减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用

摘要

本发明公开了减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用，减毒鼠伤寒沙门氏菌对前列腺癌细胞具有肿瘤靶向性及显著的抑制效应，并且由其与质粒所构建的基因工程菌同样具有肿瘤靶向性，且带有克隆有L-methioninase基因的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以在肿瘤组织持续表达L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它营养物质，使得肿瘤细胞缺乏营养，生长缓慢，因此均可以用于制备治疗前列腺癌的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治 疗前列腺癌的药物上的应用。

背景技术

前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤，其发病率在美国位于男性恶性肿瘤第 一位，其死亡率仅次于肺癌居第二位。近年来，在我国其发病率也呈现逐年上升的趋势， 且前列腺癌的组织学恶性程度高于美国患者。据国内上海市区对泌尿系恶性肿瘤患者的 相对生存率调查发现，在中国80.0％～90.0％的患者在就诊时已经是晚期前列腺癌，5年 生存率不到30％。由于我国人口基数大，前列腺癌患病人数激增，必须重视前列腺癌的 预防和治疗。前列腺癌的传统治疗方法包括手术、内分泌治疗和放化疗，治疗效果并不 十分理想。手术治疗后复发率比较高。对于复发的前列腺癌，往往需要采取雄激素剥夺 的内分泌治疗。前列腺癌的内分泌治疗可分为3类，即去势治疗、抗雄激素治疗以及两 者的联合应用，即全雄阻断去势治疗。内分泌治疗持续治疗2～5年后，前列腺癌一般会 发展为雄激素非依赖性。对于雄激素非依赖性前列腺癌患者，目前的治疗方法包括化疗、 放疗、核素内照射以及双磷酸盐治疗等，疗效均不满意，前列腺癌的治疗陷入窘境，对 于前列腺癌的治疗，迫切需要新的更有效的治疗方案。因此科学家和临床专家们一直在 积极探索更为安全有效的治疗方案。随着细菌以及病毒的靶向性和基因工程技术的发 展，20世纪90年代中期以来，细菌治疗肿瘤的研究急速增多。研究人员发现鼠伤寒沙 门氏菌在小鼠体内能够定向并有效地杀死肿瘤细胞。

沙门菌属是一群在人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性、侵袭性细胞内兼性厌氧菌。 VNP20009为msbB、pur I基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株，遗传稳定，对抗生素敏感。 msbB基因为脂质酰化为内毒素所必需，其缺失使类脂质A末端不能酰化，降低了毒性； pur I基因参与嘌呤代谢，其缺失使细菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。VNP20009还降低了 自身诱导机体产生的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)，从而降低炎性反应。 因此，它的低致病性提高了用于临床治疗的安全性。VNP20009已被广泛用于癌症研究， 它可作用于多种小鼠实体瘤模型，包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌。VNP20009 作为肿瘤基因治疗载体的一个主要优点是它能够高度靶向聚集于肿瘤部位。研究人员在 多种实体肿瘤的小鼠模型中发现，VNP20009在肿瘤内的数量较肝脏等主要器官内高 200～l000倍。VNP20009能在肿瘤组织缺氧坏死区优先聚集并繁殖，相同时间内肿瘤组 织内细菌的扩增代次显著高于正常组织，使得减毒沙门菌成为新型抗瘤制剂和肿瘤靶向 治疗的载体成为可能。沙门菌导致肿瘤生长减慢可能机制包括：肿瘤生长所需要的营养 物质为细菌所消耗，细菌所产生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭肿瘤生长必需氨基酸；细 菌向胞外微环境分泌的局部毒素或者产生的肿瘤坏死因子α，都可影响肿瘤血管形成； 此外，在细菌生长部位的非特异性炎症反应可潜在激活抗肿瘤T细胞。但尚未发现 VNP20009对前列腺癌细胞的抗肿瘤活性。

肿瘤细胞为了维持其高增殖率，需要足够的营养。除糖之外，对甲硫氨酸(Methionine, Met)、谷胺酰氨、精氨酸等需要量尤其大。研究证实Met依赖性是绝大多数肿瘤细胞的 共同特征，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、神经胶质 瘤等，而正常细胞不存在Met依赖性。一些体内体外实验相继证实，直接食用甲硫氨酸 缺乏的膳食可以延缓肿瘤细胞的增殖。但是若膳食中Met长期缺乏或不足，将会引起机 体营养不良、代谢障碍，还可因DNA长期处于低甲基化状态加剧癌变。那么，通过甲 硫氨酸酶(L-methioninase)特异性地将Met分解，从而降低体内甲硫氨酸水平，则能 更加有效地抑制肿瘤细胞生长或使之消退。动物实验已证明经腹膜内注射甲硫氨酸酶可 以抑制裸鼠的吉田肉瘤和肺肿瘤的增长。临床试验选四个分别患有乳腺癌、肺癌、肾癌 和淋巴瘤的患者每24h静脉注射一次甲硫氨酸酶，发现甲硫氨酸酶可以明显减少血浆中 甲硫氨酸含量。但是，由于哺乳动物本身不表达甲硫氨酸酶，所以外源性给与的方式有 一定的副作用，往往引起机体的免疫反应。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于提供减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在 制备治疗前列腺癌的生物药物上的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明提出了减毒鼠伤寒沙门氏菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用，所述减毒 鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

本发明同时提出一种基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用，所述基因工 程菌为携带质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

其中，所述质粒为pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质 粒或pET23a质粒。所述质粒通过电转化转移至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中。所 述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。

本发明还提出一种基因工程菌在制备治疗前列腺癌的药物上的应用，所述基因工程 菌为携带质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，且其中所述质粒上克隆有 L-methioninase基因。

其中，所述的质粒为pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322 质粒或pET23a质粒。所述基因工程菌的构建方法为：将L-methioninase基因亚克隆至 质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤 寒沙门氏菌VNP20009，即得。所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25μF， 放电时间4ms。

最为优选，在构建基因工程菌的过程中，当选用pSVSPORT质粒时，将 L-methioninase基因通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至质粒中，得到L-methioninase 表达质粒，然后将L-methioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中 得到基因工程菌。

上述减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌的给药方式为瘤内注射。

有益效果：减毒鼠伤寒沙门氏菌对前列腺癌细胞具有肿瘤靶向性及显著的抑制效 应，同时，其与质粒构建的基因工程菌同样具有肿瘤靶向性，且带有克隆有 L-methioninase基因的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以在肿瘤组织持续表达 L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它营养物质，使得肿瘤细胞缺乏营养，生长缓慢， 因此可以用于制备治疗前列腺癌的药物。

附图说明

图1是质粒pSVSPORT-L-methioninase酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳图。

图2是Western blot鉴定methioninase表达结果图。

图3是检测沙门氏菌中methioninase活性结果图。

图4是注射沙门菌对裸鼠体重的影响结果图。

图5是瘤内注射沙门菌在裸鼠体内的分布结果图；

图6是给与数量为2×10⁴CFU沙门菌后肿瘤体积变化曲线图。

图7是给予数量为2×10⁴CFU沙门菌3周后肿瘤的重量结果图。

图8是给予数量为2×10⁴CFU沙门菌3周后肿瘤的大小结果图。

图9是给与数量为2×10⁶CFU沙门菌后肿瘤体积变化曲线图。

图10是给予数量为2×10⁶CFU沙门菌3周后肿瘤的重量结果图。

图11是给予数量为2×10⁶CFU沙门菌3周后肿瘤的大小结果图。

图12是分别给予2×10⁴CFU、2×10⁶CFU沙门菌后的肿瘤体积占PBS组相对百分比 结果图。

图13是给予2×10⁶CFU沙门菌4周后肿瘤组织肿瘤增殖抗原ki67染色结果图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

实施例1：基因工程菌的构建。

(1)构建表达L-methioninase基因的质粒。

先合成L-methioninase(GenBank：L43133.1)基因亚克隆至pUC57质粒(金斯瑞 公司)，接着通过Kpn I和Hind III酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒(invitrogen)，得 到pSVSPORT-L-methioninase表达质粒。具体构建过程如下：

将pSVSPORT质粒用Kpn I和Hind III双酶切，酶切体系为：2μg质粒DNA，3μL10× buffer，1.5μL Kpn I酶，1.5μL Hind III酶，加入ddH2O补足体积至30μL，37℃温浴3h。 然后将酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出4.1kb大小的DNA条带，用 胶回收纯化试剂盒纯化DNA。

通过全基因合成得到L-methioninase编码区域DNA片段亚克隆至pUC57质粒(金 斯瑞公司)，用Kpn I和Hind III双酶切，酶切体系为：3μg质粒DNA，3μL10×buffer， 1.5μL Kpn I酶，1.5μL Hind III酶，加入ddH2O补足体积至30μL，37℃温浴3h。然后将 酶切体系在1％的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.2kb大小的DNA条带，用胶回收 纯化试剂盒纯化DNA。

将pSVSPORT(Kpn I/Hind III)和L-methioninase编码区域DNA片段(Kpn I/Hind III)连接，连接反应中加入2μL载体、6μL插入片段、1μL T4DNA连接酶，16℃温浴 16h。

将连接产物转化到E.coli DH5α(Takara)的感受态细胞中。取一管50μL的DH5α 感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5μL上述连接产物，轻弹混匀，后于 冰上孵育30min；42℃热击60s，后冰上静置2min；加入500μL无抗性的LB液体培养 基，37℃震荡培养1h；4000rpm离心5min，吸走，保留100μL左右的培养基，用移液 器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上。然后将平板置 于37℃温箱培养16h。

克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃震荡培 养16h，提取质粒DNA，用Kpn I和Hind III酶切鉴定，阳性克隆中可得到4.1kb、1.2kb 的两条DNA条带，如图1所示。再通过测序进一步确定阳性克隆的序列完全正确。

(2)构建携带质粒的VNP20009菌和携带克隆有L-methioninase的基因的质粒的 VNP20009菌。

将pSVSPORT和pSVSPORT-L-methioninase表达质粒分别电转化至VNP20009菌株 (YS1646，ATCC号202165)，分别命名为VNP20009-V和VNP20009-M。具体构建过 程如下：

将感受态细菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入预冷电转杯，向其中加入2μL 质粒，轻弹混匀，于冰上孵育1min。将电转杯放入电转仪，条件设置为电压2400V，电 阻400Ω，电容25μF，放电时间4ms。电击完立刻加入1mL SOC培养基，轻轻混匀。 37℃震荡培养1h；4000rpm离心5min，吸走，保留100μL左右的培养基，用移液器将 细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB-O培养基平板上。然后将平板置于 37℃温箱培养16h。VNP20009-V和VNP20009-M用LB-O培养后，提取质粒，酶切鉴 定正确。

取1×10⁸沙门菌用蛋白裂解液提取蛋白，进行10％SDS-PAGE电泳，再稳压冰浴电 转至PVDF膜，BSA室温封闭1h后，TBST漂洗3×5min，加入兔抗L-methioninase抗 体(1：1000)，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP标记的抗兔二抗(1： 10000)，室温孵育1h，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化学发光法显影。结果如图2 所示，在分子量约43kD处有特异性条带，说明VNP20009-M与VNP20009、VNP20009-V 相比，L-methioninase表达量显著提高。

将L-甲硫氨酸和吡哆醛分别与VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M菌体混合， 37℃孵育10min后用50％三氯乙酸终止，离心取上清，与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐 酸盐水合物(MBTH)充分混匀，50℃孵育30min后，测定320nm处的吸光值，以每 分钟催化转化1μmolα-酮丁酸的酶量定义为1个酶活性单位。结果显示(图3)，沙门菌 VNP20009-M的甲硫氨酸酶活性比VNP20009和VNP20009-V高10倍。

实施例2：VNP20009及其基因工程菌的抗肿瘤效果。

1、用含有10％胎牛血清的F-12K培养基培养雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3， 以细胞数2×10⁶个皮下接种于裸鼠右侧腋下。每隔2～3天，观察小鼠状态，用游标卡尺 测量肿瘤大小(体积＝0.52×长×宽²)。待肿瘤体积达到0.1～0.2cm³时，将荷瘤裸鼠随机 分组：PBS对照组、VNP20009、VNP20009-V组和VNP20009-M组。

2、用LB-O培养VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M，当OD≈0.6时，收集 菌体，然后用PBS重悬，以2×10⁶CFU/只的剂量，采用瘤内注射方式给药，对照组注射 同等体积PBS。给药后，观察裸鼠的活动、进食、体重。结果如图4所示，注射细菌后， 小鼠体重未受影响。而且裸鼠的进食、粪便也无异常，说明VNP20009、VNP20009-V 和VNP20009-M对裸鼠无明显毒性。

3、给药后分别在第1d、6d、12d和20d，取裸鼠不同组织，加PBS研磨匀浆，梯 度稀释后用LB平板培养过夜。结果如图5所示，组织匀浆菌落计数定量结果，瘤内注 射细菌1d后，肿瘤组织中菌量为3.5×10⁷CFU/g，而肝、肾等组织未检出细菌；12d后， 肿瘤组织中菌量为7.5×10⁷CFU/g，而肝组织为1×10⁵CFU/g，比例约为750:1；20d后， 肿瘤与其它组织菌量的比例约为6900:1～61000:1，说明VNP20009对于该种前列癌肿瘤 有着较好的靶向性。

4、操作方法同1、2，沙门菌用量为2×10⁴CFU/只，即低剂量组。给药后每隔2-3d， 测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积，绘制裸鼠肿瘤体积变化曲线(图6)。给药后3周， 对照组和实验组随机取3只，剥离裸鼠肿瘤，称重，拍照(图7、8)。结果如图6所示， 给予数量为2×10⁴CFU的沙门菌VNP20009-M后，肿瘤体积和重量约为PBS组的1/2。 而给予等量的VNP20009、VNP20009-V没有明显的抑制肿瘤的效果。结果说明沙门菌 VNP20009-M对于该前列腺癌肿瘤具有显著的抑制效应。

5、操作方法同上述1、2、4，将沙门菌用量增加到2×10⁶CFU/只，即高剂量组。结 果如图9所示，给予沙门菌VNP20009、VNP20009-V后，肿瘤生长缓慢，体积和重量 约为PBS对照组的1/3。给予沙门菌VNP20009-M，大部分小鼠的肿瘤生长停滞，肿瘤 体积和重量(图10，11)约为VNP20009、VNP20009-V组的1/2，PBS对照组的1/4。 在给药后第4周取肿瘤组织用4％福尔马林固定过夜，经石蜡包埋切片，进行肿瘤增殖 抗原ki67染色。免疫组化结果(图13)显示，VNP20009-M组的肿瘤组织，ki67染色 阳性率比PBS对照组、VNP20009-V组降低，说明细胞的增殖减少。综合对比给予不同 剂量VNP20009、VNP20009-V和VNP200009-M的抗肿瘤效应(图12)，结果显示随着 使用剂量的增加，各组的抑瘤效果都明显增强。在相同剂量下，VNP20009和 VNP20009-V抑瘤效果相似，两组之间没有显著区别。低剂量的VNP20009和 VNP200009-V没有表现出显著的抗肿瘤效应，而低剂量VNP20009-M已经明显抑制了 肿瘤增长。但是提高沙门菌的注射剂量后，各组都表现出显著的抗肿瘤效果，尤其是 VNP200009-M，使用3周后抑瘤率接近90％。这些结果说明，沙门菌VNP20009、 VNP20009-V和VNP20009-M均能抑制该前列腺癌细胞的增殖，从而抑制了肿瘤的发展。

上述结果表明，本发明所采用的减毒鼠伤寒沙门氏菌不仅有良好的抗肿瘤效果，并 且能靶向肿瘤部位，在肿瘤中富集。

本发明表明减毒鼠伤寒沙门氏菌对前列腺癌细胞具有肿瘤靶向性及显著的抑制效 应。同时，其与质粒构建的基因工程菌同样具有肿瘤靶向性，且带有克隆有 L-methioninase基因的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以在肿瘤组织持续表达 L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它营养物质，使得肿瘤细胞缺乏营养，生长缓 慢，因此可以用于制备治疗前列腺癌的药物。上述质粒并不局限于pSVSPORT质粒， pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒以及克隆有L-methioninase 基因的上述质粒同样具有类似效果。