人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物及其应用

摘要

人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物及其应用，涉及人类甲状腺癌组织基因。所述检测引物的序列包括上游扩增引物序列、生物素修饰下游扩增引物序列、焦磷酸测序引物序列。检测引物可在制备焦磷酸测序试剂盒中应用。试剂盒包括序列基因PCR扩增反应液、Taq DNA聚合酶、对照质控品、焦磷酸测序引物、包装盒。所述序列基因扩增PCR反应液，由PCR反应缓冲液、一对序列基因特异性上游扩增引物和生物素修饰的下游扩增引物组成。试剂盒使用方法：PCR扩增产物经DNA变性过程，纯化得到含生物素修饰的下游扩增引物的待测序单链，并和焦磷酸测序引物结合成杂交体，然后使用焦磷酸测序仪进行序列的检测与分析。

说明书

技术领域

本发明涉及人类甲状腺癌组织基因，尤其是涉及人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化 水平检测引物及其应用。

背景技术

2011年8月，由中华医学会内分泌学会完成的10个城市甲状腺疾病患病率调查结果显示， 在接受本次流行病学调查的十大城市1.5万多名居民中，甲状腺功能减退症患病率显著增加， 已达6.5%，甲状腺结节患病率高达18.6%，而单发结节导致甲状腺癌的发生率也在增加，在 儿童时期的甲状腺结节中，甲状腺癌的发病率高，约占50%～71%。早之前对甲状腺癌的统计 研究表明，甲状腺癌发病率约为2/10万，临床上比较罕见，因此也并未引起人们的重视。近 年来一些国家流行病学统计却发生了惊人的变化，例如美国1997年新发现甲状腺癌病例数几 乎是1977年发现病例数的1倍(16100∶8200)。以上统计说明甲状腺癌发病率趋势一直处 于增高阶段，而我国便属于高发区之一。甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）是内分泌系统中 最常见的肿瘤之一，其占癌症发病率的2.59%[1]，是近年来唯一以两位数速度增长的恶性肿 瘤，占据国内头颈部恶性肿瘤的发病首位。20世纪80年代后美国、欧洲开始对甲癌治疗的 规范化进行探讨以来，甲癌的治疗虽有不少进展,但尚未达到成熟阶段，仍存在有很多争议, 是头颈外科的重要课题。当前亟待解决的主要问题是避免治疗不足或治疗过度的两个极端 ［2］。

在诊断方面,甲状腺癌常以无痛性甲状腺结节为主要临床表现。在临床上主要通过触诊、 彩超、核素显像及细针穿刺细胞学检查(fine needle aspiration biopsy，FNAB)等方法进行诊断， 但却难以确定甲状腺结节的性质，即使病理活检，有时甲状腺腺瘤与结节性增生，良性肿瘤 与恶性肿瘤也不易明确辨认。为了避免对具有良性生物学行为的TC进行过度治疗，不断的 寻求新的肿瘤标志物，以提高甲状腺癌的诊断水平成为本领域的研究热点。近年来研究较多 的肿瘤标志物主要有β-半乳糖结合蛋白、间皮细胞表面微绒毛抗原-1、三叶因子、细胞角蛋 白、端粒酶反转录酶、血管内皮生长因子、降钙素、基质金属蛋白酶等以及相关的基因标志 物[3]。例如：TFF-3称肠三叶因子，Taniguchi等[4]应用标签接头竞争PCR技术 (adapter-tagged competitive PCR)对2000例甲状腺滤泡性肿瘤患者进行研究，得出TFF3 基因是诊断FTC最有价值的标志物，其实用性在随后相关研究中也得到证实[5-6]。而Ito等 [7]应用免疫组织化学方法检测了166例甲状腺肿瘤的端粒酶反转录酶hTERT表达，结过检测 hTER T对于鉴别PTC和腺瘤的特异性和阳性预测值分别高达90.2%和83.3%，从而得出 hTER T可以用来鉴别PTC和腺瘤的结论，这一结论也在其它研究中证实[8-9]。此外，还有 大量文献认为PAX8-PPARγ是鉴别FTC和良性病变的标志物[10]，lgeciras-Schimnich等[11] 应用RT-PCR及高分辨率片段分析对其进行临床试验检测，认为这项试验应用于临床有助于 甲状腺癌的诊断，能为甲状腺癌的预后和治疗提供有用的信息。尽管对于肿瘤标志物的研究 很多，方法也不同，但单一的肿瘤标志物因敏感性及特异性不高不能被广泛应用。一些标志 物可以作为FNAB的辅助诊断方法，但其真正应用于临床还需做大量的工作。

在治疗方面,甲状腺癌的治疗方法主要以手术为主，但对于转移性的、侵袭性的和晚期的 甲状腺癌患者来说，手术效果有限，而且碘放射治疗和化疗对这些恶性程度较高的肿瘤治疗 效果往往不太理想，因此分子靶向治疗的出现则为这些患者带来了新的希望。目前，研究的 甲状腺癌的分子靶点主要涉及到酪氨酸激酶受体RET（rearranged during transfection）蛋白[12] 和NTRK1蛋白，G蛋白H-RAS、K-RAS和N-RAS，信号调节激酶丝/苏氨酸特异性激酶 （serine-threonine protein kinase，B-RAF）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol-3kinase， PI3K）和AKT1，核转录因子PPARγ1等多个位点[13]，然而目前虽然甲状腺癌的分子靶向 治疗涉及众多复杂的细胞信号转导途径，分子理论水平的阐述与临床试验的结果对比表明某 些分子靶向药物的治疗效果还难以令人完全满意。

在检测方面,正如上所述，甲状腺癌在临床上虽能通过触诊、彩超、核素显像及细针穿刺 细胞学检查等方法来进行诊断，但却不能区分其良、恶性的情况，医生只能通过开刀，才能 去判定患者甲状腺癌状况，这就为明确诊断以及之后制定合理手术策略增加了难度麻烦以及 一定的危险性。所以，找出一种不用开刀，就可以区别甲状腺组织正常、增生、良性以及恶 性状态则成为研究关键。尽管目前甲状腺癌相关的肿瘤标志物已发现不少，但由于各研究者 使用的技术路线不同，采用的样本不同，环境的不同等一系列主客观因素，这些分子标记都 含有一定的不确定因素，没有一个可以明确的成为甲状腺癌理想的单一诊断标记。例如，先 后被Huang等[14]和Jarzab et等[15]发现的DPP44证明在PTC中是上调最大的基因，然即 使如此它也不能清晰的区分PTC和良性组织。无论是国外还是国内研究者，在进行基因研究 时不可避免的会受到多种因素的干扰，例如选取多个对象进行基因研究时会受到这些对象不 同的年龄、性别、不同的生活习惯、存在的其它疾病等因素影响，虽然有的研究者会在数据 分析时根据影响因素不同而分类，然未知因素太多，我们不能确定是否所有影响因素都包含 在内。能简单明确的区分甲状腺增生，甲状腺癌和甲状腺瘤有助于医生之后采取合理的治疗 手段，研究者对这三种状态的研究对比都是在不同对象上进行，也就是说目前还未有研究能 针对一个同时拥有甲状腺癌，甲状腺增生以及甲状腺瘤的对象来进行调查的。选用从同一个 病人身上得到的这三种状态的组织进行研究，便减少了由于个体差异，环境因素等所带来的 干扰，可以提供出更加确定的生物标记或药物靶标，具有很大的创新性和实用性。对来自同 一个病人身上的甲状腺正常，增生，癌以及瘤间的研究，更能明确的研究出在一个机体中甲 状腺从正常转化为癌，瘤，增生组织的机理，为未来的靶向药物治疗奠定基础。且正常对照 组也来源于同一病人，保证了实验结果的准确性。

近年来，表观遗传学与癌症的关系越来越多的被报道。其中，DNA甲基化是重要的表观 遗传修饰，主要发生在DNA的CpG岛。DNA的甲基化通过DNA甲基转移酶（DNA  methyltransferases,DNMTs）完成。DNA甲基化参与了细胞分化、基因组稳定性、X染色体失 活、基因印记等多种细胞生物学过程。单基因水平及基因组范围内的DNA甲基化改变在肿 瘤发生发展中亦发挥重要作用。抑癌基因的异常甲基化引起的表达抑制，可导致肿瘤细胞的 增殖失控和侵袭转移，并参与肿瘤组织的血管生成过程。在许多肿瘤的研究中都发现了基因 组整体DNA低甲基化所导致的染色体不稳定性。从DNA的异常高甲基化和低甲基化两方面 论述了DNA甲基化在细胞恶变发生发展过程中的改变及其影响,并阐述了DNA甲基化改变在 肿瘤诊断和治疗中的作用。研究通过利用甲基化芯片技术对同一病人体内良性和恶性的甲状 腺肿瘤组织进行检测，使用生物信息学分析的方法发现LIME1基因特异位点(20号染色体反 链第62367888号位CG)发生甲基化，并且差异显著，可以作为辨别甲状腺组织是否为恶性的 诊断标志物。

无容置疑，甲状腺癌严重影响大众健康，消耗医疗资源，需要政府部门与医学界给予 共同的关注，随着现代医疗模式向标准化服务的转化,实施甲状腺疾病的规范化诊治是国际 临床内分泌学界的普遍趋势,也是我国临床内分泌代谢病学界长久的期望。研究甲状腺癌的 病理过程，优化诊断手段，以及治疗策略，对于规范和提高我国甲状腺疾病的临床诊治水平, 保障国人甲状腺健康具有重要意义。并且甲状腺癌（简称甲癌）已占据头颈部癌的发病首位， 为临床常见手术。当前甲癌术前检查为：查体、彩超、ECT等。仍缺有效的甲癌分子检测方 法及诊断试剂产品。

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发明内容

本发明的目的之一在于提供一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物。

本发明的目的之二在于提供一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物在 制备焦磷酸测序试剂盒中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种既快速、准确，并且易于标准化的焦磷酸测序试剂盒的 使用方法。

所述一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物的序列包括：

上游扩增引物序列为：5’-GTTTTTTTTGAGTTTTTTATTTTGGGTAGT-3’；生物素修饰下 游扩增引物序列为：5’-ATTTAAAAATTCTATACCAACTCTACTCAC-3’-Biotin；焦磷酸测序引 物序列为：5’-GAGTTTTTTATTTTGGGTAGTA-3’。

所述一种人类甲状腺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物可在制备焦磷酸测序试剂 盒中应用。

所述焦磷酸测序试剂盒包括序列基因PCR扩增反应液、Taq DNA聚合酶、对照质控品、 焦磷酸测序引物、包装盒。

所述序列基因扩增PCR反应液，由PCR反应缓冲液、一对序列基因特异性上游扩增引 物和生物素修饰的下游扩增引物组成。

所述一对序列基因特异性上游扩增引物的终浓度可为0.2μM，所述生物素修饰的下游扩 增引物的终浓度可为0.2μM；所述序列基因PCR扩增反应液的最佳PCR扩增模板量可为 50ng。

PCR的扩增程序为：第一阶段：95℃15min1个循环；第二阶段：94℃30s，56℃30s， 72℃30s，45个循环；第三阶段：72℃10min，一个循环。

所述焦磷酸测序试剂盒的使用方法：PCR扩增产物经DNA变性过程，纯化得到含生物 素修饰的下游扩增引物的待测序单链，并和焦磷酸测序引物结合成杂交体，然后使用焦磷酸 测序仪进行序列的检测与分析。

本发明可用于检测甲状腺癌组织，实现甲癌的诊断和大面积低成本筛查，具有良好的社 会效益。且在癌症检测领域，很少有基于甲基化检测的报道。

本发明的优点是：（1）设计了5’端生物素修饰了的序列基因扩增引物，方便后续富集测 序；（2）运用焦磷酸测序检测方法，能够精确反应检测位点的甲基化水平；（3）检测速度快， 整个焦磷酸测序检测与分析过程只需要15min。

附图说明

图1为焦磷酸测序试剂盒的结构组成示意图。

图2为上游扩增引物序列、生物素修饰下游扩增引物序列、焦磷酸测序引物序列设计程 序界面。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明，而不是限制本发明。

参见图1，本发明所述焦磷酸测序试剂盒实施例包括盒体A、隔板B、序列基因PCR扩 增反应液1、Taq DNA聚合酶2、对照质控品3、焦磷酸测序引物4；隔板B设在盒体内，序 列基因PCR扩增反应液1、Taq DNA聚合酶2、对照质控品3、焦磷酸测序引物4分隔在隔 板B中。

实施例1焦磷酸测序试剂盒及其使用方法

1制备包括下列组成成分的试剂盒：序列基因扩增PCR反应液（1200μL）1管、Taq酶 系（30μL）1管、对照品（300μL）1管、焦磷酸测序引物（200μL）。其中上游扩增引物序列、 生物素修饰下游扩增引物序列、焦磷酸测序引物序列设计使用Qiagen PyroMark Assay Design  SW2.0（货号：9019077）引物设计软件（设计界面见图2）。

2样本的采集、保存和运输：

2.1使用样本类型：新鲜组织、冷冻组织。

2.2样本采集：手术后将肿瘤组织立即放入液氮冷冻并保存于－80℃。

2.3样本的保存和运输：新鲜组织、冷冻组织保存在－80℃，保存期为2年。样本长途运 送采用干冰。

3核酸抽提：

建议使用天根DNA提取试剂盒。按照说明书进行操作，最后用30μL无菌水溶解，之后 进行亚硫酸盐处理。

4亚硫酸氢盐转化：（建议使用QIAGEN EpiTect Bisulfite Kits试剂盒）

4.1反应体系配置参见表1。

表1

4.2涡旋，混匀，观察DNA protect Buffer颜色的变化（由绿变蓝），表明转化过程中充 分的混匀和正确的pH值。

4.3在9700型PCR仪（有热盖）上进行转化，程序如表2所示。

表2

4.4时间约为5h，选择最大的反应体系。

4.5转化结束后，离心，将上述产物转移至1.5mL离心管内；

4.6加入560μL已配置好的Buffer BL，混匀，短暂离心；

4.7将步骤6中的混合液全部转移到EpiTect spin column；

4.814,000rpm，离心1min；弃废液，柱子仍放回收集管上；

4.9加入500μL Buffer BW，14,000rpm，离心1min；弃废液，柱子仍放回收集管上；

4.10加入500μL Buffer BD，盖紧盖子，室温下放置15min；

4.1114,000rpm，离心1min；弃废液，柱子仍放回收集管上；

4.12加入500μL Buffer BW，14,000rpm，离心1min；弃废液，柱子仍放回收集管上；

4.13重复步骤12；

4.14将柱子转移至一个新的收集管上，14,000rpm，离心1min，以去除残余物；

4.15将柱子置于56℃加热模块上，开盖放置15min，挥干；

4.16将柱子放置在一个新的1.5mL离心管上，加入20μL Buffer EB，12,000rpm离心 1min，将DNA冷冻保存。

5PCR反应扩增目标序列：

5.1试剂准备：按比例吸取相应量的序列基因扩增PCR反应液（19.8μL/人份）、Taq酶系 （0.2μL/人份），充分混匀后按20μL/人份分装入PCR反应管，备用。

5.2加样：分别向序列基因PCR反应管加入亚硫酸样本5μL，同时向对应的质控PCR反 应管加入5μL对照品样本作为对照品。

5.3PCR仪扩增实验

编辑反应程序：第一阶段：95℃15min1个循环；第二阶段：94℃30s，56℃30s，72℃30s， 45个循环；第三阶段：72℃10min，一个循环。琼脂糖凝胶电泳检测试验检验扩增效果。

5.3.1PCR体系配置如表3。

表3

注意：焦磷酸转化DNA建议量约为50ng.

5.3.2PCR程序见表4。

表4

注：需要20μL PCR产物在PyroMark ID仪器上进行焦磷酸测序。

6焦磷酸测序：

6.1需要准备的仪器与耗材：真空工作站；用于混匀磁珠的混匀仪；加热模块（80度）； PSQ24Plate Low；24孔板和封膜；24孔加热板

6.2需要准备的试剂：已扩增好的生物素标记的PCR产物；链霉亲和素包被的磁珠；测 序引物；纯水；乙醇（70%）；Binding Buffer；Annealing buffer；Denaturation solution；Washing  Buffer；PyroMark Gold Q24kit；

6.3单链PCR产物纯化：

6.3.1单个样本的最终体积为80μL，包含20uL PCR产物+3μL磁珠+40μL Binding  Buffer+17μL纯水；

6.3.2封膜，14,000rpm离心10min；

6.3.3在真空工作站的4个试剂槽中加入相应的试剂：110mL70%乙醇；90mL  Denaturation solution；110mL Washing Buffer；180mL纯水；

6.3.4打开真空泵，清洗探针后关闭真空开关；

6.3.5在PSQ24Plate Low加入40uL Annealing buffer，1.6μL测序引物（10μM）；

6.3.6将(2)处理后的PCR产物板和PSQ24Plate Low放在相应的位置上，保证方向 一致；

6.3.7打开真空开关，将探针小心的放入PCR产物板约15s，以捕获包含模板在内的磁 珠；

6.3.8观察PCR产物板，保证所有的磁珠均被转移到探针上；若孔内有残留或者仍有白 色的磁珠，探针可能需要被替换；

6.3.9将探针转到液体槽1（含有70%乙醇），让乙醇冲洗探针约5s，将探针转到液体 槽2（含有Denaturation solution），冲洗探针约5s，将探针工具转到液体槽3（含有Washing  Buffer），冲洗探针约10s，提起探针，垂直90度，数秒；

6.3.10将探针垂直放置在PSQ24Plate Low板上方，关掉真空开关；放入板内，摇晃 数秒以释放磁珠；

6.3.11将探针工具转到液体槽4（含有纯水），冲洗10s；

6.3.12关掉真空开关，将探针放回Parking Position；

6.4引物退火步骤：

6.4.1加热PSQ24Plate Low板，80度，2min；

6.4.2加热完成后取出，放置在室温下，备用；

6.5在PyroMark CpG软件中建立assay和run；输入样本信息；点击View-run，查阅 所需要的酶、底物和核苷酸体积资料；

6.6准备焦磷酸测序用Q24卡夹，具体步骤：

6.6.1将粉末状的酶和底物分别加入620μL纯水进行充分溶解；

6.6.2将Q24卡夹贴有标签页的方向对准操作者，按照步骤5中所确定的体积将相应 试剂加入相应的孔，确保没有气泡产生；

6.7测序：

6.7.1将步骤4中准备好的PSQ24Plate Low板和步骤6中准备的Q24卡夹放入 PyroMark Gold Q24测序仪的相应位置；

6.7.2打开PyroMark CpG软件，联机，点击“开始”键进行测序反应；

6.7.3测序反应完成后，打开机器盖子和卡夹盖子，取出Q24卡夹和已测序完毕的PSQ 24Plate Low板，用纯水清洗卡夹，重复4次；

7结果分析：

反应结束后打开Analysis窗口，选择样本孔，点击Results自动分析结果，得到位点的甲 基化水平的数值。

实施例2应用焦磷酸测序试剂盒检测8例临床样本

选取9例经过IHC鉴定为甲状腺癌的组织样本，提取DNA后进行亚硫酸盐转化，将得到 的基因转化产物，通过PCR反应扩增，产物使用琼脂糖凝胶电泳验证进行焦磷酸测序。

检测结果解释：序列基因在特异甲基化位点出现信号值，并且内置参照信号值为100%， 表明对照完全经过了转化，说明亚硫酸盐处理完全；对照品，经过检测可以很好的检测出已 知的数值，说明实验结果没有问题。

9例经过IHC鉴定为甲状腺癌的病例样本可以检测到序列基因特异性位点的甲基化水平 数值，且均为高甲基化。

本次实验中9例样本的检测结果与IHC的检测结果完全吻合，说明利用本试剂盒可以通 过检测甲基化水平来判断甲状腺癌，本试剂盒快速、准确、经济为临床检验带来便利的同时 也能有效地减低病患的经济负担。

本发明在对人序列基因特异位点设计特异性扩增引物，并在下游引物的5’端碱基进行生 物素修饰，随后使用焦磷酸测序引物对序列进行检测（图2的引物设计程序界面）。这些引物 在热启动Taq聚合酶、高纯度的脱氧核苷酸（dNTPs）以及Mg²⁺离子等的PCR反应液中，通过PCR扩增仪实现核酸扩增，然后使用焦磷酸测序仪进行测序，从而快速、准确的检测特异 位点甲基化水平。