范 围内。

另一方面，本发明提供编码该肽的多核苷酸。

术语“同源性”，如本文关于多核苷酸所用，表示野生型氨基酸序列或野生型 核苷酸序列之间的序列相似性，并且包括与编码该肽的多核苷酸序列具有75%或 更高，优选85%或更高，更优选90%或更高和甚至更优选95%或更高同一性的基 因序列。同源性评价可通过裸眼或利用商购程序进行。利用商购计算机程序，可 以百分比（%）表示两个或更多个序列之间的同源性，并且可评价相邻序列之间的 同源性（%）。编码该肽的多核苷酸被插入载体并表达，从而获得大量肽。

再一方面，本发明提供包括该肽的用于预防或治疗肥胖的药物组合物。

如本文所用，术语“预防”意为通过给予肽或组合物限制或阻碍肥胖产生的 全部行为，和术语“治疗”意为通过给予肽或组合物使肥胖症状好转或有益地改 变的全部行为。

如本文所用，术语“给予”意为通过某种适当方法将一定量的预定物质导入 患者。本发明的组合物可通过任何常用途径给予，只要其能够到达预期组织，例 如但不限于，腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或 直肠内给予。但是，由于肽在口服给予后被消化，口服给予的组合物的活性成分 应当被包覆或配制以防止在胃中降解。

如本文所用，术语“肥胖”意味着过量脂肪组织在身体中积累，并且身体质 量指数（体重（kg）除以身高的平方（m））在25以上被认为是肥胖。肥胖通常由 能量失衡引起——当饮食摄入量长期超过能量消耗量时。肥胖是影响全身的代谢 疾病，并且增加糖尿病、高脂血、性功能障碍、关节炎和心血管疾病的风险，而 且在一些情况下与癌症发生有关。

本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。 如本文所用，术语“药学上可接受的”意为组合物足以实现治疗作用，而无有害 副作用，并且可容易根据以下确定：疾病类型、患者年龄，体重、健康状况、性 别和药物敏感性、给予途径、给予模式、给予频率、治疗持续时间、与本发明组 合物组合或同时服用的药物以及药物已知的其他因素。

包括本发明的衍生物的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体。对于 口服给予而言，载体可包括，但不限于、粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增 溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和调味剂。对于注射制剂而言，载体可 包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于局部给予制剂而 言，载体可包括基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。

本发明的组合物可与上述药学上可接受的载体组合配制成多种剂型。例如， 对于口服给予而言，药物组合物可被配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、 糖浆或糯米纸嚢剂。对于注射制剂而言，药物组合物可被配制在安瓿瓶中作为单 剂型或被配制在多剂量容器中。药物组合物还可被配制成溶液、悬浮剂、片剂、 丸剂、胶囊和长效制剂。

另一方面，适于药物制剂的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、 蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶橡胶、 海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯 吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物 油。此外，药物制剂可进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂和 抗菌剂。

进一步，本发明的药物组合物可以具有选自下列的任何制剂：片剂、丸剂、 粉末、颗粒、胶囊、悬浮剂、内用液体（liquids for internal use）、乳剂、糖浆、无 菌水溶液、非水性溶剂、冻干制剂和栓剂。

进一步，组合物可被配制成适于患者身体的单剂型，并且优选被配制成根据 制药领域的一般方法可用于肽药物的制剂，从而通过口服或胃肠外途径给予，如 通过皮肤、静脉内、肌内、动脉内、髓内、髓内、心室内、肺部、经皮、皮下、 腹膜内、鼻内、结肠内、局部、舌下、阴道或直肠给予，但不限于此。

肽可通过与多种药学上可接受的载体如生理盐水或有机溶剂混合被应用。为 增加稳定性或吸收性，可应用碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂如 抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质、或其他稳定剂。

本发明药物组合物的给予剂量和频率由活性成分类型连同各种因素如所治疗 疾病、给予途径、患者年龄、性别和体重以及疾病严重程度确定。

根据分级治疗方案，有效总剂量的本发明组合物可被以单剂量给予至患者， 或可被以多剂量长期给予。在本发明的药物组合物中，活性成分的含量可根据疾 病严重程度而不同。优选地，本发明的肽的总日剂量可以为每1kg患者体重约 0.0001μg至500mg。但是，除药物组合物的给予途径和治疗频率以外，肽的有效 剂量还考虑多种因素而确定：包括患者年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重 程度、饮食和分泌速率。鉴于此，本领域技术人员可容易确定适于本发明药物组 合物的具体应用的有效剂量。根据本发明的药物组合物不具体地限于该制剂和给 予途径和模式，只要其显示本发明的作用。

本发明的药物组合物显示优异的体内效力持续时间和滴度，从而显著减少其 给予数量和频率。

此外，药物组合物可被单独或与对肥胖显示预防或治疗作用的其他药物制剂 组合或同时给予。对肥胖显示预防或治疗作用的药物制剂不被具体限制，并且可 包括GLP-1受体激动剂、瘦蛋白受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、 黑素集中激素（MCH）受体拮抗剂、Y2/3受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/ 胰脂酶抑制剂、5HT2c激动剂、β3A受体激动剂、支链淀粉受体激动剂、生长素 释放钛拮抗剂和/或生长素释放钛受体拮抗剂。

再一方面，本发明提供预防或治疗肥胖的方法，包括步骤：给予对象所述肽 或包括所述肽的药物组合物。

在本发明中，术语“对象”是疑患肥胖的对象，意为患有肥胖或有肥胖可能 性的哺乳动物，包括人、鼠和家畜。但是，任何用本发明的肽或药物组合物治疗 的对象被无限制地包括在内。包括本发明的肽的药物组合物被给予疑患肥胖的对 象，从而有效地治疗对象。肥胖如上所述。

本发明的治疗方法可包括步骤：以药学上有效的量给予包括所述肽的组合物。 总日剂量应当通过医师做出的适当医学判断被确定，并且被给予一次或数次。在 本发明的目标方面，针对任何具体患者的具体治疗有效剂量水平可取决于医药领 域公知的各种因素而不同，包括所要实现的响应种类和程度、具体组合物——根 据是否有其他试剂与之一起被应用、患者年龄、体重、健康状况、性别和饮食、 给予次数和途径、组合物的分泌速率、治疗时间段、与本发明的组合物组合或同 时应用的其他药物等本领域公知的类似因素。

再一方面，本发明提供所述肽或包括所述肽的药物组合物在制备用于预防或 治疗肥胖的药物中的应用。

发明实施方式

在下文中，将参考下列实施例更详细地描述本发明。但是，这些实施例仅以 示例为目的，本发明不意图被这些实施例限制。

实施例1.体外激活的细胞系的制备

实施例1-1：对GLP-1显示cAMP响应的细胞系的制备

利用相应于人GLP-1受体基因的cDNA（OriGene Technologies，Inc.USA）的 ORF（开放阅读框）的区域作为模板，和下列包括各HindIII和EcoRI限制性位点 的正向和反向引物，进行PCR，从而获得PCR产物。

正向引物：5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'（SEQ ID NO. 47）

反向引物：5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'（SEQ ID  NO.48）

将PCR产物克隆到已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr中，以制备重组载体 x0GC/GLP1R。

利用Lipofectamine（Invitrogen，USA），将在DMEM/F12（10%FBS）培养基 中培养的CHO DG44细胞系用重组载体x0GC/GLP1R转染，并在包含1mg/mL G418和10nM氨甲蝶呤的选择培养基中培养。通过限制稀释技术从中选择单克隆 细胞系，并且最终从中选择以浓度依赖性方式对GLP-1显示优异cAMP响应的细 胞系。

实施例1-2：对胰高血糖素显示cAMP响应的细胞系的制备

利用相应于人胰高血糖素受体基因的cDNA（OriGene Technologies，Inc.USA） 的ORF的区域作为模板，和下列包括各EcoRI和XhoI限制性位点的正向和反向 引物，进行PCR，从而获得PCR产物。

正向引物：5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'（SEQ ID  NO.49）

反向引物：5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'（SEQ ID  NO.50）

将PCR产物克隆到已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr中，以制备重组载体 x0GC/GCGR。

利用Lipofectamine，将在DMEM/F12（10%FBS）培养基中培养的CHO DG44 细胞系用重组载体x0GC/GCGR转染，并在包含1mg/mL G418和10nM氨甲蝶呤 的选择培养基中培养。通过限制稀释技术从中选择单克隆细胞系，并且最终从中 选择以浓度依赖性方式对胰高血糖素显示优异的cAMP响应的细胞系。

实施例2.泌酸调节肽衍生物的体外活性的测试

实施例2-1：泌酸调节肽衍生物的合成

为测量泌酸调节肽衍生物的体外活性，合成具有下列氨基酸序列的泌酸调节 肽衍生物（表1）。

【表1】

泌酸调节肽和泌酸调节肽衍生物

在表1中，粗体和下划线的氨基酸表示环形成，X表示的氨基酸意为非天然 氨基酸，α-甲基-谷氨酸。此外，CA表示4-咪唑基乙酰，和DA表示脱氨基-组氨 酰。

实施例2-2：体泌酸调节肽衍生物的外活性的测试

为测量实施例2-1中合成的泌酸调节肽衍生物的抗肥胖效力，利用实施例1-1 和1-2中制备的细胞系体外测量细胞活性。

该细胞系是通过转染CHO（中国仓鼠卵巢）以分别表达人GLP-1受体基因和 胰高血糖素受体基因而制备的细胞系。因此，其适于测量GLP-1和胰高血糖素活 性。因此，各泌酸调节肽衍生物的活性利用各转化细胞系测量。

具体地，各细胞系一周传代培养两次或三次，并且以1×10⁵的密度等分在96 孔板的各孔中，然后培养24小时。

将培养的细胞用KRB缓冲液洗涤，并悬浮在包含1mM IBMX的40ml KRB 缓冲液中，在室温下留置5分钟。通过5倍连续稀释将泌酸调节肽（SEQ ID NO.1） 和泌酸调节肽衍生物（由SEQ ID NOs.2-6、8、10-13、17、18、23-25、27-30和 31表示）从1000nM稀释至0.02nM，并将其每个40mL加入细胞，在37℃下、 CO2培育箱中培养1小时。然后，添加20mL细胞裂解缓冲液以进行细胞裂解， 并将细胞裂解物用于cAMP分析试剂盒（Molecular Device，USA）以测量cAMP 浓度。由此计算EC₅₀值，并相互比较。EC₅₀值显示在下表2中。

【表2】

泌酸调节肽和泌酸调节肽衍生物之间的对GLP-1受体和胰高血糖素受体的体 外活性的比较

如表2所示，与SEQ ID NO.1的天然泌酸调节肽相比，泌酸调节肽衍生物显 示优异的体外活性和对GLP-1受体和胰高血糖素受体不同的活性比。

已知泌酸调节肽激活GLP-1受体和胰高血糖素受体以抑制食欲，促进脂解， 和促进饱足感，从而显示抗肥胖作用。根据本发明的泌酸调节肽衍生物显示对 GLP-1受体和胰高血糖素受体的体外活性均高于野生型泌酸调节肽，因此可用作 肥胖治疗剂，并且效力高于已知泌酸调节肽。

实施例3.泌酸调节肽衍生物的体内活性测试

为测量泌酸调节肽衍生物的体内治疗活性，考察通过给予泌酸调节肽衍生物 的ob/ob小鼠食物摄入的变化——利用天然泌酸调节肽作为对照。

具体地，肥胖型糖尿病ob/ob小鼠——常用于测试治疗剂对于肥胖和糖尿病的 效力，被禁食16小时，并被给予1或10mg/kg泌酸调节肽或0.02、0.1、1或10mg/kg SEQ ID NO.2的泌酸调节肽衍生物。然后，观察食物摄入2小时（图1）。图1是 显示根据泌酸调节肽或泌酸调节肽衍生物给予剂量的食物摄入变化的图。如图1 所示，给予1mg/kg泌酸调节肽衍生物对食物摄入显示出比给予10mg/kg泌酸调 节肽更优异的抑制作用。

总之，本发明的泌酸调节肽衍生物具有远高于野生型泌酸调节肽的抗肥胖作 用——即使以较低剂量被给予，这表明野生型泌酸调节肽显示较低抗肥胖作用并 且应当被一日三次以高剂量给予的问题得到改善。