Caveolin-1基因突变的快速检测方法

摘要

本发明提供了一种窖蛋白-1（Caveolin-1）基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：在Caveolin-1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物对两种突变型片段进行PCR扩增，扩增对应的突变型模板；不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时 定量PCR技术。

背景技术：

Caveolin-1基因位于人7q31.1上，含有3个外显子。在哺乳动物细胞内 的Caveolin-1可根据N端的不同分为α型和β型(Caveolin-1α和 Caveolin-1β)，它们的主要区别在DNA转录成mRNA时来自不同的起点。 Caveolin-1α为24kDa，有178个氨基酸残基组成；Caveolin-1β为21kDa， 由147个氨基酸残基组成。

Caveolin-1通过调控细胞周期抑制肿瘤发生。Caveolin-1正常表达后通 过其N末端与周期蛋白D1（CyclinDl）基因的启动子结合，抑制CyclinDl的 活性。Caveolin-1可以隔离脂肪中的磷酸化酪氨酸蛋白激酶Fyn（同步原癌 基因）和SH2携带蛋白（Src homology 2 domain containing，Shc），阻止 他们与α整合素相互作用，从而抑制层粘连蛋白诱导的细胞外调节蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases,ERK）活化，通过核转录因 子原癌基因蛋白（Jun）、即刻早期基因蛋白（Fos）和周期素D（Cyclin D） 实现对细胞周期的负调控。Caveolin-1与鸟类肉瘤Schmidt-Ruppin A-2病毒 癌基因同源物（c-Src）发生交互作用，抑制Src酪氨酸激酶的磷酸化，阻止 其信号的向下传导。Caveolin-1抑制原癌基因唾液酸酶（Neu）表达产物的自 身磷酸化，阻断Neu的信号传导。此外，Caveolin-1还能引起表皮生长因子 （Epidermal growth factor，EGF）、成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth  factor，FGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor， PDGF）和转化生长因子等的表达下调。通过多种途径，Caveolin-1抑制肿瘤 的发生发展。

Caveolin-1基因的突变引起其表达产物表达的降低或活性的减弱，抑制 其生理功能，与肿瘤的发生发展相关。在乳腺癌和胰腺癌中，Caveolin-1基 因的突变率分别为35％和7％-10％。尤其是第132号密码子的P＞L的突变，是 肿瘤细胞及组织中的热点突变。Lee等[6]在乳腺癌研究中发现Caveolin-1基 因P132L的突变率达到16％。

众所周知，高分辨熔解曲线(high-re solution melt，HRM)分析技术是近 几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。 它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异 性探针，在PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应结束后直 接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、 配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭 管操作，HRM技术受到普遍关注。而，高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解 曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分 析算法；使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异 （SNPs,mutations)。SYBR  Green I对PCR扩增有毒性，因此必需使用低浓 度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其 无法适用于HRM。

与此同时，罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green， 它有三个优点：1、饱和染料毒性低；2、浓度可以使DNA达到饱和；3、降低 了染料位置重组的可能。而，PCR（Polymerase Chain Reaction）产物的高 分辨率熔解曲线HRM的要求:仪器:高分辨率高、均一性的仪器，确保结果差 异仅受DNA模板的影响；试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率 熔解曲线；软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件。罗氏荧光定量PCR系统 LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完 全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于 临床诊断检测。LightCycler Nano System是LightCycler 480System的缩小 版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定 量PCR系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生 理、诊断等影响因子10分以上5篇，包括Nature,Nature Methods,Nature  Genetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势 明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存 在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的 实现Caveolin-1基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。

发明内容：

本发明要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

为了解决以上问题，本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物， 并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型片 段，再用野生型引物以两个突变片段为模板进行PCR扩增，得到突变型模板， PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)：PCR产物的 Tm取决于GC含量.

高Tm G∶C>A∶T>G∶G>G∶T=G∶A＞T:T=A∶A>T:C>A∶C>C∶C低Tm

纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；当然， 包括野生型纯合子或突变纯合子。

杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.

即，为解决上述技术问题，本发明提供了一种Caveolin-1基因突变的快 速检测方法，其特征在于，其包括如下实现步骤：

在Caveolin-1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上 设计一对突变引物；

分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物对两种突变型片 段进行PCR扩增，扩增对应的突变型模板；

不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分。

所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR 产物的Tm取决于GC含量.

所述高Tm G∶C>A∶T>G∶G>G∶T=G∶A＞T:T=A∶A>T:C>A∶C>C∶C 低Tm。

所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲 线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到 不同峰形的熔解曲线.

所述不同比例混合这两种模板，使突变型模板的含量为1/10、1/100、 1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。

设计了Caveolin-1P132L的野生型引物和突变型引物。

一种Caveolin-1基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：

样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存； DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯 度和浓度作检测；

qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；10μL反应体系构成； 在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管 置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；

结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线， 样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的 判定为野生型。

所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火 采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10 秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环;95℃变性60秒钟； 40℃变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃ /s）。

所述野生型目的片段的获取包括：以已知未突变基因组为模板，Caveolin-1F+ Caveolin-1R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将 目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL，作为检测野生型阴性对 照模板用。

所述Caveolin-1突变型目的片段的获取包括：

第一步利用带有突变位点的突变引物（Caveolin-1P132L F,Caveolin-1 P132L R）获得突变位点前后两段突变片段；

第二步将这两段突变片段连接起来，构成Caveolin-1突变型目的片段。

具体包括如下步骤：

1)突变第一步PCR，以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以Caveolin-1 F+Caveolin-1P132L R，Caveolin-1 P132L F+Caveolin-1R为引物 进行两组实验，获得两个条带单一的片段；

2)突变第一步产物稀释，将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1 万-10万倍，终浓度约为10ng/μL；

3)突变第二步PCR，以稀释后的第一步两段产物为模板，以 Caveolin-1F+Caveolin-1R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片 段；

4)突变第二步产物稀释，将突变第二步获得的PCR产物稀释1万 -10万倍，终浓度约为10ng/μL。

本发明的有益效果是：本发明分别设计了Caveolin-1的野生型引物和突 变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混 合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后 用HRM方法进行区分，采用了高分辨率熔解曲线法（HRM法）；与其它方法相 比，本发明的HRM法能检出0.1％的突变、检测时间只需要1小时、每样品试 剂耗材成本<￥7.00，即，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的 优点；而且通量更高，单次成本更低。

附图说明：

图1为本发明为用野生型引物检测Caveolin-1的1/10、1/100、1/1000突变 型和野生型模板的HRM图；

具体实施方式：

本发明应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实 时定量PCR技术。

如图所示，本发明设计了Caveolin-1的野生型引物和突变型引物，分别 扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段， 使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行 区分。下面以Caveolin-1P132L为例，说明具体的操作。

1、样本处理：取外周血2ml于EDT1A抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保 存。

2、DNA提取：取200μL抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取 DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测。

3、qPCR-HRM检测的体系：

1)对照的设立和检测重复孔

每个样本的检测必须同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和m/w(突 变/野生=1％)阳性对照。对照和样本均采用复孔。

2)10μL反应体系构成（引物序列见附表）

3)在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀，盖上八连管盖子。

4)所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统 -LightCycler Nano仪器中，注意仪器中A组与D组平衡，合上仪器盖子。

4、qPCR-HRM检测的程序：

1)95℃变性10分钟；

2)95℃变性10秒钟；

3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1 ℃，时间为10秒钟；

4)72℃延伸30秒钟；

5)重复第2步到第四步45个循环;

6)95℃变性60秒钟；

7)40℃变性60秒钟；

8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s）。

5、结果分析：

1)设置好样本名称、检测靶点和所使用的荧光染料。

2)通过各孔的熔解曲线图可以查看各孔PCR条带特异性；以野生型样 品孔为基线，通过高分辨率熔解曲线，可以查看阳性对照孔与样本孔图谱。

3)结果判定

在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差 异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

4)获取结果图。

6、野生型目的片段的获取

以已知未突变基因组为模板，Caveolin-1F+Caveolin-1R为引物进行 实验，参照步骤3及步骤4的反应体系及程序，获得条带单一的特异性野生 型目的片段。

将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL，作为检测野生型 阴性对照模板用。

7、Caveolin-1突变型目的片段的获取

突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物 （Caveolin-1P132L F,Caveol in-1P132L R）获得突变位点前后两段突变 片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成Caveolin-1突变型目的片段。

1）突变第一步PCR

以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以Caveolin-1F+Caveolin-1 P132L R，Caveolin-1P132L F+Caveolin-1R为引物进行两组实验，实验 体系及程序参照步骤3及步骤4，获得两个条带单一的片段。

2）突变第一步产物稀释

将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为 10ng/μL。

3）突变第二步PCR

以稀释后的第一步两段产物为模板，以Caveolin-1F+Caveolin-1R 为引物进行第二步PCR，实验体系及程序参照步骤3及步骤4，获得条带 单一的片段。

4）突变第二步产物稀释

将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL。

8、M/W＝1/10、1/100、1/1000阳性对照模板的获取

混合9μL野生型模板和1μL突变型模板，配制10μL突变型/野生型 （M/W)=1/10的混合模板，作为检测用1/10阳性对照模板；将此模板用野生 型模板作10倍稀释，分别获得突变型/野生型（M/W)=1/100、1/1000的混合 模板，作为检测用1/100、1/1000阳性对照模板

9、结果分析

通过HRM方法，我们能区分含1/1000突变型的模板，证明了这个方法的 高特异性和高灵敏度，而且，整个操作时间只需要1小时。

10、附表：Caveolin-1P132L检测引物序列

  引物 引物序列（5’-3’）

  Caveolin-1F CTTCACTGTGACGAAATACTGGTTT   Caveolin-1R TTGCTGAATATTTTCCCAACAGCTT   Caveolin-1P132L F CTGGGCAGTTGTACTATGCATTAAGAG   Caveolin-1P132L R CTCTTAATGCATAGTACAACTGCCCAG

与其它方法相比，本发明技术具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优 点；而且通量更高，单次成本更低！

上述优选实施例的描述使本领域的技术人员能制造或使用本发明。这些 实施例的各种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的，这里定义的一 般原理可以被应用于其它实施例中而不背离本发明的精神或范围。因此，本 发明并不限于这里示出的实施例，而要符合与这里揭示的原理和新颖特征一 致的最宽泛的范围。