一种金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的应用

摘要

本发明公开了一种由取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的用途。所述修饰金纳米颗粒的取代嘧啶分子为2-巯基-4,6-二氨基嘧啶、2-巯基-4-氨基嘧啶或2-巯基4,6-二羟基嘧啶之中的一种或至少两种的混合。本发明将没有抗凝活性的取代嘧啶部分和没有抗凝活性的金纳米颗粒通过S-Au键相连，并首次应用于抗凝领域，所得的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒取得了出乎意料的抗凝效果，且制备方法简单，所述纳米颗粒粒径分布小，颗粒在水中分散性好，在正常剂量下不会引起出血副作用，可以用于制备抗凝血剂或抗血小板剂。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种金纳米颗粒的应用，更具体地，涉及 一种取代嘧啶修饰的金纳米颗粒在制备抗凝血剂或抗血小板剂中的用途。

背景技术

静脉血栓是人类因心血管相关疾病死亡的第三大杀手，而抗凝血药物是目 前最有效的预防和治疗药物(Mackman,N.,Nature2008,451(7181),914-918)。 目前常用的抗凝血药物肝素和华法林钠等容易在使用过程中造成出血等副作 用，且容易和其他事物和药物发生相互作用，影响药效的发挥，使用时需要对 其进行药物监测(Goldhaber,S.Z.；Bounameaux,H.,Lancet2012,379(9828), 1835-1846；Palareti,G.,et al.,Lancet1996,348(9025),423-428)。人们一直想通 过研制新型抗凝血药物来解决传统药物中出现的问题，但是进展缓慢，并且很 难替代现有药物(Apostolakis,S.,et al.,Cardiovasc.Ther.2011,29(6),e12-e22)。

金纳米颗粒具有很多优点，例如尺寸可控，表面容易修饰，生物相容性 好，目前被广泛用于生物医药研究领域(Boisselier,E.；Astruc,D.,Chem.Soc.Rev. 2009,38(6),1759-1782)。在金纳米颗粒众多优势中，其多价效应尤其引人注 意，已经被应用与很多药物的研发和创新中。比如将一些抗癌药物分子(肿瘤 坏死因子或者紫杉醇)修饰在金纳米颗粒表面，可以达到比原药更强的抗肿瘤 效果，并且可以逆转某些肿瘤对这些药物的耐药性(Paciotti,G.F.,et al.,Drug  Deliv.2004,11(3),169-183；Paciotti,G.F.,et al.,Drug Dev.Res.2006,67(1), 47-54)，这主要是因为金纳米颗粒比表面积大，且容易修饰，所以可以连接很 多药物分子，提高药物局部浓度，增强药效。且金纳米颗粒生物相容性好，尺 寸较小，可靶向肿瘤组织，减少药物毒副作用，且由于尺寸效应不易被细胞排 出，可逆转肿瘤耐药性。类似的现象也在抗生素药物的研究中被发现，将万古 霉素连接在金颗粒表面可以逆转细菌的耐药性，降低最小抑菌浓度(MIC)(Gu, H.,et al.,Nano Lett.2003,3(9),1261-1263)。不仅如此，某些无活性的小分子， 比如一些抗菌药物前体小分子，修饰在金颗粒表面也会发挥强大的抗菌作用， 不仅可以对抗超级细菌，还不容易诱导细菌产生耐药性(Zhao,Y.,et al.,J.Am. Chem.Soc.2010,132(35),12349-12356)。专利CN102188383公开了一种氨基嘧 啶修饰的金纳米颗粒，其可广泛地用于抗菌药物的制备。此外，某些抗病毒药 物的前体修饰在金颗粒表面可以抑制HIV-1病毒所造成的细胞融合(Bowman, M.C.,et al.,J.Am.Chem.Soc.2008,130(22),6896-6897)。

目前将金纳米颗粒的多价效应应用在开发新型抗凝血药物的研究还很少。 人们将凝血酶、核酸配适体或者肝素连接在金纳米颗粒表面，确实可用于提高 抗凝参数，但是这种方法很难控制表面配体的数量，对其是否会造成出血也没 有进行评价(Liao,Y.J.,et al.,Langmuir2012,28(24),8944-8951；Hsu,C.L.,et  al.,Chem.Eur.J.2011,17(39),10994-11000；Shiang,Y.C.,et al.,Adv.Funct. Mater.2010,20(18),3175-3182)。

嘧啶这种小分子是很多治疗性药物的前药，可以利用其合成抗菌药以及抗 凝药物等(Lagorio,S.H.,et al.,Eur.J.Med.Chem.2006,41(11),1333-1338； Gangjee,A.,et al.,J.Med.Chem.2007,50(13),3046-3053；Bruno,O.,et al., Bioorg.Med.Chem.2006,14(1),121-130)。取代嘧啶可以被可控地连接于金纳 米颗粒表面，所得颗粒物理化学稳定，并且可以发挥强大的抗菌作用(Zhao,Y., et al.,J.Am.Chem.Soc.2010,132(35),12349-12356)。同时嘧啶也是目前在研究 的一些抗凝药物的合成前体，这些抗凝药物在前期研究中显示出了比现有药物 更为有效的抗凝活性，且不容易造成出血副反应，但是合成过程过于复杂 (Abdelhafez,O.M.,et al.,Bioorg.Med.Chem.2010,18(10),3371-3378)。因 此，本领域急需寻找一种具有优异抗凝效果、不造成出血副反应且合成方便的 新型抗凝药物。

发明内容

本发明首次将取代嘧啶修饰的金纳米颗粒应用于抗凝血剂或抗血小板剂的 制备，取得了出乎意料的抗凝效果。

本发明的目的在于提供一种由取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒在制备抗凝 血剂或抗血小板剂中的用途。所述取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒为取代嘧啶 部分和金纳米颗粒通过S-Au键相连所形成的纳米颗粒。所述修饰金纳米颗粒的 取代嘧啶分子为2-巯基-4,6-二氨基嘧啶、2-巯基-4-氨基嘧啶或2-巯基-4,6-二羟 基嘧啶之中的一种或多种的混合。即所述纳米颗粒中的金元素可结合一种取代 嘧啶分子，也可通过其多价效应结合两种或更多上述取代嘧啶分子。单一氨基 嘧啶分子修饰的金纳米颗粒包含2-巯基-4,6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简 称Au_DAPT)，2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简称Au_APT)和2-巯 基-4,6-二羟基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简称Au_DHPT)；混合氨基嘧啶分子修 饰的金纳米颗粒包含2-巯基-4,6-二氨基嘧啶和2-巯基-4-氨基嘧啶共同修饰的金 纳米颗粒(简称Au_DAPT/APT)，2-巯基-4,6-二氨基嘧啶和2-巯基-4,6-二羟基 嘧啶嘧啶共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_DAPT/DHPT)，2-巯基-4-氨基嘧啶 和2-巯基-4,6-二羟基嘧啶共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_APT/DHPT)和上述 三种氨基嘧啶分子共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_DAPT/APT/DHAPT)。优 选地，所述修饰金纳米颗粒的取代嘧啶分子为2-巯基-4,6-二氨基嘧啶(简称 Au_DAPT)。

所述取代嘧啶分子修饰的金纳米颗粒中，取代嘧啶部分没有抗凝活性，未 取代的金纳米颗粒也没有抗凝活性，然而当取代嘧啶部分中的巯基与金元素通 过S-Au键相连时，所得的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒取得了出乎意料的抗凝效 果。

所述金纳米颗粒中金元素与取代嘧啶分子的摩尔含量比为1:0.5～1:2。例如 1：0.5，1：0.75，1：1，1：1.5或1：2。对其中摩尔含量比不同的金纳米颗粒 进行电镜图片扫描，经分析可知当Au和取代嘧啶的摩尔含量比过大时，所得 的金纳米颗粒粒径较大，较易发生团聚现象。当Au和取代嘧啶的摩尔含量比 为1:0.5到1:2时，金纳米颗粒分散性较好，同时当Au和取代嘧啶的摩尔含量 比为1:1时，其表面分子密度最高，具有更好的抗凝效果。优选地，所述金纳 米颗粒中金元素与取代嘧啶分子的摩尔含量比为1:1，粒径为3nm左右。

所述金纳米颗粒平均粒径的范围为1～10nm。当所述金纳米颗粒中金元素 与取代嘧啶分子的摩尔含量比为1:1时，所述金纳米颗粒平均粒径的范围为 2.8～3.8nm。

本发明所述的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：将 氯金酸与取代嘧啶溶解混合形成混合溶液；还原剂例如硼氢化钠或抗坏血酸钠 还原上述混合溶液中的氯金酸形成取代嘧啶修饰的金纳米颗粒；纯化氨基嘧啶 修饰的金纳米颗粒。

本发明所述的金纳米颗粒可采用静脉注射、腹腔注射的给药方式。在本发 明的一个实施方案中，所述金纳米颗粒在小鼠中采用尾静脉注射的给药方式。 所述金纳米颗粒用于治疗和/或预防血栓，在本发明的一个实施方案中，所述金 纳米颗粒用于预防小鼠尾部血栓，在本发明的另一个实施方案中，所述金纳米 颗粒用于预防小鼠肺栓。所述金纳米颗粒单独使用或与其它抗凝血剂或抗血小 板剂联合用药，所述抗凝血剂或抗血小板剂为预防性抗凝血剂或抗血小板剂。

与现有技术相比，本发明至少具备以下优点：

(1)本发明将没有抗凝活性的取代嘧啶部分，没有抗凝活性的未取代的金 纳米颗粒通过S-Au键相连，并首次应用于抗凝领域，所得的取代嘧啶修饰的金 纳米颗粒取得了出乎意料的抗凝效果。

(2)较已知文献报道的金纳米颗粒，本发明所述的取代嘧啶修饰的金纳米 颗粒，制备方法简单，纳米颗粒粒径分布小，颗粒在水中分散性好，能在4℃ 或-20℃保存至少一年，冻干颗粒仍可溶于水。

(3)在正常剂量下，本发明所述的金纳米颗粒不会引起出血副作用，克服 了传统抗凝药物的一大缺点，是一种新型高效副作用小的抗凝血剂或抗血小板 剂。

附图说明

图1为本发明所述的Au_DAPT的结构。

图2为本发明所述的Au_DAPT的透射电镜图片。

图3为具有不同Au与DAPT摩尔含量比的金纳米颗粒的电镜图片。

图4为具有不同Au与DAPT摩尔质量比的金纳米颗粒连同对照DAPT、肝 素、柠檬酸金的凝血时间测试图。

图5为金纳米颗粒延长动物凝血时间图。

图6为金纳米颗粒对小鼠APTT和PT的影响。

图7为金纳米颗粒对小鼠尾部血栓的影响。

图8为金纳米颗粒对小鼠肺栓塞的影响，其中(a)为不同组别的小鼠存活 率，(b)为对照组和金纳米颗粒组的肺部组织图。

图9为金纳米颗粒是否导致动物出血图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1取代嘧啶修饰的金纳米颗粒Au_DAPT的制备

(1)配置反应溶液

配置5mM氯金酸甲醇溶液：将41mg氯金酸溶于20mL无水甲醇；

配置10mM的2-巯基-4,6-二氨基嘧啶溶液：将14mg的2-巯基-4,6-二氨基 嘧啶(DAPT)加入10mL无水甲醇中，并加入200μL无水乙酸和50μL吐温80， 超声溶解；

配置60mM硼氢化钠甲醇溶液：将12mg硼氢化钠溶于3mL甲醇，即配即 用；

(2)还原反应制得纳米金颗粒

在冰浴下，将20mL氯金酸甲醇溶液和10mL的2-巯基-4,6-二氨基嘧啶溶液 混合放入50mL圆底烧瓶中，使用磁子搅拌10min；

加快搅拌速度，滴加硼氢化钠甲醇溶液，在2min之内滴完，之后降低搅拌 速度继续在冰浴下搅拌1h，得到深红色溶液；

(3)纯化Au_DAPT

将得到的深红色溶液通过旋蒸法除去甲醇，加入5mL纯水，用截留分子量 为14KDa的透析袋在纯水中透析48h(每3-4h换一次水)；透析后的金纳米溶 液经0.22m微孔滤器过滤除菌，得到的Au_DAPT水溶液可在4℃保存或冻干后 -20℃保存。Au_DAPT的结构和TEM图见图1和图2。

实施例2取代嘧啶修饰的金纳米颗粒Au_APT和Au_DHPT的制备

Au_APT(APT为2-巯基-4-氨基嘧啶)和Au_DHPT(DHPT为2巯基-4,6- 二羟基嘧啶)的合成方法与Au_DAPT相似，将DAPT换成等摩尔的APT和 DHPT即可。

实施例3对具有不同金元素与取代嘧啶分子摩尔含量比的金纳米颗粒的考 察

分别制备Au和DAPT的摩尔含量比分别为1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:1、 1:2，分别对其进行透射电镜表征，如图3所示。，当Au和DAPT的配比为1： 0.125到1:0.25的时候，部分金纳米颗粒粒径较大，较易发生团聚现象。当Au 和DAPT配比为1:0.5到1:2的时候，金纳米颗粒分散性较好，粒径为3nm左 右。

表1不同金纳米颗粒的表面分子密度

根据XPS结果计算金纳米颗粒表面分子密度，当Au和DAPT配比为1:1 时表面分子密度最高。

将上述不同配比的金纳米颗粒连同对照DAPT、肝素heparin、柠檬酸金一 同进行凝血时间测试。其中当Au和DAPT的摩尔含量比为1:1的凝血时间延长 的最长。结果见图4.

实施例4血液凝固时间测定

不同剂量的Au_DPAT连同对照、DPAT和肝素heparin通过尾静脉注射到小 鼠体内，一小时后从小鼠眼底静脉丛中取两滴血，分别滴在清洗干净的载玻片 的两端，一滴血用来记录时间，另一滴血作为重复实验。立即启动秒表，每隔 30s用一根干净的9号针尖从血滴边缘往血滴中间移动并轻轻挑起，见到血丝形 成即可记录时间，为血液凝固时间。结果见图5。注射过Au_DAPT的小鼠，其 血液凝固时间明显延长，150μg/kg组的血液凝固时间为141.3±10.9s，而最高 剂量组600μg/kg组中的小鼠，其血液凝固时间被延长到了196.3±14.2s。

实施例5体内凝血参数测定

给大鼠按照150，300，600μg/kg的剂量尾静脉注射Au_DAPT，肝素 heparin组为阳性对照，PBS组为阴性对照，DAPT为其他对照组。1h后将小鼠 血液取到装有柠檬酸钠的抗凝管中，血液与柠檬酸钠的体积比例为9:1。贫血小 板血浆(PPP)通过将全血3000rpm离心20min制备。凝血参数活化部分凝血 酶时间(APTT)以及凝血酶原时间(PT)由国家北京药物安全评价研究中心进 行测量。结果见图6。正常对照组小鼠APTT和PT的值分别为27.29±0.68s和 13.05±0.16s。预先注射过金纳米颗粒的小鼠，其APTT值出现了明显延长，当 注射剂量为150μg/kg时，小鼠的APTT延长到了31.06±1.056s(p＝0.0094)， 当剂量增加到600μg/kg是，APTT增加到了40.33±4.627s(p＝0.001)。

实施例6小鼠尾部血栓形成实验

连续三天给小鼠尾静脉注射600μg/kgAu_DAPT，在最后一天给药1h后， 给小鼠背部皮下注射1％角叉菜胶(50mg/kg)来诱导尾部血栓形成。在24小时 后记录黑尾的长度。血栓生成率可以通过如下公式进行计算：

结果见图7，对照组小鼠黑尾长度为2.43±0.33cm，而Au_DAPT组小鼠黑 尾长度为1.08±0.27cm

实施例7小鼠肺栓塞实验

先给小鼠静脉注射600μg/kg的Au_DAPT，一个小时后，将1.25mg/kg的胶 原以及50μg/kg肾上腺素的混合溶液通过尾静脉以20μL/s的速度注射进入小鼠 体内进行肺栓塞模型的造模。造模后记录15分钟内的死亡小鼠数目并计算存活 率。每组小鼠8只，以500μg/kg肝素heparin作为阳性对照，PBS组作为阴性对 照，DAPT为其他对照组。之后，取出每只小鼠肺部组织，浸泡在多聚甲醛溶 液中，放置于4℃冰箱中过夜进行固定、脱水、包埋及HE染色。结果见图8. 未经过药物处理的对照组在接受胶原和肾上腺素混合物诱导的肺栓塞5分钟之 内存活率只有26.67％，而提前一小时给予600μg/kg金颗粒后可以提高小鼠存 活率到60％左右。之后，小鼠的肺部组织被取出，固定，脱水，并进行HE染 色观察，结果如图8b所示，对照组小鼠肺部组织可见大量血凝块，而预先给 予过金纳米颗粒的小鼠肺部组织中血凝块数量明显减少。

实施例8出血实验

首先把小鼠分为六组，每组8只，分别通过尾静脉给小鼠注射1mg/kg， 1.5mg/kg，2mg/kg的Au_DAPT，以及500μg/kg肝素heparin。DAPT和PBS组 作为对照。1小时后，给小鼠腹腔注射200μL的3％水合氯醛进行麻醉，小鼠进 入麻醉状态后，将尾部从尖端算起1cm剪掉，同时开始计时，每隔20s用滤纸 沾一下小鼠尾部伤口看是否出血，记录下来小鼠不再出血的时间，即为出血时 间。结果见图9。对照组小鼠的出血时间为126.3±8.4s。注射了1mg/kg的 Au_DAPT小鼠的出血时间为131.6±8.6s，虽然稍有延长，但是与对照组相比没 有明显差别(p>0.5)。1mg/kg剂量大于动物实验的有效剂量600μg/kg，这说 明金纳米颗粒在有效剂量下不会引起出血的危险。当金纳米颗粒的剂量升高到 1.5mg/kg和2mg/kg时，可以看到明显的出血(**:p<0.01,***:p<0.001)。目前常 用的肝素在正常剂量500μg/kg时也容易造成动物出血(*:p<0.05)，证明金纳 米颗粒的在出血方面的危险性要小于肝素。

本发明将没有抗凝活性的取代嘧啶部分，没有抗凝活性的未取代的金纳米 颗粒通过S-Au键相连，并首次应用于抗凝领域，所得的取代嘧啶修饰的金纳米 颗粒取得了出乎意料的抗凝效果；较已知文献报道的金纳米颗粒，本发明所述 的取代嘧啶修饰的金纳米颗粒，制备方法简单，纳米颗粒粒径分布小，颗粒在 水中分散性好，能在4℃或-20℃保存至少一年，冻干颗粒仍可溶于水；在正常 剂量下，本发明所述的金纳米颗粒不会引起出血副作用，克服了传统抗凝药物 的一大缺点，是一种新型高效副作用小的抗凝血剂或抗血小板剂。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明 并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实 施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品 各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保 护范围和公开范围之内。