一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法

摘要

本发明提供一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，主要涉及分析生物化学技术领域，本发明主要设计了一对引物P1，引物序列为：上游引物F：5'—CGTGCCCAACGAACTCTT—3'；下游引物R：5'—CAGGGCGAACATGTGGA—3'，经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在鸭DNA特异性地扩增出约523bp的PCR条带，再通过PCR—RFLP技术，最终观察酶切结果。本发明所提供的标记方法具有快速、灵敏、特异等优点，可在家鸭、番鸭和半番鸭群体上提供一种可靠的鉴定方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种有效鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，属于分析生物化学技术领域。

背景技术

DNA分子标记是以个体间核苷酸变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上检测生物个体间的差异，是生物个体在DNA水平上遗传变异的直接反映，与应用表型性状、生产性能、生化标记等方法相比，更能真实的反映禽种的遗传背景和亲缘关系。利用家禽品种DNA遗传标记技术，其结果可作为鉴定家禽品种真伪的科学依据。

DNA溯源技术使用的分子标记有AFLP（扩增片段长度多态性）标记、SSR（微卫星）标记和SNP（单核苷酸多态性）标记。SNP标记是1996年美国学者提出的第三代DNA分子标记。SNP是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。SNP是可遗传的变异中最常见的一种，具有分布广密度高的特点，平均每1000个碱基便有1个SNP存在。SNP标记因分布广泛，遗传稳定，并且适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记，并逐步取代AFLP标记和SSR标记。

SNP标记是基因序列单个核苷酸发生变异而产生多态性的DNA分子标记，其是二等位基因多态，因此一个SNP理论上可以区分三个动物个体，包括两个纯合子和一个杂合子。本发明即利用SNP标记中的PCR-RFLP技术来区分家鸭、番鸭、半番鸭三类动物群体。该方法简便快捷、安全可靠、费用低廉，从本质上有效鉴定和区分家鸭、番鸭和半番鸭三类鸭群体。

目前，在雏苗市场上，品种来源不纯、以次充好的现象时有发生，该方法的发明，对于有效解决市场上家鸭、番鸭和半番鸭品种混乱，有效保护家鸭、番鸭和半番鸭品种纯正性和优良基因的流失均具有重要意义；同时，在一定程度上可以取代番鸭活体保种，为番鸭品种资源保存提供一种最安全、最可靠、维持费用最低的保存方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，本发明主要利用SNP标记中的PCR-RFLP技术来有效区分家鸭、番鸭、半番鸭三类动物群体。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在含SNP酶切位点的鸭MC1R基因编码区设计一对P1引物，引物序列为：

上游引物F：5'—CGTGCCCAACGA ACTCTT—3' ；

下游引物R：5'—CAGGGCGAACATGTGGA—3' 。

一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，其具体步骤包括：

（1）静脉采血，EDTA抗凝，-20℃保存；基因组DNA试剂盒提取总DNA，端粒酶（TE）溶解，-20℃保存备用；

（2）已设计好的引物上游引物：5'—GCCAGTGAGGGCAACCAGAG—3' 

下游引物：5'—CTACCAGGAGCACAGCACCA—3'分别对家鸭、番鸭和半番鸭的DNA进行扩增；产物回收、克隆并正反向测序；应用DNAStar中的SeqMan软件对测序结果进行比对，搜索SNP；

（3）引物的设计

利用软件Oligo 6.0和Primer Primer5.0，在含SNP酶切位点的鸭MC1R基因编码区设计一对引物P1，上游引物F与下游引物R；预期扩增出约523bp的PCR条带；

（4）PCR扩增

利用引物P1对番鸭、半番鸭和家鸭基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为: 2 × Taq MasterMix 12.5μL，上游引物F 1μL，下游引物R 1μL，模板 DNA 2μL ，补充ddH2O 至终体积25μL；PCR 反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，55.5℃ 35 s，72℃ 40 s，共 35 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存；PCR 产物经质量分数为 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；

（5）PCR-RFLP检测

取扩增产物5-6μL，加入限制性内切酶Hin6Ⅰ 1μL，10×Buffer 1μL，加ddH₂O至终体积10μL，37℃酶切反应过夜，酶切产物用质量分数为3%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DL1000 DNA Marker作为分子量的标准对照，观察酶切结果，Bio-Rad凝胶成像系统观察拍照保存，由带型判断基因型；

（6）结果

利用引物P1对3类鸭群体进行扩增、克隆测序比对，发现A399G位于限制性酶切Hin6Ⅰ的识别位点（G*CGC），1个可用PCR-PFLP方法检测SNP的鸭MC1R基因标记，即为鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法。

鸭个体基因组DNA经引物P1扩增电泳后，得到一条亮度强、前后无非特异性带且大小与预期值吻合的523bp的目的条带 (图1)，因此可继续RFLP酶切分析。扩增产物有一个Hin6Ⅰ酶切位点，将产物切为334bp和189bp两个片段，其中AA基因型显示1条带(523bp)，GG基因型显示2条带(334bp+189bp)，杂合子AG基因型显示3条带（523bp+334bp+189bp）。各种基因型如图2所示。 

测定的家鸭品种包括北京鸭、闽农白鸭、莆田黑鸭、山麻鸭、台湾白改鸭、卡其康贝尔鸭。

本发明的优点在于：本发明方法可直接通过该DNA分子标记有效地区分家鸭、番鸭、半番鸭三类动物群体，可在家鸭、番鸭和半番鸭群体上提供一种可靠的鉴定方法，为鸭DNA基因库的长期保存和利用提供一定的技术支撑。

附图说明

图1 引物P1扩增产物电泳结果。

图2  PCR-RFLP酶切图谱。

具体实施方式

不同鸭群体基因型分布及等位基因频率见表1。由表1可知，MC1R基因A399G突变位点在家鸭、番鸭群体中分布非常单一，其中闽农白鸭、莆田黑鸭、北京鸭、山麻鸭、台湾白改鸭、卡基康贝尔鸭等家鸭个体基因型全部为GG，只存在一种等位基因G；白番鸭的基因型全部为AA，只存在一种等位基因A；该位点在半番鸭群体中呈低度多态，基因型以AG为主(0.981)，少数为GG(0.019)，A、G等位基因相当。

本研究利用PCR-RFLP技术检测了8个品种/群体MC1R基因A399G位点的多态性，结果表明，北京鸭、闽农白鸭、莆田黑鸭、台湾白改鸭、卡其康贝尔鸭、番鸭等6个品种均表现为极端的单态分布，其中5个家鸭品种的基因型均为GG型；番鸭的基因型则全部为AA型。这表明A399G位点在家鸭、番鸭内相当保守的；但在两者间却完全不同，该位点G等位基因只出现在家鸭中，A/G突变事件并不发生在番鸭中，这为家鸭和番鸭起源于不同属提供了新的佐证，说明家鸭与番鸭进化过程的某一阶段在该位点上产生了分化，进而出现了不同的纯合基因型。在本研究中，半番鸭虽具多态性，但属极低度多态，基因型几乎全为杂合子AG型，其频率高达0.981；GG型只占0.019（可忽略不计）；G等位基因频率几乎等于A等位基因，这可能与半番鸭为家鸭与番鸭属间杂交产物有关，该位点的基因型介于两亲本之间。

表1不同鸭群体基因型及等位基因频率

实施例1

⑴取血样30μL基因组DNA试剂盒提取总DNA，TE溶解，-20℃保存备用。

⑵利用引物P2对待测血样的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为: 2 × Taq MasterMix 12.5μL，上游引物(F) 1μL，下游引物（R）1μL，模板 DNA 2μL ，补充ddH₂O 至终体积25μL。PCR 反应条件:：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，55.5℃ 35 s，72℃ 40 s，共 35 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

⑶取扩增产物6μL，加入限制性内切酶Hin6Ⅰ1μL,10×Buffer 1μL，加ddH₂O至终体积10μL。37℃酶切反应过夜。酶切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DL1000的DNA Marker作为分子量的标准对照，观察酶切结果，Bio-Rad凝胶成像系统观察拍照保存，由带型判断基因型，进而对所检测血样的鸭品种进行判定。

⑷所测血样PCR产物酶切后仅出现1条带（523bp），说明该鸭种为番鸭。

实施例2

⑴取血样30μL基因组DNA试剂盒提取总DNA，TE溶解，-20℃保存备用。

⑵利用引物P2对待测血样的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为: 2 × Taq MasterMix 12.5μL，上游引物(F) 1μL，下游引物（R）1μL，模板 DNA 2μL ，补充ddH₂O 至终体积25μL。PCR 反应条件:：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，55.5℃ 35 s，72℃ 40 s，共 35 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

⑶取扩增产物6μL，加入限制性内切酶Hin6Ⅰ1μL,10×Buffer 1μL，加ddH2O至终体积10μL。37℃酶切反应过夜。酶切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DL1000的DNA Marker作为分子量的标准对照，观察酶切结果，Bio-Rad凝胶成像系统观察拍照保存，由带型判断基因型，进而对所检测血样的鸭品种进行判定。

⑷出现2条带(334bp+189bp)，说明该鸭种为家鸭。

实施例3

⑴取血样30μL基因组DNA试剂盒提取总DNA，TE溶解，-20℃保存备用。

⑵利用引物P2对待测血样的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为: 2 × Taq MasterMix 12.5μL，上游引物(F) 1μL，下游引物（R）1μL，模板 DNA 2μL ，补充ddH₂O至终体积25μL。PCR 反应条件:：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，55.5℃ 35 s，72℃ 40 s，共 35 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

⑶取扩增产物5μL，加入限制性内切酶Hin6Ⅰ1μL,10×Buffer 1μL，加ddH₂O至终体积10μL。37℃酶切反应过夜。酶切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DL1000的DNA Marker作为分子量的标准对照，观察酶切结果，Bio-Rad凝胶成像系统观察拍照保存，由带型判断基因型，进而对所检测血样的鸭品种进行判定。

⑷出现3条带（523bp+334bp+189bp），说明该鸭种为半番鸭。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

 

<120>一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法

 

<130>4

 

<160>4    

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

cgtgcccaac gaactctt                                                   18

 

 

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

cagggcgaac atgtgga                                                    17

 

 

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

gccagtgagg gcaaccagag                                                 20

 

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>4

ctaccaggag cacagcacca                                                 20