烟粉虱MED隐种瞬时感受器离子通道基因MED BtTrp及其应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MED隐种瞬时感受器离子通道基因MED BtTrp及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明从烟粉虱MED隐种中克隆到瞬时感受器离子通道TRP(MED BtTrp)基因的cDNA，并通过饲喂MEDBtTrp基因dsRNA结果导致烟粉虱MED隐种在高温胁迫下存活率显著降低。本发明结果对于明确烟粉虱MED隐种温度感知机制有重要意义，期望为进一步研究烟粉虱的温度适应机理和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MED隐种瞬时感受器离子通道基因MED BtTrp及其应用。 

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)属半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，小粉虱属Bemisia，是多食性的刺吸性害虫，主要分布在热带和亚热带地区。烟粉虱入侵并成功扩张的机制包括多方面、多层次的内容，而在全球变化的环境下，生态适应是其关键环节之一。生态适应涉及的因素主要包括生物因素和非生物因素，在非生物因素中，温度是影响其种群动态和扩散分布的重要因素。已有研究表明，烟粉虱入侵机制和烟粉虱温度适应性密切相关。 

MED隐种对温度具有较强的抵抗力是其能扩散为全世界重要害虫的关键因素之一，是其入侵并成功扩张的重要机制之一。MED隐种具有很强的耐高温能力，使其在炎热的季节能猖獗危害；而在寒冷季节，逐渐扩大的保护地为其提供了越冬场所，使得其累积大量虫口数以致暴发。昆虫耐热性的获得与热激蛋白(heat shock proteins,HSP)的分子伴侣作用有关，热激蛋白在生物热胁迫生态适应和进化上起着重要作用。前期研究表明热激蛋白基因在烟粉虱耐热性中起着关键性作用，为更好的理解烟粉虱温度适应能力，研究烟粉虱怎样感知外界温度并将其传递至体内的温度感知机制尤为重要。已有研究表明，瞬时感受器离子通道TRP(transient receptor potential)是生物感知外界温度的关键通道。 

瞬时感受器离子通道（transient receptor potential,TRP）是位于细胞膜上的一类重要的离子通道，最早发现于果蝇的视觉系统中。被激活时，允许包括钙离子在内的阳离子进行跨膜运输。TRP作为感受器中的门控分子，起到外部环境和神经系统中介的作用，可以将热刺激、化学刺激以及机械刺激等转化成内向电流。TRP在模式生物果蝇中研究较为透彻，主要具有光感应、温度感知、机械感应和生化感应等生物学功能。 

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指内源性或外源性的dsRNA（double-stranded RNA,dsRNA）介导的细胞内的mRNA发生特异性降解，从而导致 靶细胞表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。RNAi作为关闭特定基因功能的新技术，为基因功能的研究提供了一个快速、简便的方法，对于昆虫的研究起到了十分重要的作用。RANi技术在基因功能方面的研究是一项快速、高效、便于操作的可以使靶基因失活的技术。近些年，RNAi技术在昆虫研究上得到越来越多的应用，通过RNAi技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段，进而达到利用或防治其危害的目的。RNAi技术通常采用饲喂、注射、浸泡、电穿孔、干细胞移植、通过转基因技术制备等方法。在昆虫研究中，通常采用注射法和饲喂法来进行RNAi效应的研究，将目的基因的dsRNA或siRNA导入昆虫体内，进而实现干扰。由于烟粉虱个体体积小，注射dsRNA不易操作、费时等限制，而饲喂dsRNA具有简便、易于操作等特点而在烟粉虱研究中得以应用。 

本发明从烟粉虱MED隐种中克隆到瞬时感受器离子通道TRP(MED BtTrp)基因的cDNA，并提供烟粉虱MED隐种瞬时感受器离子通道TRP基因cDNA的克隆方法，并通过饲喂MED BtTrp基因dsRNA结果导致烟粉虱MED隐种在高温胁迫下存活率显著降低。本发明结果对于明确烟粉虱MED隐种温度感知机制有重要意义，期望为进一步研究烟粉虱的温度适应机理和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。 

发明内容

本发明的目的是从烟粉虱MED隐种中克隆到MED BtTrp基因。 

本发明的再一目的是验证了MED BtTrp基因在烟粉虱高温胁迫条件下所起的作用，提供了上述的MED BtTrp基因的应用。 

根据本发明的MED BtTrp基因，所述MED BtTrp基因cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID No.1所示： 

ATGGGGAGGCCGACGGAGCGGGCCACCCGAGCCGGACAGTCTGTGCTTGCTTGTCGTTTTCGCCACGATGGAGTAATCCGTTCCATCCCAGTTTTGGGTAGTGCTCCATTTTTTGGATAACGCTTTTTCCCAGGTGCGAGGGGCAGGATGAAGCCGACGGAATCGAAGGAGGACCTCCTGGGGTCGAAGGAGAACCTAAAAAATCCCCGAGAGTCCTTGCAGTCGACCGGCGGCGAGGTTGCCCTCACCCAGATCGAGAAAAGGTTCCTCTTGCTCAGCGAAAGGGGAGATATCGCCTCGGTCAAAAGGATAATCGCTGAGCACAAAGATCACCCAGAACTATTGAACATCAACTGCGTTGATCCTCTGAACAGGTCAGCACTCATCGCAGCGATCGAAAATGAAAATATAGAGTTAATAAGAGTCCTCCTCGAACTTGGGATTGAAGTCAAGGATGCTCTTCTGCACGCAATTAAGGAAGAGTACGTTGAAGCTGTGGAGATTCTACTTGAATGGGAAGAAAAAATCCACAAACCTGGGCAGCCTTATAGTTGGGAAGCTGTTGACGGGAGCTCTTCGACATTTACACCGGACATAACACCGCTCATATTGGCTGCTCACATGAACAATTACGAAATCCTGAAAATTTTGTTGGATCGAGGCGCCACACTCCCCGCGCCACACGATGTTAGGTGTGGCTGCGACGAATGTGTAACTTCAAGTGAGCAGGATTCTTTGCGACATTCACAAGCTCGGATCAACGCGTACAGAGCTTTAACCGCACCATCCCTCATAGCCCTCTCTTCCAGGGATCCCCTCCTTACCGCCTTCGAGTTATCATGGGAGCTGCGCAGACTCAGCAAGATGGAAGCGGAATTCCGCTCTGAATATAATGAAATGAGAGGTATTTGTCAGACATTTGCAACCTCCTTGCTAGACCACGCGCGAACCTCGTAT GAACTGGAGGTGATGCTTAATCATAATCCTGATGGAGAGTCGTGGGAACCAGGAGAGAGGCAAACTCTGGAGAGACTGAAGCTAGCTATCAAATACAAACAAAAAGCGTTTGTTGCTCATCCAAATGTACAACAGCTGCTGGCAGCTATTTGGTATGATGGTCTCCCCGGATTTCGACGAAAAGGGATGATTGGTCAAGCTTTTGAGTGTGGAAAGTTAGGTGCAATGTTTCCTGTCTACGCAACCGTGTATTTGACAGCGCCTGAATCGGAGATGGGCCAGTTCATGAAAAAACCCTTTGTAAAGTTCATCTGTAATTCAACCTCCTACGCTTTCTTCCTGATGTTATTGGCCTTGGCATCACAAAGAGCGGAATTTCTTGCAATCGAATGGTTTGGACCCGACTGGATGAAAGAGATACTGAAAGAGTGGACTCGAAAGGAAAGAGGATCAATACCTGGTCTCATAGAATCCTTTATTATTTTGTATATCATAAGTTTGATTTGGGGTGAAATGAGAGCATTGTGGTCTGGTGGCTTAGAGGACTATGTTTCAGATTTGTGGAATATAGTGGATTTCATCACCAATGTATTCTATATGATATGGATTTGTCTCAGAGGAACTGCGTATATCATTGTGCAAAGAGAGCATAAAAGTGGCCTCGATCCATGGTATCCTCGTGATAAGTGGGACATGTTTGATCCTCATCTTCTATCAGAAGGTGCGTTTGCAGCCAGTATGATCTTCAGTTTCTTAAAATTGGTTCATATCTTCAGTATCAATCCTCATCTTGGTCCACTGCAAATTTCGTTGGGACGAATGATTGTCGACATCATCAAATTTTTCTTCATCTACACATTGGTCCTTTTCGCTTATGGTTGTGGTATGAATCAGTTACTTTGGTACTATGCTGATCTTGAGAGGAAAAAGTGTTATCATCTGAACGAGGATTATGCTGATTTTGATGGTCAAGATAAAGCCTGTACAACATGGAGACGTTTTGCAAATTTATTTGAAACATCTCAGTCTCTGTTCTGGGCCAGTTTCGGTTTAGTTGATCTTGTATCGTTTGATCTGACTGGTATTAAGAGTTTCACCCGGTTTTGGGCTCTTCTGCTTTTCGGATCATACTCCGTTATCAATATCATTGTCCTGCTCAACATGTTGATTGCCATGATGTCCAACAGTTACCAAATCATCTCTGAACGATCCGATACTGAATGGAAATTTGCTCGAAGTGACCTATGGATCAGTTACTTTGAGGATGGCGACACTGTTCCTCCACCATTCAACCTATCACCATCTGTTAAATCTATGAAAAGAATGATGGGAATCAAAACTGGGAAAATCAGCACTGGTTCGATGAAGAACAAAAGTCGAGCTAAAGCTATGGAGCGTCACGAAGCAGTCATGAAACTATTGGTCAGGCGATATGTTGTGGCTGAGCAAAGGAAGAGAGATGAGTTCGGCATCACAGAAGATGATGTTATGGAAATTCGACAAGATATTTCAACCCTTCGTTTTGAACTGATCGATATCCTCCGAACAAACGGAATGAAGACACCGAGCGTGGACAAAGAGGATCAAGCAGTGGGCAAGAAAGGTCGTGTGATGGAGCGTCGTTTGCTGAAGGACTTCCAGATCGGCCTGGTTGAGGGTATAATTAGTGATGTCATATCTTCTGAGAAAGAGCCAAGGGATGTCTTCAGCAAGATTGCTCGTGCAATTGGTAAGGACTCAAGTGCAAAGAAAAAGGACTGGAACGCTATTGCCGCCAAGAAAGCATCCAGCCGCGAACTTATTGGAAGCACCAGCGAGGCTGTGGAGCGTCGGCAATCACGCCAGAGTTTGCGCCGGCACATCCTCGAACATCAAGGATCAGCAATGGCAAATATGGATCCCGAGAAGCTGGTTGAGTACAATCCCAAGTTGCAAGAATATGCACCTGCTGCTCGAATCGCCTATGCCAAATTCAAGATCTCCAAGATCAAGCAAGAATATGACGATAAAGGAAATGAAGAAGAAGGCAAAGACGATGTTTTCGAGCCTGCTACAGTAACAACGAAGGACGAAACAAAACCATCCCAAAGTGGCTCCATCGCACGGCCGAGACCCAAAAGCACCAAGAAACCACCCGCACCTGGAGCCATTCCAGGTCCCGACGATGGCAAGAAAGACTTCCGGTCGCGAACTCCGATCCAAGAAGATCCAAGAGAGGCTGGCCGCACTCCAACGCCAGAACCAATCAAAATGCTCAAGACATCGATTTCCTCTCTCAAGCAAGTATCAGTCGATCAAAAAGCTGGGCCATCAGACAAAAAACCCGCCGCCCCGGGGGCTCCGGCTCCGAAAGTAGAGGTCACCGCAGCTAAATCACCTGCAAAAACAGAGGCAGCCCCGGCAAAACCTGAAGAAAAGAAGCCCACACCTGCTAAACCAGAGGAAAAGAAGCCTGCCGCTGCTGCTGCTACGCCTAAAGCAGACGAAAAGAAGGACGAGAAGAAAGAAGAAAAGAAGGACGAGAAGAAAGATGAGAAGAAAGAGGAAAAGAAAGACGATAAAAAGCCGGGCCCTGCTCCGAAAAAACCAGATGATAAGGATAAGCCTCCCTCGCCGAAGAAAACGATGATCCACACAAAACCTGGTGGTAAATCAACAGTCACCGGCGAAGTACTGACTGGATGGTTGTAAGTATTTCAAAAGAGTAACGTGTACTGGCTGCAAAAACTGATTAGTTTAATATTTCACTTCAGTGGTTTTTTTTAAACTAGCAAATTTTCTGTCTTAAAATTCTTTTTCAATTGGCAGAAACGGAGTTCTTGCATGCGTGAGGGATTTGTGATTTAAGTATTTGTTCTTACATAAAAGTTCGCGAGCAACGAGTTGCGGTGCCCCTGGTTTTCTCTGAAATCAACTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。 

本发明进一步提供了所述烟粉虱MED隐种瞬时感受器离子通道基因MED BtTrp用于防治烟粉虱的应用 

本发明所获得的结果为明确MED BtTrp基因在烟粉虱MED隐种温度感知中的作用奠定基础，也为探讨MED BtTrp基因和热激蛋白基因之间的相互作用对昆虫温度感知及适应性提供理论依据。 

附图说明

图1MED BtTrp基因的dsRNA处理对烟粉虱MED隐种成虫耐热性的影响：比 较饲喂MED BtTrp基因dsRNA、饲喂10%蔗糖溶液3h后烟粉虱MED隐种死亡率。所有数据均用SPSS16.0统计软件进行数据统计分析，显著性检验水平为P<0.05。 

具体实施方式

实施例1：烟粉虱MED隐种MED BtTrp基因全长cDNA序列克隆 

1、提取总RNA： 

取烟粉虱MED隐种的成虫200头放入已灭过菌的研磨器中，加入1mL的Trizol溶液，研磨充分后，加入到1.5mL的离心管中。充分振荡混匀，室温放置5min；静置后加入0.2mL的氯仿，充分振荡混匀15s，室温放置5min，使用高速低温离心机12000rpm离心15min；取上清液于另一离心管中，加入等体积异丙醇，摇晃混匀，室温放置10min。在4℃下12000rpm离心15min；弃上清液，加入浓度75%的乙醇1mL，在4℃下12000rpm离心10min；弃上清液，并在超净工作台放置5min，加入50μL的DEPC水，在55-60℃水中5min使RNA沉淀充分溶解，-80℃超低温冰箱保存以备用。 

2、烟粉虱MED隐种cDNA合成： 

采用Transgen公司的反转录试剂盒(Super Script First-Strand Synthesis System)说明进行，具体如下： 

（1）在0.2mL的PCR管中依次加入以下试剂： 

（2）以上溶液轻轻混匀，42℃孵育30min，85℃孵育5min。反应结束后放在-20℃冰箱保存备用。 

3、PCR扩增烟粉虱MED隐种MED BtTrp基因的中间片段： 

（1）设计引物MED BtTrp‐F和MED BtTrp‐R： 

MED BtTrp-F:5’-CGCACCATCCCTCATAGCC-3’； 

MED BtTrp-R:5’-GTCGGGTCCAAACCATTCG-3’由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。 

（2）以cDNA为模板，PCR扩增烟粉虱MED隐种MED BtTrp基因的中间片段： 

反应体系为25μL：10×PCR reaction buffer2.5μL、dNTP Mix(10mM)0.5μL、Taq聚合酶(2.5U)0.5μL、上游引物和下游引物(10μM)各1.0μL、cDNA模板0.5μL、灭菌ddH₂O19.0μL。 

反应条件为：94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,35个循环；72℃10min。 

（3）PCR产物纯化：利用Transgen公司的EasyPureTM Quick Gel Extraction Kit试剂盒将PCR产物进行切胶纯化。具体为：切下含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，放入1.5mL离心管称重；加入3倍体积的GSB溶液，于55℃浴6-10min，间断混合；待胶块完全融化，加入适量的醋酸钠，调整颜色和GSB颜色相同；融化的凝胶溶液降至室温后，加入吸附柱中静置1min，12000rpm离心1min，弃流出液；加入650μL的WB溶液，12000rpm离心1min，弃流出液；12000rpm离心1min，去除残留WB；将吸附柱置于一干净的离心管中，开盖静置1min，使残留的乙醇挥发干净，在柱的中央加入20μL的去离子水，室温静置1min；12000rpm离心1min，洗脱DNA，将洗脱的DNA放于-20℃冰箱保存。 

（4）PCR产物连接、转化与鉴定 

连接：在0.2mL的离心管中加入以下试剂：上述PCR纯化产物4μL，pEASY-T1载体1μL，轻轻混合，室温反应20min，反应结束后置于冰上。 

转化：将连接产物加到体积为50μL的Transl-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20min；42℃热激30s，立即置于冰上2min；加入500μL液体LB培养基，200rmp，37℃摇床孵育1h；取40μL X-gal（20mg/mL）和8μL的IPTG（500mM），混匀后均匀地涂于LB固体平板培养基上，37℃培养箱放置30min；取200μL菌液涂平板，37℃培养过夜。 

鉴定：挑取白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中摇床培养10h，菌液进行菌落PCR。菌落PCR反应体系为10μL：2×EasyTaq SuperMix5μL、M₁₃F上游和下游引物(10μM)各1.0μL、cDNA模板1.0μL、灭菌ddH₂O2.0μL。 

菌落PCR反应条件为：94℃10min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环；72℃，10min。 

琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物大小，选出重组克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。 

4、烟粉虱MED隐种MED BtTrp基因5’RACE和3’RACE获得 

根据步骤3所获得的烟粉虱MED隐种MED BtTrp基因的中间片段序列，设计5’RACE和3’RACE特异性引物，PCR扩增MED BtTrp基因的5’和3’端序列： 

5’RACE Outer Primer:5’-TTGGCGGCAATAGCGTTCCAGTCC-3’ 

5’RACE Inner Primer:5’-CTCTTTGTCCACGCTCGGTGTCTT-3’ 

3’RACE Outer Primer:5’-ACACCGAGCGTGGACAAAGAGGA-3’ 

3’RACE Outer Primer:5’-CTATTGCCGCCAAGAAAGCATCCAG-3’ 

采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clonetch）试剂盒，并严格按照试剂盒说明书操作，扩增得到目的条带，将克隆测序后的序列利用DNAMAN和GENtle软件拼接获得TRP基因的cDNA序列全长,得到MED BtTrp基因3906bp序列，所得的基因具有如SEQ ID No.1所示的序列。 

ATGGGGAGGCCGACGGAGCGGGCCACCCGAGCCGGACAGTCTGTGCTTGCTTGTCGTTTTCGCCACGATGGAGTAATCCGTTCCATCCCAGTTTTGGGTAGTGCTCCATTTTTTGGATAACGCTTTTTCCCAGGTGCGAGGGGCAGGATGAAGCCGACGGAATCGAAGGAGGACCTCCTGGGGTCGAAGGAGAACCTAAAAAATCCCCGAGAGTCCTTGCAGTCGACCGGCGGCGAGGTTGCCCTCACCCAGATCGAGAAAAGGTTCCTCTTGCTCAGCGAAAGGGGAGATATCGCCTCGGTCAAAAGGATAATCGCTGAGCACAAAGATCACCCAGAACTATTGAACATCAACTGCGTTGATCCTCTGAACAGGTCAGCACTCATCGCAGCGATCGAAAATGAAAATATAGAGTTAATAAGAGTCCTCCTCGAACTTGGGATTGAAGTCAAGGATGCTCTTCTGCACGCAATTAAGGAAGAGTACGTTGAAGCTGTGGAGATTCTACTTGAATGGGAAGAAAAAATCCACAAACCTGGGCAGCCTTATAGTTGGGAAGCTGTTGACGGGAGCTCTTCGACATTTACACCGGACATAACACCGCTCATATTGGCTGCTCACATGAACAATTACGAAATCCTGAAAATTTTGTTGGATCGAGGCGCCACACTCCCCGCGCCACACGATGTTAGGTGTGGCTGCGACGAATGTGTAACTTCAAGTGAGCAGGATTCTTTGCGACATTCACAAGCTCGGATCAACGCGTACAGAGCTTTAACCGCACCATCCCTCATAGCCCTCTCTTCCAGGGATCCCCTCCTTACCGCCTTCGAGTTATCATGGGAGCTGCGCAGACTCAGCAAGATGGAAGCGGAATTCCGCTCTGAATATAATGAAATGAGAGGTATTTGTCAGACATTTGCAACCTCCTTGCTAGACCACGCGCGAACCTCGTATGAACTGGAGGTGATGCTTAATCATAATCCTGATGGAGAGTCGTGGGAACCAGGAGAGAGGCAAACTCTGGAGAGACTGAAGCTAGCTATCAAATACAAACAAAAAGCGTTTGTTGCTCATCCAAATGTACAACAGCTGCTGGCAGCTATTTGGTATGATGGTCTCCCCGGATTTCGACGAAAAGGGATGATTGGTCAAGCTTTTGAGTGTGGAAAGTTAGGTGCAATGTTTCCTGTCTACGCAACCGTGTATTTGACAGCGCCTGAATCGGAGATGGGCCAGTTCATGAAAAAACCCTTTGTAAAGTTCATCTGTAATTCAACCTCCTACGCTTTCTTCCTGATGTTATTGGCCTTGGCATCACAAAGAGCGGAATTTCTTGCAATCGAATGGTTTGGACCCGACTGGATGAAAGAGATACTGAAAGAGTGGACTCGAAAGGAAAGAGGATCAATACCTGGTCTCATAGAATCCTTTATTATTTTGTATATCATAAGTTTGATTTGGGGTGAAATGAGAGCATTGTGGTCTGGTGGCTTAGAGGACTATGTTTCAGATTTGTGGAATATAGTGGATTTCATCACCAATGTATTCTATATGATATGGATTTGTCTCAGAGGAACTGCGTATATCATTGTGCAAAGAGAGCATAAAAGTGGCCTCGATCCATGGTATCCTCGTGATAAGTGGGACATGTTTGATCCTCATCTTCTATCAGAAGGTGCGTTTGCAGCCAGTATGATCTTCAGTTTCTTAAAATTGGTTCATATCTTCAGTATCAATCCTCATCTTGGTCCACTGCAAATTTCGTTGGGACGAATGATTGTCGACATCATCAAATTTTTCTTCATCTACACATTGGTCCTTTTCGCTTATGGTTGTGGTATGAATCAGTTACTTTGGTACTATGCTGATCTTGAGAGGAAAAAGTGTTATCATCTGAACGAGGATTATGCT GATTTTGATGGTCAAGATAAAGCCTGTACAACATGGAGACGTTTTGCAAATTTATTTGAAACATCTCAGTCTCTGTTCTGGGCCAGTTTCGGTTTAGTTGATCTTGTATCGTTTGATCTGACTGGTATTAAGAGTTTCACCCGGTTTTGGGCTCTTCTGCTTTTCGGATCATACTCCGTTATCAATATCATTGTCCTGCTCAACATGTTGATTGCCATGATGTCCAACAGTTACCAAATCATCTCTGAACGATCCGATACTGAATGGAAATTTGCTCGAAGTGACCTATGGATCAGTTACTTTGAGGATGGCGACACTGTTCCTCCACCATTCAACCTATCACCATCTGTTAAATCTATGAAAAGAATGATGGGAATCAAAACTGGGAAAATCAGCACTGGTTCGATGAAGAACAAAAGTCGAGCTAAAGCTATGGAGCGTCACGAAGCAGTCATGAAACTATTGGTCAGGCGATATGTTGTGGCTGAGCAAAGGAAGAGAGATGAGTTCGGCATCACAGAAGATGATGTTATGGAAATTCGACAAGATATTTCAACCCTTCGTTTTGAACTGATCGATATCCTCCGAACAAACGGAATGAAGACACCGAGCGTGGACAAAGAGGATCAAGCAGTGGGCAAGAAAGGTCGTGTGATGGAGCGTCGTTTGCTGAAGGACTTCCAGATCGGCCTGGTTGAGGGTATAATTAGTGATGTCATATCTTCTGAGAAAGAGCCAAGGGATGTCTTCAGCAAGATTGCTCGTGCAATTGGTAAGGACTCAAGTGCAAAGAAAAAGGACTGGAACGCTATTGCCGCCAAGAAAGCATCCAGCCGCGAACTTATTGGAAGCACCAGCGAGGCTGTGGAGCGTCGGCAATCACGCCAGAGTTTGCGCCGGCACATCCTCGAACATCAAGGATCAGCAATGGCAAATATGGATCCCGAGAAGCTGGTTGAGTACAATCCCAAGTTGCAAGAATATGCACCTGCTGCTCGAATCGCCTATGCCAAATTCAAGATCTCCAAGATCAAGCAAGAATATGACGATAAAGGAAATGAAGAAGAAGGCAAAGACGATGTTTTCGAGCCTGCTACAGTAACAACGAAGGACGAAACAAAACCATCCCAAAGTGGCTCCATCGCACGGCCGAGACCCAAAAGCACCAAGAAACCACCCGCACCTGGAGCCATTCCAGGTCCCGACGATGGCAAGAAAGACTTCCGGTCGCGAACTCCGATCCAAGAAGATCCAAGAGAGGCTGGCCGCACTCCAACGCCAGAACCAATCAAAATGCTCAAGACATCGATTTCCTCTCTCAAGCAAGTATCAGTCGATCAAAAAGCTGGGCCATCAGACAAAAAACCCGCCGCCCCGGGGGCTCCGGCTCCGAAAGTAGAGGTCACCGCAGCTAAATCACCTGCAAAAACAGAGGCAGCCCCGGCAAAACCTGAAGAAAAGAAGCCCACACCTGCTAAACCAGAGGAAAAGAAGCCTGCCGCTGCTGCTGCTACGCCTAAAGCAGACGAAAAGAAGGACGAGAAGAAAGAAGAAAAGAAGGACGAGAAGAAAGATGAGAAGAAAGAGGAAAAGAAAGACGATAAAAAGCCGGGCCCTGCTCCGAAAAAACCAGATGATAAGGATAAGCCTCCCTCGCCGAAGAAAACGATGATCCACACAAAACCTGGTGGTAAATCAACAGTCACCGGCGAAGTACTGACTGGATGGTTGTAAGTATTTCAAAAGAGTAACGTGTACTGGCTGCAAAAACTGATTAGTTTAATATTTCACTTCAGTGGTTTTTTTTAAACTAGCAAATTTTCTGTCTTAAAATTCTTTTTCAATTGGCAGAAACGGAGTTCTTGCATGCGTGAGGGATTTGTGATTTAAGTATTTGTTCTTACATAAAAGTTCGCGAGCAACGAGTTGCGGTGCCCCTGGTTTTCTCTGAAATCAACTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。 

实施例2：MED BtTrp基因的dsRNA处理对烟粉虱MED隐种耐热性的影响 

1、dsRNA模板的制备： 

加上T7启动子（下划线所示序列）后的引物序列： 

T7+           MED         BtTrp-F： 

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGAAGACACCGAGCGTGGACAAAG； 

T7+MED                     BtTrp-F： 

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGGCAATAGCGTTCCAGTCCTTTT。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 

总RNA提取及cDNA合成：同实施例1。 

T7引物PCR扩增： 

反应体系为50μL：10×PCR buffer5.0μL、dNTPs1.0μL、cDNA模板1.0μL、Primer-T7F2.0μL、Primer-T7R2.0μL、TransStart Taq DNA Polymerase1μL、ddH₂O38.0μL。 

反应条件：94℃5min；94℃30s,60℃30s,72℃30s,35个循环；72℃10min。结果检测：确认所扩增的条带为目的条带。 

T7引物扩增的PCR产物纯化： 

使用Qiaquick PCR purification kit(Qiagen,Inc.,Hilden,Germany)试剂盒纯化PCR产物，按照试剂盒说明书进行操作。 

纯化所得的PCR产物即为合成dsRNA的模板。 

2、dsRNA的合成与纯化 

使用RNAi Kit试剂盒合成和纯化dsRNA，按照试剂盒说明书进行操作 

3、dsRNA饲喂 

Parafilm膜预先用DEPC水处理以去除RNA酶。在浓度为10％的蔗糖液（灭菌处理的DEPC ddH₂O溶解蔗糖）中加入dsRNA，浓度为0.3～0.5μg/μL。根据本实验需求，对Parafilm膜夹营养液法（Miles et al.,1965）做了相应的改进：取初羽化的烟粉虱MED隐种成虫约200头放人两端通透的玻璃管中（直径3cm，高8cm），玻璃管上端覆以两层Parafilm膜并在两膜间的空隙内加入含有dsRNA的10％的蔗糖液200～250μL，玻璃管下端覆以纱布以保持通气，玻璃管周围和下端用黑色塑料纸包裹有利于烟粉虱向顶端Paraflim膜聚集，从而更好的取食dsRNA混合液。将处理好的玻璃管放入人工气候箱中（温度25±0.2℃，24h光照，相对湿度为60-70%），饲喂3小时MED BtTrp基因的dsRNA后，将烟粉虱收集于指型管中（长5cm，直径1.2cm），放入预热的高温水浴锅（Microprocessor Control MPC Huber，德国）处理1h，处理温度为45℃。处理后的成虫在26℃常温下恢复1h，统计存活率。以饲喂不含dsRNA且灭菌处理过的10%的蔗糖溶液的烟粉虱MED隐种作为对照，每组5个重复。利用SPSS16.0统计软件分析饲喂不同溶液后烟粉虱MED隐种存活率，结果如图1所示，饲喂MED BtTrp基因dsRNA的烟粉虱MED隐种的存活率显著低于饲喂蔗糖组和空白对照组存活率（P<0.001）；同时在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST显示，所饲喂的靶序列片度为TRP基因特有的序列，由此确保了干扰效果为烟粉虱MED隐种的目的MEDBtTrp基因所产生，因此，本发明说明MED BtTrp基因在烟粉虱MED隐种高温胁迫和高温感知中起着关键作用。