与中华绒螯蟹生长性状相关的EST-SSR分子标记及应用

摘要

本发明公开了与中华绒螯蟹生长性状相关的EST-SSR分子标记，所述分子标记命名为：SSR1107，由核心序列(TG)

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体地涉及一种与中华绒螯蟹生长性状 显著相关的EST-SSR分子标记，同时还涉及分子标记在中华绒螯蟹育种中的应用。

背景技术

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹，属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、 绒螯蟹属(Eriocheir)，是我国重要经济甲壳动物之一。养殖区遍布我国辽宁、河北、天津、 山东、江苏、浙江等沿海省份及广大的内陆地区，据2009年统计资料显示，全国河蟹养殖 涉及全国三十个省（市、自治区），面积达66.7万公顷，产量53万吨，产值280亿元，已 成为淡水渔业单品种产值最大的产业。

在我国很早就有河蟹养殖，上世纪70年代以前主要是靠采捕天然野生蟹苗进行人工粗 放养殖，80年代以增殖放流为主，90年代初随着河蟹育苗技术的突破，河蟹人工苗种规模 化生产，河蟹的池塘和湖泊网围养殖开始兴起，并迅速发展。近年来，在市场需求和经济 效益的推动下，河蟹人工苗种繁育和成蟹养殖规模不断扩大，河蟹养殖业蓬勃发展，并涌 现出各具地方特色的名牌产品，如驰名中外的阳澄湖大闸蟹，独具地方特色的七里海河蟹 等。河蟹养殖成为我国渔业生产中发展最为迅速、最具特色、最具潜力的支柱产业，有力 地带动了饲料、渔药、餐饮、旅游、贸易等相关产业的发展。

然而，河蟹产业快速发展，苗种生产缺乏必要、规范、科学的技术措施和手段，造成 了生长速度缓慢、性成熟个体偏小等种质退化现象的出现。养蟹业的可持续发展是以大量 优质高产的苗种为基础的，这就对河蟹育种工作提出了更高要求。生长性状作为育种目标 是典型的数量性状，其主要遗传特点是受多基因共同调控，由于环境条件等因素的影响， 表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系，而传统的育种方法主要依赖于个体表现型间接 对基因型进行选择，选择效率低，良种培育周期长，育种效果不佳。消除环境因素影响， 提高育种的选择效率与准确性，最理想的方法就是能够直接对基因型进行选择。

分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能，因为分子标记的基因型是可以识别 的。如果目标基因与某个分子标记紧密连锁，那么通过对分子标记基因型的检测，就能获 知目标基因的基因型。因此，我们能够借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，将分 子标记应用于育种工作当中。微卫星（Microsatellites）分子标记具有多态性丰富、遵循孟 德尔分离定律、共显性遗传等特点，目前已广泛应用于分子标记育种研究中。由表达序列 标签（EST）开发获得的EST-SSR标记，在保守性方面更优于基因组微卫星标记，更适用 于遗传育种技术领域。吴滟等在一个河蟹群体中对30个全基因组微卫星位点与生长性状进 行了相关分析，结果显示其中4个位点与典型生长性状呈显著相关。目前为止，尚未见中 华绒螯蟹EST-SSR分子标记与生长性状相关分析的报道。

发明内容

本发明的目的是填补中华绒螯蟹分子育种技术领域生长性状相关EST-SSR分子标记的 空白，提供了一种与中华绒螯蟹生长性状相关的EST-SSR分子标记。

本发明的第二个目的在于提供与中华绒螯蟹生长性状相关的EST-SSR分子标记在生长 性状育种中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种与中华绒螯蟹生长性状相关的EST-SSR分子标记，所述分子标记命名为： SSR1107，由核心序列(TG)_n、上游引物和下游引物组成，所述上游引物是SEQ ID NO.1 所示，下游引物由SEQ ID NO.2所示；n=7-9，

一种与中华绒螯蟹生长性状相关的EST-SSR分子标记的应用，包括如下步骤：

（1）在河蟹性成熟群体中随机挑选雌雄个体60只，逐个编号记录；

（2）每只河蟹剪取一只步足，用酚－氯仿法提取肌肉DNA；

（3）利用分子标记SSR1107对所挑选河蟹进行基因分型，保留含有基因型A的个体，作 为河蟹育种的亲蟹进行繁育生产；所述基因型A是指分子标记核心序列(TG)_n中的n=7。

本发明的优点：

本发明首次获得了一种与中华绒螯蟹生长性状显著相关的EST-SSR分子标记 SSR1107。克服了传统育种方法中，主要依靠表型性状选择，受环境因素影响较大，使生 长性状育种不仅难度大，而且效率低的不足。通过应用本发明的与中华绒螯蟹生长性状相 关的EST-SSR分子标记，可以快速准确筛选生长性状优良亲本用于河蟹育种，选择目标明 确，省时省力。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

F6代七里海河蟹群体生长性状表型值的测量和记录

在河蟹性成熟群体中随机挑选雌雄个体60只，逐个编号记录；

测量主要生长性状体长、体宽、体高、Ⅳ步足长节长（单位：mm）和体重（单位：g） 指标，记录个体性别，数据如表1所示。

表1中华绒螯蟹群体生长性状表型值

编号 体长 体宽 体高 Ⅳ步足长节长 体重 雌雄 1 61.76 71.90 32.88 49.12 184.06 ♂ 2 56.68 63.16 31.56 40.38 108.96 ♀ 3 54.34 60.30 29.32 42.46 114.22 ♂ 4 49.56 55.34 28.44 35.10 77.46 ♀ 5 62.18 69.12 33.98 49.62 184.92 ♂ 6 60.90 68.52 33.32 47.26 160.32 ♂ 7 54.54 60.82 29.00 44.62 117.96 ♂ 8 53.00 60.86 28.86 42.44 110.38 ♂ 9 53.52 59.42 29.78 42.24 109.92 ♂ 10 51.74 57.26 27.42 39.32 97.65 ♂ 11 46.68 51.06 26.26 36.28 60.08 ♀ 12 56.78 62.40 30.62 44.38 128.82 ♂ 13 51.12 57.36 29.00 38.22 81.38 ♀ 14 55.90 62.00 30.00 43.00 121.42 ♂ 15 55.00 60.88 31.18 38.58 100.87 ♀ 16 56.28 63.68 30.72 41.42 105.84 ♀ 17 54.52 59.42 29.06 42.32 103.93 ♂ 18 53.12 57.42 31.34 43.40 87.07 ♀ 19 65.60 67.48 35.64 45.80 155.20 ♂ 20 46.24 50.40 27.86 28.32 57.30 ♀ 21 44.54 49.92 26.42 23.98 54.03 ♀ 22 54.52 62.38 31.66 41.00 97.79 ♀ 23 50.02 56.18 29.12 36.20 76.49 ♀ 24 54.52 60.06 34.08 39.54 100.24 ♀ 25 50.44 55.78 29.14 38.10 76.19 ♀ 26 56.18 62.16 32.54 40.58 108.20 ♀ 27 47.78 52.58 27.92 36.20 63.98 ♀ 28 50.72 56.22 28.00 40.32 91.20 ♂ 29 60.80 67.52 34.72 47.66 155.31 ♂ 30 51.00 58.44 29.56 37.56 81.66 ♀ 31 57.78 64.56 32.88 48.52 146.38 ♂ 32 56.80 64.84 33.18 42.72 132.62 ♂ 33 47.66 52.56 27.18 29.14 63.21 ♀ 34 50.42 55.18 29.32 34.82 76.15 ♀ 35 52.60 56.10 29.50 36.90 78.10 ♀ 36 54.30 58.30 31.70 37.90 85.06 ♀ 37 62.30 66.50 35.50 50.80 158.40 ♂ 38 56.10 60.80 39.20 41.60 115.90 ♂ 39 49.10 54.20 27.20 38.50 66.90 ♂ 40 56.70 62.90 31.80 44.20 116.90 ♂ 41 46.00 51.70 25.56 36.22 61.22 ♂ 42 47.20 51.24 28.74 34.86 57.14 ♀ 43 43.94 47.44 26.22 31.62 43.96 ♀ 44 56.04 61.26 34.06 39.76 94.15 ♀ 45 58.06 63.24 32.54 39.76 119.29 ♂ 46 52.34 56.18 30.54 35.64 76.18 ♀ 47 57.46 61.92 32.26 46.46 125.24 ♂ 48 58.94 64.60 34.38 44.72 125.80 ♂ 49 56.60 66.60 34.20 39.36 96.42 ♀ 50 50.98 54.94 28.00 40.12 82.22 ♂ 51 53.50 58.88 30.24 42.66 95.60 ♂ 52 53.76 59.02 30.44 42.66 98.04 ♂ 53 55.54 61.00 30.66 44.22 106.95 ♂ 54 52.76 57.64 30.34 38.34 79.80 ♀ 55 50.80 52.62 31.46 35.68 71.40 ♀ 56 62.20 69.02 38.90 41.98 138.85 ♀ 57 65.36 72.36 37.06 50.00 188.00 ♂ 58 50.74 55.86 27.32 33.42 83.15 ♀ 59 50.66 53.90 27.22 32.42 80.64 ♀ 60 54.62 59.88 30.04 35.24 103.72 ♀

实施例2.中华绒螯蟹F6代选育群体肌肉总DNA的提取（每只河蟹剪取一只步足）

采用酚－氯仿法提取肌肉总DNA，具体步骤如下：

1）切取冷冻保存的肌肉样品100mg，切碎放入1.5ml灭菌离心管中；

2）加入抽提缓冲液（6M尿素，10mM Tris-HCl，125mM NaCl，1％SDS，10mM EDTA， pH7.5）500μl，蛋白酶K（20mg/ml）8μl，37℃消化过夜；

3）样品完全消化后，加入等体积的PCI（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1），旋转搅拌20min， 5000rpm室温离心15min，取上清液于另一新的灭菌离心管中。重复PCI抽提3次；

4）将上清液小心转入新离心管中，加入等体积的CI（氯仿:异戊醇=24:1），旋转搅拌 10min，5000rpm室温离心15min，取上清液。重复CI抽提3次；

5）将上清液和1/10体积的醋酸钠（3M，pH5.2）混合，再加入2.5倍体积预冷的100 ％无水乙醇，-20℃过夜保存、沉淀DNA；

6）混合液在4℃，12000rpm离心15min。小心倒出所有液体，注意不让底部的白色 沉淀颗粒倒出；

7）用预冷的70％乙醇洗涤2次，再用预冷的无水乙醇洗涤置换1次；

8）待DNA完全干燥后，溶于50μl1×TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0） 中，4℃溶解过夜；

9）用紫外分光光度计将DNA浓度调整为100ng/μl，置于4℃备用。

实施例3.EST-SSR分子标记的开发

1）登陆NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）搜索中华绒螯蟹EST序列， 在线（http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool）查找含有微卫星序列的cDNA片段，标 准是重复次数在5次以上（包括5次）；

2）根据测序结果和EST数据库筛选结果，选取含有微卫星序列的合适DNA片断，利 用Primer Premier5.0(http://www.premierbiosoft.com/)软件设计引物，并送与上海生工合成。 设计引物所考虑的理论参数包括：GC含量、退火温度、错配、引物二聚体、发夹结构、3’ 端末位碱基及其稳定性等；

3）对所合成引物进行梯度PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳EB染色初步筛选，并确定每对 引物的最适退火温度，选取能扩增出单一清晰条带的引物；

实施例4.EST-SSR分子标记多态性的筛选

1）从F6代七里海河蟹群体中随机选择10个样品，作为筛选引物多态性的模板进行 PCR扩增反应；

2）10μl PCR反应体系包含100ng模板DNA，2mM dNTP，1.5mM MgCl₂，0.25U Taq 酶，各10μM正反向引物和1×Buffer；

3）PCR反应程序为94℃3min；94℃1min，退火1min，72℃1min，循环35 次；72℃延伸5min。

4）变性聚丙烯酰胺凝胶板的制备：

A.银染测序用的玻璃板一定要非常清洁，一般先用去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻 璃板，最后用乙醇擦洗。

B.每次灌胶前均需分别严格处理清洗过的方玻璃和耳玻璃。耳玻璃板擦拭1ml2％的 剥离硅烷（Repel Silane），方玻璃板用亲和硅烷（Binding Silane）（1.5ml无水乙醇，7.5μl 冰乙酸，2μl0.5％亲和硅烷）进行硅化。方、耳玻璃板轮流处理过程中，要先更换手套， 防止两块硅烷交叉污染。硅烷化后至少干燥10min。

C.进行玻璃板组装。用0.4mm厚的边条置于方玻璃板左右两侧，将耳玻璃板压于其 上，两侧用夹子固定住。使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量 不足使灌胶的过程中出现漏液现象。

D.将60ml6％变性聚丙烯酰胺凝胶储存液（420g尿素，57g丙烯酰胺，3g甲叉双丙 烯酰胺，100ml10×TBE，溶于灭菌双蒸水，定容至1L，4℃保存备用），加入0.024g过 硫酸铵和24μl TEMED后，沿灌胶口轻轻灌入，待胶流动到玻璃板底部，在灌胶口轻轻插 入鲨鱼齿梳。注意灌胶过程中要严格防止出现气泡，否则影响测序的结果。灌胶结束后， 静止放置使之聚合至少2.5h，若让胶过夜，在胶的两头铺上保鲜膜以防干胶。

5)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：

A.当凝胶聚合完全后，拔出鲨鱼齿梳，将玻璃板组装到电泳槽上，稀释10×TBE缓冲 液至1×TBE，将该缓冲液加入上下两个电泳槽中，60W恒功率预电泳30min。预电泳的 过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区 形成的发夹状结构，影响测序的结果。

B.预电泳同时，进行样品的制备。PCR产物与甲酰胺变性剂1:1混合，95℃变性5min， 然后立即冰浴。

C.预电泳结束后，关闭电源，用针管吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来 的尿素。将鲨鱼齿梳反过来，把有齿的一边插入凝胶中。每一个点样孔点入6μl经变性的 样品。加样完毕后，立即60W恒功率电泳。

6）硝酸银染色和显影：

A.电泳完毕后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在涂亲和硅烷的方玻璃板上。

B.固定：将凝胶板置于10％冰醋酸溶液（固定/停止液）中，轻轻摇动15-30min至样 品中染料完全消失。

C.冲洗：用三蒸水振荡洗胶3次，每次5-10min。

D.染色：2L三蒸水中加入2g AgNO₃和3ml37％甲醛配成染色液，将凝胶板置于染 色液中充分摇动40min。

E.冲洗：从染色液中取出胶板放入三蒸水中浸洗5-10s。注意把凝胶从三蒸水转移到显 影液的时间不能过长，否则导致信号微弱，甚至丧失信号。

F.显影：将凝胶板迅速移到2L冷却的显影液中（2L水加入60g无水NaCO3，冷却 至4℃，使用前加入37％甲醛3.5ml，10mg/ml硫代硫酸钠400μl），充分振荡直至带纹 出现。

G.定影：固定/停止液中定影3-5min。

H.冲洗：在三蒸水浸洗凝胶3-5min。

I.干燥保存：等胶板干燥后将其扫描成图像文件保存。

实施例5.EST-SSR多态性引物在中华绒螯蟹群体中的基因分型及与生长性状相关性分析

1）以河蟹群体基因组DNA作为模板，对初筛引物进行PCR扩增反应、变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳分型，根据10bp DNA Marker人工读取扩增片断，使用分析软件GENEPOP3.4 （Raymond et al，1995）和MICROSATELLITE ANALYSER（MSA）（Dieringer et al，2003） 分析微卫星位点特性；

2）应用SPSS11.5软件，采用一般线性模型（General Linear Model,GLM），以标记基 因分型和河蟹性别为自变量，生长典型性状体长、体宽、体高、Ⅳ步足长节长和体重为因 变量，进行多元方差分析，并对检测出的具有与生长性状显著相关的标记进行标记内不同 基因型间的多重比较，找到与性状显著相关的基因型。

结果显示：标记SSR1107（扩增结果如表2所示，位点特性如表3所示）与主要生长 性状体长、体宽、Ⅳ步足长节长和体重呈显著相关（P<0.05）（表4和5），不同基因型间的 多重比较表明，基因型A的平均体长、体宽、体高、Ⅳ步足长节长和体重均高于基因型B 和C（表6和7），且基因型A与基因型B差异显著（P<0.05），基因型C属于稀有基因型， 出现概率仅为3%，因此可得出结论：基因型A是生长性状的优势基因型。所述基因型A 是指分子标记核心序列(TG)_n中的n=7，片段大小为167bp；基因型B指n=7和8，片段 大小为167bp和169bp；基因型C指n=7和9，片段大小为167bp和171bp。

表2分子标记SSR1107扩增结果

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 基因型 A A A B A A A A A A A A A A A A B A A A B A A A A A B B A A 编号 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 基因型 A A B A A C A A A A A B A A A A A A A C A A A A A A A A A A

表3微卫星位点SSR1107特性

注：引物序列F即为SEQ ID NO.1，R即为SEQ ID NO.2；重复单元(TG)_n中n=7-9

表4主体间因子

表5主体间效应的检验

a R方=.350(调整R方=.290)

b R方=.338(调整R方=.276)

c R方=.177(调整R方=.101)

d R方=.566(调整R方=.526)

e R方=.454(调整R方=.404)

表6估计

表7成对比较

基于估算边际均值

*均值差值在0.05水平差异显著。

a对多个比较的调整：最不显著差别（相当于未作调整）。

实施例6.一种与中华绒螯蟹生长性状显著相关的EST-SSR分子标记SSR1107在河蟹亲蟹 选育中的应用，其步骤是：

1）在河蟹性成熟群体中随机挑选雌雄个体60只，逐个编号记录，测量主要生长性状 体长、体宽、体高、Ⅳ步足长节长（单位：mm）和体重（单位：g）指标，记录个体性别， 数据如表8所示。

表8中华绒螯蟹群体生长性状表型值

编号 体长 体宽 体高 Ⅳ步足长节长 体重 性别 1 48.43 52.68 28.57 36.00 66.47 ♀ 2 46.26 50.98 23.75 37.91 60.72 ♂ 3 53.35 58.00 28.70 43.17 102.94 ♂ 4 46.70 46.68 22.76 33.58 48.94 ♂ 5 47.22 50.40 27.78 34.70 65.92 ♂ 6 44.04 49.92 24.62 32.18 51.66 ♀ 7 48.76 55.08 28.00 36.76 69.22 ♀ 8 47.56 50.50 26.58 34.60 54.29 ♀ 9 49.64 55.12 25.98 38.72 82.04 ♂ 10 44.32 47.26 24.00 33.84 51.42 ♂ 11 43.54 48.20 22.56 34.92 56.55 ♂ 13 48.28 55.56 26.12 40.96 81.10 ♂ 14 44.00 47.38 23.44 34.12 52.31 ♂ 15 42.32 46.72 24.44 30.72 45.35 ♀ 16 41.58 45.50 22.40 32.68 45.63 ♂ 17 43.74 48.12 22.52 34.64 55.11 ♂ 18 41.62 46.48 23.32 31.12 43.34 ♀ 20 45.70 50.20 23.46 36.78 60.57 ♂ 21 44.82 48.14 25.40 31.88 56.11 ♂ 22 47.96 55.28 26.06 30.80 70.22 ♂ 23 44.60 48.34 24.42 34.92 52.37 ♂ 24 44.74 49.18 24.54 31.62 53.01 ♀ 25 51.58 54.60 31.38 35.86 74.38 ♀ 26 48.12 52.88 26.62 33.14 63.61 ♀ 27 44.84 49.76 25.00 33.84 55.42 ♀ 28 42.56 44.72 23.84 30.00 39.29 ♀ 29 43.72 48.70 24.32 32.98 50.39 ♀ 30 47.56 51.58 29.04 32.78 62.63 ♀ 31 46.98 51.78 25.80 34.12 61.53 ♀ 32 41.04 45.78 22.12 28.40 39.99 ♀ 33 45.26 48.58 24.92 36.00 58.34 ♂ 34 42.64 47.46 22.60 34.48 52.94 ♂ 35 44.72 47.96 25.48 31.82 49.12 ♀ 36 45.44 49.26 24.30 32.82 52.04 ♀ 37 39.82 42.58 22.10 30.78 38.25 ♂ 38 43.44 49.00 23.14 36.72 55.16 ♂ 39 40.38 43.14 21.08 32.32 42.57 ♂ 40 44.32 47.92 26.40 31.22 47.23 ♀ 41 43.12 46.74 23.56 29.88 46.33 ♀ 42 43.34 48.12 24.48 32.56 49.91 ♂ 43 43.88 48.52 23.90 32.12 50.28 ♀ 44 43.52 45.84 24.44 29.92 42.70 ♀ 45 42.76 46.48 24.32 30.40 45.82 ♀ 46 42.62 46.00 24.38 30.00 42.91 ♀ 47 42.16 46.00 23.94 28.88 42.25 ♀ 48 38.84 42.36 32.62 28.84 32.48 ♀ 49 39.82 43.52 20.54 25.86 39.26 ♂ 50 39.92 43.54 20.88 30.62 40.68 ♂ 51 41.76 44.72 23.64 29.92 39.60 ♀ 53 39.52 44.42 21.62 29.58 37.97 ♀ 54 40.84 46.02 22.96 30.78 42.38 ♀ 56 44.32 49.64 23.34 35.52 58.04 ♂ 57 41.12 44.38 23.84 30.82 38.60 ♀ 58 46.00 49.38 24.92 33.24 59.36 ♂ 59 39.18 42.96 21.18 33.44 36.53 ♂ 60 43.24 48.14 23.82 34.72 53.62 ♂

2）每只河蟹剪取一只步足，操作中尽量减轻对河蟹造成的伤害，用酚－氯仿法提取肌 肉DNA（方法同实施例2）；

3）利用分子标记SSR1107对所挑选河蟹进行基因分型（方法同实施例5），结果如表 9所示，其中12、19、52、55号没有扩增条带。

表9分子标记SSR1107扩增结果

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 基因型 A A A A A A B B B B A A A A A A A A A C A A A A A A A A 编号 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 53 54 56 57 58 59 60 基因型 A B A A A A B B A A A A A A A B A A A A B B C A A B B A

4）应用SPSS11.5软件，采用一般线性模型（General Linear Model,GLM），以标记 SSR1107在河蟹群体中的基因分型和河蟹性别为自变量，生长典型性状体长、体宽、体高、 Ⅳ步足长节长和体重为因变量，进行多元方差分析和标记不同基因型间的多重比较。结果 如表10和表11所示：标记SSR1107在河蟹群体中的基因分型有A、B和C三种，其中基 因型C属于稀有基因型，出现概率仅为3.6%，在实际育种工作中该基因型可不予考虑；基 因型A的平均体长、体宽、体高、Ⅳ步足长节长和体重均高于基因型B，基因型A是生长 性状的优势基因型。所述基因型A是指分子标记核心序列(TG)_n中的n=7，片段大小为167 bp；基因型B指n=7和8，片段大小为167bp和169bp；基因型C指n=7和9，片段大小 为167bp和171bp。

5）进行分子标记选择育种，保留含有基因型A的个体，作为河蟹育种的亲蟹进行繁 育生产。

表10主体间因子

表11估计