复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物

摘要

本发明公开了一种复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物。本发明由以下物质组成：蚂蚁精华提取物0.3-3g/100ml、胎盘活性小分子多肽提取物0.6-6g/100ml，乙醇5-15ml/100ml，其余为水。做为护肤品的主要活性部分，起到降低真皮层细胞凋亡、刺激皮肤干细胞再生、补充流失的胶原、抗氧化、消除自由基等作用，从而针对刚开始形成的细微皱纹起到淡化、补充营养、消除岁月痕迹作用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的去皱抗衰老护肤组合物，用于生物技术、美容化妆品和皮肤再生、抗衰老行业。涉及蚂蚁醛酸和抗氧化酶的综合利用、胎盘中细胞生长因子和胶原水解多肽的优化配比。 

背景技术：

蚂蚁的功效早在《本草纲目》中就有记载，本草纲目中黑蚂蚁称“玄驹”。具有除风、祛湿、平气、养心、调血通经、舒脉之效。科学研究表明：蚂蚁体内含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等多种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸，蛋白质含量高达40-60％，单不饱和类脂肪酸占脂肪酸(MUFA)的70％以上，多不饱和脂肪酸(PUFA)在蚁后体内达到964mg/100g，含有丰富的维生素B1、B2、B3、C、D、E等，富含的微量元素锌、铁、硒、磷、钙等确保了多种酶的活性。另外，蚂蚁体内含有丰富的醛酸成分，柠檬醛在蚂蚁头部上颚腺中以反式和顺式混合体的形式存在。每一个蚂蚁头部中两种同分异构醛类含量可以达到40mg之多，香茅醛和柠檬醛以大约9∶1的比例在蚂蚁头部上颚腺中存在，起到防御保护功能。最近的研究发现，柠檬醛的抗氧化活性比抗坏血酸Vitamin C高，而天然柠檬醛和香茅醛的抗菌、抗炎症、抗肿瘤等药理活性，也使其成为其药品研究的新原料；蚂蚁的众多品种中，拟黑多刺蚁，尤以优质著称。研究表明，其含蛋白56.6±10.8％，含维生素E2.6±1.8mg/kg和77000IU/100g超氧化物歧化酶(SOD)等过氧化物酶(POD)。超氧化物歧化酶能够催化过氧阴离子发生歧化反应、清除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，如自由基等，因此有不可多得的抗炎、抗癌、抗辐射、抗衰老、抗自由基作用。拟黑多刺蚁含总醛酸1.6％，其中18烯酸、蚁酸、柠檬醛、香茅醛、香茅酸含量丰富，而多刺属蚂蚁酸具有靶向性抗风湿因子，是一种有效的免疫抗衰老剂，使退化的胸腺增生、免疫细胞数增多，其具有调节失调的免疫功能调理平衡作用和抗氧化和抗衰老方面的功效，因此蚂蚁药物在类风湿关节炎、哮喘等方面已经得到应用。 

近年来，我国各地制成蚂蚁粉，蚁丸，蚁片，蚁酒，胶囊等食用补品和药品，部分蚂蚁制品己进入国际食品市场。然而，蚂蚁的有效成分，特别是蚂蚁体内中的天然的抗衰老柠檬醛、香茅醛、蚁酸等醛酸类物质结合其体内天然的SOD酶成分进入皮肤用抗衰老护肤品的应用尚未被挖掘。 

动物胎盘含有丰富的营养成分，胎盘的羊膜、叶状绒毛膜部分有大量的免疫球蛋 白、含量丰富的氨基酸，丰富的卵磷脂，脑磷脂，脂多糖，多种维生素和微量元素，对于皮肤细胞的老化可起到良好的改善作用。 

鉴于上，我们从优质蚂蚁中提取了蚂蚁醛酸精华和抗氧化酶，从胎盘中提取出活性低分子细胞生长因子和低分子胶原水解多肽，利用这两类生物活性物质最佳配比制备出了本发明的组合物，这是一种激发皮肤自身干细胞增殖、补充营养、抗氧化、抗衰老的护肤新组合物。 

发明内容：

本发明的目的是制备出一种用于生物技术、美容化妆品和皮肤再生、抗衰老行业的复合抗衰老护肤组合物。 

本发明提供了一种含有蚂蚁醛酸和抗氧化酶提取物与胎盘低分子活性多肽组合物。可以起到促进皮肤干细胞增殖的再生作用，对皮肤进行营养补充，增加皮肤弹性，并起到抗皮肤氧化、抗衰老的作用。 

一种复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，由以下物质组成：蚂蚁精华提取物0.3-3g/100ml、胎盘活性小分子多肽提取物0.6-6g/100ml，乙醇5-15ml/100ml，其余为水。 

所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的蚂蚁精华提取物，采用黑蚁、红蚁、白蚁、和野生、春秋两季捕捉的黑多刺蚁。拟黑多刺蚁，又称鼎突多刺蚁，分类上属于节肢动物门，昆虫纲，膜翅目，蚁科，蚁亚科，多刺蚁属。 

所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的蚂蚁精华提取物由以下方法制备取得：蚂蚁用蒸馏水洗净、干燥、低温研磨成粉，采用99.5％纯度乙醇加水配制成30-70％乙醇在10-20℃条件下进行浸泡加震荡提取3-5小时后，再在冰浴条件下超声波萃取30-60分钟，收集提取液，加蒸馏水在冰浴中再次对蚂蚁残体超声浸提30-60分钟，将两部分提取液合并，1500-2500rpm离心去不溶沉淀物后，得到蚂蚁精华提取物。 

所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的蚂蚁精华提取物中包括蚂蚁醛酸成分0.3-2g/100ml，超氧化物歧化酶SOD10000-100000IU/ml。 

所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的胎盘活性小分子多肽提取物使用的胎盘为足月哺乳动物健康胎盘，取用部位为胎盘的羊膜、绒毛膜部分，其中样本按照重量比为羊膜∶绒毛膜＝1∶4-1∶10，最佳1∶4。 

所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的胎盘活性小分子多肽提取方法为：将动物胎盘组织在无菌情况下，用组织剪机械剪碎成＜0.5mm3组 织块，组织块采用胰蛋白酶胶原酶10.01-0.1％和胶原酶II0.01-0.1％在37℃下持续震荡水解2-8小时，4℃5000-14000rpm离心15min，去沉淀后获得胎盘粗提取物，粗提物经Sephadex G-100凝胶色谱柱层析柱分离，BSA(66kDa)，、carbonic anhydrase(29kDa)和aprotinin(6.5kDa)作为分子量标志，右旋糖酐蓝(200kDa)为色谱柱孔体积标志，洗脱液为pH7.6、0.2M的NaH₂PO₄--NaHPO₄缓冲液，洗脱速度控制在0.2--0.5ml/min，利用分光光度计监测蛋白流出情况，分段收集在10-66Kda的流出组分，蒸馏水透析去盐分，获得胎盘活性小分子多肽提取物。在最终组合物中，哺乳动物胎盘多肽提取物0.6-6g/100ml，其中有10-35KDa活性生长因子0.01-0.2g/100ml，和1-20KDa低分子水解胶原多肽0.1-5g/100ml。 

所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，蚂蚁提取物与胎盘低分子活性多肽提取物比例为1∶2-1∶3；其中，蚂蚁提取物0.3-3g/100ml，包括通过低温提取获得的蚂蚁醛酸0.1-2g/100ml，超氧化物歧化酶SOD10000-100000IU/ml；哺乳动物胎盘多肽提取物0.6-6g/100ml，其中有10-35KDa活性生长因子0.01-0.2g/100ml，1-20KDa低分子水解胶原多肽0.1-5g/100ml。 

上述技术方案之一所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，在制作抗衰老水剂、乳剂、霜剂，化妆水、日霜、晚霜、眼霜、面膜、洗面奶、防晒霜、手霜、精华素、隔离霜方面的应用。 

上述技术方案之一所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，在制作具有刺激皮肤细胞生长、加速新陈代谢、刺激自身干细胞再生、补充流失的胶原等蛋白成分，在抗衰老作用的护肤品方面的应用，对刚开始形成的细微皱纹起到淡化、补充营养、消除岁月痕迹作用。 

有益效果： 

本发明的复合抗衰老护肤组合物用于减少表皮角质细胞程序化死亡： 

将本发明组合物以1％的最终重量比添加到Gibco K-SFM无血清培养基培养中培养人角质细胞keratinocytes，培养体系中不含本组合物培养组作为对照，培养到80％铺满培养瓶底部后，分别以无钙镁的PBS将培养基洗净，采用0.05％-0.02％的胰酶-EDTA37℃消化5分钟后，吹打、分散后形成单细胞液，并离心获得角质细胞样本，配成1×10⁶/ml细胞浓度。两组样本各有6个平行样本，细胞样本用Tris-HCl Triton裂解液4℃裂解过夜后，13000rpm离心获取上清液，以1mg/ml蛋白浓度进行SDS-Page并鼠抗人caspase3进行蛋白印记标记试验，转膜、抗体标记、曝光后，将膜上的抗体剥除后，再进行actin标记试 验，actin作为内参，绘制caspase3在两组细胞中的表达如图1所示，在接种量相同的情况下，添加本组合物的实验组中细胞分泌的caspase3含量比对照组明显降低，因此组合物有保护表皮细胞、减少其变少、凋亡的作用。 

本发明的复合抗衰老护肤组合物用于影响人真皮成纤维细胞生长速度： 

正常成人成纤维细胞PCS-201-012以1×10⁴细胞接种密度在24孔板内培养，以GIBICO公司DMEM加10％小牛血清为基础培养基，并添加新鲜的L-Glutamine，实验组添加3％本组合物，每组接种24个孔进行平行试验，每3天换液一次。培养过程中可选择加入100U/ml青霉素和100U/ml链霉素控制微生物的污染，培养条件在37℃5％CO₂培养箱中恒温进行，每天对每组6个孔进行胰酶-EDTA消化，记录生长的细胞数目，绘制生长曲线，见图2。从结果看出(Prism5统计分析，t-test)，组合物可以刺激成纤维细胞的增殖，加组合物的试验组中成纤维细胞对数期生长速度快，最终获得的细胞数量比未加组合物的对照组有明显的增长(P＜0.05)，因此本组合物化妆品具有明显促进细胞新陈代谢作用。 

本发明的复合抗衰老护肤组合物用于降低人真皮成纤维细胞倍增时间： 

正常成人成纤维细胞PCS-201-012以0.8×10⁴细胞接种密度在24孔板内培养，以GIBICO公司DMEM加12％小牛血清为基础培养基，并添加新鲜的L-Glutamine，实验组添加2.5％本组合物，每组接种24个孔进行平行试验，每3天换液一次。培养过程中可选择加入100U/ml青霉素和100U/ml链霉素控制微生物的污染，培养条件在37℃5％CO₂培养箱中恒温进行，一共培养6-8天，每天对每组6个孔进行胰酶-EDTA消化，记录生长的细胞数目，根据公式DT＝t＊lg2/(lgNt-lgNo)计算倍增时间(其中DT是倍增时间，t是培养小时，Nt为t时间的细胞总数，No为接种时的细胞总数。 

统计分析表 

由表中可以看出，添加了本组合物的实验组细胞倍增时间短，对数期生长速度快，并且到 达平台期的细胞平均总数远高于对照组，经过重复试验结果进行统计分析表明(Prism5统计软件，t-test)，两组试验结果从平台期细胞总数的对比，第5、6、7天p分别为0.0498，、0.0029和0.0467，均小于0.05，有显著的差异，因此本组合物对促进细胞新陈代谢效果明显。 

本发明的复合抗衰老护肤组合物对干细胞细胞周期的影响： 

培养基中添加3％本组合物培养人皮下脂肪干细胞，培养到P4代后，收集细胞数目约(1-5)×10⁶个细胞于50ml离心管中，1300r/min离心6min，弃去培养液。3ml PBS重悬细胞，洗涤一次，1300r/min离心6min去PBS。加入1ml PBS重悬细胞，将细胞悬液移入1.5mlEP管中，1200r/min离心6min。加入预冷的70％的乙醇1ml固定细胞，4℃，1-2小时。离心弃去固定液，1ml PBS洗涤两次，用0.5mi Cell Signaling PI染液染色，4℃避光30min。流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，分析PI荧光强度，从SS/FS散射光点图去除细胞碎片，圈定将要分析的细胞为A门，分析DNA含量；从FL3-Lin/AUX点图排除粘连的细胞，将B门细胞绘制成FL3-Lin直方图分析，见图3。通过Beckman流式细胞分析软件分析细胞周期结果见图4，结果判断：在PI荧光的直方图上，G1/G0期前出现一二倍体峰。S期完整，未见异倍体DNA。因此证明，采用本组合物培养过的脂肪干细胞细胞稳定，未发生细胞凋亡现象，从而证明本组合物的安全性。 

本发明的复合抗衰老护肤组合物培养的脂肪干细胞性状稳定 

人皮下脂肪干细胞P4代细胞经过本组合物培养后，脂肪干细胞用胰酶37℃消化5分钟，收集脂肪干细胞约(1-5)×10⁶个/mL，经过PBS洗涤两次后，进行抗原标记反应，本组合物培养脂肪干细胞后，获得的干细胞保持成体干细胞的特征，细胞贴壁生长，形态学方面显示长梭形，并生长呈现漩涡状；如图5所示，表面抗原CD73、CD90、CD105、CD13、CD44、CD59、CD29呈阳性表达，CD14、CD34、CD45、CD79a、HLA--DR呈阴性表达；培养后的细胞，符合脂肪干细胞的特征。 

本发明的复合抗衰老护肤组合物用作于抗氧化去除自由基： 

将DPPH用95％乙醇配成0.1mg/L的溶液备用。含有蚂蚁醛酸精华0.8％和胎盘低分子多肽1％的本组合物溶解在水中，配成2mg/ml液体。在1ml DPPH溶液中，分别加入组合物溶液10、20、40、80、150、200μl，用95％乙醇定容到2ml进行反应，待反应40min，反应达到稳定状态，读取520nm处分光光度值As，同时以95％乙醇加同样量样本进行记录520nm读数为Ar、95％乙醇和DPPH溶液混合后的520nm读数为Ao，按照公式自由基清 除率％＝(1-(As-Ar)/Ao)×100计算自由基清除率，从图6中看可以出，随着本组合物量的增加，自由基清除率成线性提高，50％自由基清除率下所需要的本组合物浓度为125.95mg/L。 

本发明的复合抗衰老护肤组合物用作于增加皮肤弹性： 

10个志愿者，女性，年龄40岁+-2，身体和皮肤状况健康，5人使用含本组合物0.8％的面霜，每日洁面后施用于眼尾2次，连续4周，每周进行皮肤弹性测试。5人使用没有本组合物的相应面霜，为对照组结果。本实验的皮肤弹性结果通过德国MPA580弹性测试仪检测，通过测试皮肤的回复形变的大小考察使用化妆品后皮肤弹性的变化，评价抗衰老功效指数为弹性指数R2，即无负压时皮肤的回弹量和有负压时的最大拉伸量之比，比值越接近于1，说明皮肤弹性越好，抗衰老效果越明显。图7用Prism5统计，进行One-way ANOVA+Tukey’s Multiple Comparison Test，结果如表明，两组志愿者中，起始弹性指数没有明显区别(第0天)，在以后的几周中，对照组的皮肤弹性和起始时期没有明显改变，而使用本组合物面霜的志愿者眼睛尾部的弹性明显比起始状态有改善(P＜0.01)，也比对应时间的对照组志愿者有提高，图中对比组上＊＊表示两组有显著差异(P＜0.01)，＊＊＊表示两组有极显著差异(P＜0.001)。 

附图说明：

附图1蛋白质印记检测培养基中添加1％本发明组合物培养人角质细胞后caspase3表达量的结果图； 

附图2培养基中添加1％本发明组合物培养人成纤维细胞的生长曲线结果图； 

附图3流式细胞仪检测本发明组合物培养脂肪干细胞的细胞周期结果图； 

附图4流式细胞分析软件分析本发明组合物培养脂肪干细胞的细胞周期结果图； 

附图5本发明组合物培养的皮下脂肪干细胞表面抗原表达情况结果图； 

附图6本发明组合物对自由基清除效果结果图； 

附图7本发明组合物面霜对皮肤弹性影响结果图。 

具体实施方式：

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对发明的限制，仅仅作示例说明 

实施例1： 

一种复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，由以下重量比的组份组成：蚂蚁精华提取物2.54g/100ml、胎盘活性小分子多肽提取物5.5g/100ml，乙醇7％，其 余为纯水。 

实施例2： 

复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，由以下物质组成：蚂蚁精华提取物0.3-3g/100ml、胎盘活性小分子多肽提取物0.6-6g/100ml，乙醇5-15ml/100ml，其余为水。 

实施例3： 

一种复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，100ml中组成包括： 

实施例4： 

实施例1或2或3所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的蚂蚁醛酸类提取物的蚂蚁，采用黑蚁、红蚁、白蚁，最佳要求为野生、春秋两季捕捉的拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)，又称鼎突多刺蚁，分类上属于节肢动物门，昆虫纲，膜翅目，蚁科，蚁亚科，多刺蚁属。于非雨季，干燥晴朗的天气，在林下选取蚂蚁自然生长环境类型，找到蚁穴后，以食物诱捕或者挖巢法，采集样本为工蚁。 

实施例5： 

实施例1或2或3或4所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的蚂蚁醛酸酶类提取物由以下方法制备取得： 

蒸馏水洗净干燥后的蚂蚁，采用99.5％纯度乙醇加水配制成50％乙醇，在15℃条件下进行浸泡加100rpm震荡提取3小时后，再在冰浴条件下超声波萃取30分钟，收集提取液，加蒸馏水在冰浴中再次对蚂蚁残体超声浸提30分钟，将两部分提取液合并，2500rpm离心去不溶沉淀物，后得到蚂蚁醛酸酶精华。 

实施例6： 

实施例1-5之一所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的胎盘活性小分子多肽提取物使用的胎盘为足月哺乳动物健康胎盘，最佳取用部位为胎盘的羊膜、绒毛膜部分，其中样本按照重量比为羊膜：绒毛膜＝1∶4-1∶10，最佳1∶4。 

实施例7： 

实施例1-6之一所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的胎盘活性小分子多肽提取物提得的是采用将羊、牛胎盘组织在无菌情况下，用组织剪机械剪碎成＜0.5mm³组织块，组织块采用胰蛋白酶胶原酶I0.08％和胶原酶II0.08％在37℃下持续震荡水解4小时，4℃13500rpm离心15min，去沉淀后获得胎盘粗提取物，粗提物经Sephadex G-100凝胶色谱柱层析柱分离，BSA(66kDa)，、carbonic anhydrase(29kDa)和aprotinin(6.5kDa)作为分子量标志，右旋糖酐蓝(200kDa)为色谱柱孔体积标志，洗脱液为pH7.6、0.2M的NaH₂PO₄-NaHPO₄缓冲液，洗脱速度控制在0.5ml/min，利用分光光度计监测蛋白流出情况，分段收集10-66KDa的流出组分，蒸馏水透析去盐分，获得胎盘活性小分子多肽提取物。在最终组合物中，哺乳动物胎盘多肽提取物3.5g/100ml，其中有10-35KDa活性生长因子0.2g/100ml，1-20KDa低分子水解胶原多肽2.5g/100ml。 

实施例8： 

实施例1-7之一所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，醛酸提取物与胎盘低分子活性多肽提取物比例为1∶2.5。 

实施例9： 

上述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，在制作抗衰老水剂、乳剂、霜剂，化妆水、日霜、晚霜、眼霜、面膜、洗面奶、防晒霜、手霜、精华素、隔离霜方面的应用。 

实施例10： 

上述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，在制作刺激皮肤细胞生长、加速新陈代谢、刺激自身干细胞再生、补充流失的胶原的药物中具有等蛋白成分作用，从起到抗衰老作用的保健品方面的应用，对刚开始形成的细微皱纹起到淡化、补充营养、消除岁月痕迹作用。 

实施例11： 

复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物制作的抗衰老爽肤水： 

实施例12： 

本发明的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物用于制作抗衰老面霜： 

实施例13： 

另一个本发明的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物用于制作抗衰老面霜： 

本发明的实施方式仅仅是一种例举，本发明的组合物中，蚂蚁中醛酸提取方式不限于本发明所述的方式，目的是获得的草体蚁醛(C10H16O)，胸蚁醛(C10H14O)，红蚁醛(C10H16O2)，香茅萜，柠檬萜，超氧化物歧化酶SOD等混合物。