柑橘溃疡病感病基因CsLOB

摘要

一种柑橘溃疡病感病基因CsLOB，在柑橘中的序列如SEQ ID NO.1所示，启动子序列长度为500bp，ORF序列长度为711bp；CsLOB蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。CsLOB基因启动子中存在可被柑橘溃疡病菌PthA特异性结合的UPT box，其序列如SEQ ID NO.3所示，长度为18bp。本发明获得的CsLOB基因能被来自柑橘溃疡病菌主效毒性蛋白PthA蛋白特异性识别并激活其转录，导致柑橘发生溃疡病。基因沉默CsLOB基因和遗传修饰UPT box，可获得具有持久抗性的柑橘新种质或新材料。

说明书

技术领域

本发明涉及基因，尤其涉及一种柑橘溃疡病感病基因CsLOB。

背景技术

柑橘溃疡病在中国柑橘种植区普遍发生，以广东、广西、湖南和福建等地发生 较重。发生严重时引起落叶、落果，植株生长不良，影响产量和品质。

柑橘溃疡病菌能够侵染寄主植物柑橘，在侵染点附近引起症状，其机制是柑橘 某些基因不正常地过量表达，从而使得柑橘溃疡病菌成功地从植株获得了所需的营 养物质。在柑橘溃疡病菌与寄主植物的识别过程中，柑橘溃疡病菌通过III型分泌 系统分泌多种III型效应蛋白到植物细胞中，其中PthA被认为是引起柑橘产生柑 橘溃疡病的主要毒性因子。PthA属于TALE(Transcriptional Activator Like Effector) 类蛋白，其结构上在氮端和碳端是保守的，碳端存在核定位信号和转录激活域，在 中间存在重复区域，每个重复由34个氨基酸组成，每个重复的12，13位氨基酸决 定了蛋白与DNA的结合特性。PthA蛋白在被分泌到柑橘细胞中以后，首先会被定 位到细胞核，然后按照其重复区域的识别密码找到相应的柑橘基因组DNA序列进 行结合。其所结合的区域是感病基因的启动子区域。随后，通过PthA蛋白碳端的 转录激活功能，柑橘基因组被结合DNA序列下游的感病基因被激活，经过一系列 的信号传递后，柑橘发生溃疡病症状。

植物中的感病基因是病害发生的关键基因，其在与病原细菌的效应蛋白直接接 触后会过量表达，随后激活植物的整个感病通路，最终导致植物发生病害。在柑橘 溃疡病中，先前的研究并没有找到任何感病基因。柑橘溃疡病感病基因的获得，一 方面，非常充分地解析了柑橘溃疡病发生的致病机理，另一方面，更能让我们通过 日前已经初步成熟的基因组定点编辑技术手段(如TALEN和CRISPR-Cas等)对 感病进行修饰，敲除其上游与PthA毒性因子结合的DNA序列。因此，基于本发 明，利用转基因手段，可以在较短时间内获得对柑橘溃疡病菌具有抗性的柑橘新品 种。

发明内容

本发明的目的，在为根除柑橘溃疡病提供理论基础，为基于转基因的基因定向 敲除技术提供一种柑橘溃疡病感病基因CsLOB作为靶点基因。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明涉及的是甜橙中的CsLOB基因，其启动子能够被柑橘溃疡病菌主效毒 性蛋白PthA识别。该基因被激活后过量表达，可直接导致柑橘发生溃疡病。其在 Citrus sinensis Annotation Project网站(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php)上 的编号为Cs7g27640，其启动子及开放阅读框(ORF)序列如SEQ ID NO.1所示，序 列总长度为1214bp。该序列前500bp部分为启动子，其序列如SEQ ID NO.2所示。 启动子中能被PthA特定识别的序列如SEQ ID NO.3所示，序列长度为18_bp。所 述的CsLOB基因产物CsLOB蛋白能够在柑橘溃疡病菌侵染时过量合成，导致柑 橘发生溃疡病。

本发明的CsLOB基因及其启动子被PthA识别的片段由以下方法获得：

利用转录组分析技术，用含用PthA的柑橘溃疡病菌株注射接种柑橘叶片，一 定时间后取适量柑橘叶片，提取柑橘总RNA分析获取表达上调的基因。总共得到 了108个表达上调基因，在Citrus sinensis Annotation Project网站的柑橘基因组数 据库里获得了这108个基因的启动子序列，然后利用Target Finder和Talgetter两个 在线比对网站进行查询。通过输入PthA的重复区域序列和所有上调基因的启动子 序列，若干个候选基因被获得，其中CsLOB基因得分远高于其他基因，因此其被 推测为是最有可能被PthA激活的基因。将CsLOB基因上游500bp的序列构建到 具有GUS报道基因的载体上，利用农杆菌瞬时表达方法，检测得到CsLOB基因 启动子可以被PthA转录激活。选定CsLOB基因上游的另一端序列作为靶序列， 设计人造TAL蛋白并在柑橘叶片中进行表达，可以使得柑橘产生溃疡病，上述两 实验确认了CsLOB基因是可被PthA转录激活的感病基因。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明获得了柑橘中与柑橘溃疡 病菌互作的感病基因并且得到了与水稻植物中能够被柑橘溃疡病菌PthA蛋白识别 的DNA序列。该感病基因的获得，为运用分子遗传学方法改良柑橘品种提供了资 源，具有极大的应用价值。

本发明中所涉及的柑橘溃疡病感病基因CsLOB系首次报道为可导致柑橘溃疡 病的感病基因，其启动子被PthA蛋白特异性识别的序列也为首次报道。CsLOB (Cs7g27640)基因的序列可在Citrus sinensis Annotation Project网站 (http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php)上查询得到。涉及PthA(GU181333.1) 的序列可以在NCBI数据库中查询(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

利用GUS报告基因验证蛋白对启动子区域的结合及激活功能，是常规的实验 技术手段，该方法已经在(《Antony，G，et al.，Rice xa13Recessive Resistance to  Bacterial Blight Is Defeated by Induction of the Disease Susceptibility Gene Os-11N3. Plant Cell，2010.22(11)：p.3864-3876》)中公开。

附图说明

图1是柑橘CsLOB基因启动子被PthA蛋白结合的DNA序列位置图(红色部 分序列)；

图2是柑橘溃疡病菌PthA蛋白可与CsLOB基因启动子特定序列互作并激活 CsLOB基因表达；

图3是CsLOB基因过量表达导致柑橘发生溃疡病。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold  Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条 件。

实施例1

CsLOB基因启动子的克隆

本实施例克隆柑橘中CsLOB基因上游500bp的DNA片段以及柑橘溃疡病菌 中的PthA基因，通过农杆菌瞬时表达技术，验证与柑橘溃疡病菌PthA蛋白的互 作。以柑橘基因组DNA为模板，设计引物pCsLOB-F(SEQ ID NO.4)：5’- AAAGGTACCATGACGGTGGGAGCCGGGGTG-3’和pCsLOB-R(SEQ ID NO.5)： 5’-TCTAGAGCCTGGTGATACTTCCTTGCCAGAA-3’，进行PCR扩增，PCR扩增 条件为：95℃/5min+(94℃/45sec+55℃/30sec+72℃/1min30sec)×38循环+72℃ /10min。PCR产物经SalI和EcoRI酶切后，连接到pCAMBIA1381载体中，获得 pCAMBIA1381-pCsLOB，借助农杆菌EH105的作用，与表达PthA的PHB载体构 建在烟草上同时进行瞬时表达，转化烟草经过2-3天的温室培养(25℃，光照/黑 暗，16h/12h)后，测定GUS报道基因活性发现PthA可以显著地激活CsLOB基因 启动子的表达，确定CsLOB基因启动子与PthA的互作(参见图2)。

实施例2

CsLOB基因被特异性激活后对柑橘的致病性

本实施例通过人工合成tal基因的方法激活CsLOB基因表达。选定CsLOB启 动子的一段序列(SEQ ID NO.6)作为靶点设计并合成dtal基因(参见图1中蓝色 部分序列)。以柑橘溃疡病菌PthA基因序列为模板，设计引物dTAL-F(SEQ ID  NO.7)：5’-GGCGGTCGACCGGCGCTGGAGAGCAT-3’和dTAL-R(SEQ ID NO.8)： 5’-AATGCATGCAAAGACGCCTGGTCCG-3’进行PCR反应，扩增条件为：95℃ /5min+(94℃/45sec+53℃/45sec+72℃/20sec)×32循环+72℃/10min。回收PCR产 物，经过SalI和SphI限制性酶切后同dtal基因片段一同连接到pUFR034载体上， 得到载体pUFR034-dTAL。使用电转化方法将pUFR034-dTAL载体转入到不含有任 何tal的柑橘溃疡病菌中。注射接种柑橘，与不含dtal基因的柑橘溃疡病菌相比， 含有dtal基因的柑橘溃疡病菌可以导致柑橘叶片明显地发生柑橘溃疡病(参见图 3)。说明该基因可以直接导致柑橘发生柑橘溃疡病，这为防治柑橘溃疡病提供了极 大的应用前景。

参考文献：

关于农杆菌瞬时表达验证蛋白与植物基因启动子互作的方法：Antony，G.，et al.， Rice xa13 Recessive Resistance to Bacterial Blight Is Defeated by Induction of the  Disease Susceptibility Gene Os-11N3.Plant Cell，2010.22(11)：p.3864-3876.

关于人工合成tal基因激活植物基因表达的方法：Li，T.，et al.，Designer TAL  effectors induce disease susceptibility and resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae  in rice.Molecular plant，2013.6(3)：p.781-789.

关于基因重组分子操作：Sambrook J，Russell DW，Molelcular cloning，A Laboratory Manual(3rd ed)，2001，Spring Harbor Laboratory Press。

序列表

<110>上海交通大学

<120>柑橘溃疡病感病基因CsLOB

<160>8

<170>PatentIn version3.5

<210>1

<211>1214

<212>DNA

<213>Citrus sinensis

<221>CDS+Promoter

<222>(1)..(1214)

<400>1

ttatcacata tttgaaagta catccataac cctgatcatc aaaatatata tatatgaaag         60

gtggtttttt tttttttttt ttaccttgaa aaattcatat taacgttatc aatgattttt         120

ttttaatagt tttaccactt atttttttat aacaccttgg taattttgac attaggtagc         180

aatataatac gataaaattc acctccatgt aatttgaagt tcttttcaat aatttttttg         240

acaaatttta tagaagaatt taaccttttt ttttttggtt caaacgaaga aatgtttccg         300

tcattcaatt aaaattaatg acatcatcta gtggctcggt gacatacgct ttagatacaa         360

ttgtcattct tgccttttcc tttctctaat ataccccttt tgccttgaac tttgtttcaa         420

ctaaagcagc tcctcctcat cccttactgt ctttgctttc tcactaacta ctacaaccca         480

acagttttct tctctcaaaa atggaatgca aacacaaaat taatgtagca atcccaatca         540

ctaatatgaa gaacactcaa ttctcatctc catctacttt ctctacttct cctccttctc         600

aatcttctcc acgcttccct tctcctaatc atcaacaatt gtcttctcca gaatcttctc         660

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cagatgcagt gagcagcatg gtctatgaag caagtgccag aatccgggat cctgtttacg         960

gctgcgccgg ggctatttgc catctccaga aacaagtcag tgagcttcag gctcagttag         1020

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tttgcatgga aatggcacaa tctcaagaac aagtcttgca gcagcagcag cagcagcagc         1140

aacagttcat ggatactagc tgttttttgg atgacaatgg tattggatca gcttgggagc         1200

ctctgtggac atga                                                           1214

<210>2

<211>714

<212>DNA

<213>Citrus sinensis

<221>CDS

<222>(1)..(714)

<400>2

atg gaa tgc aaa cac aaa att aat gta gca atc cca atc actaat atg          48

Met Glu Cys Lys His Lys Ile Asn Val Ala Ile Pro Ile Thr Asn Met

  1               5                  10                  15

aag aac act caa ttc tca tct cca tct act ttc tct act tct cct cct         96

Lys Asn Thr Gln Phe Ser Ser Pro Ser Thr Phe Ser Thr Ser Pro Pro

             20                  25                  30

tct caa tct tct cca cgc ttc cct tct cct aat cat caa caa ttg tct         144

Ser Gln Ser Ser Pro Arg Phe Pro Ser Pro Asn His Gln Gln Leu Ser

         35                  40                  45

tct cca gaa tct tct cca agc ttt aaa gct tct cct tca caa tcc tct         192

Ser Pro Glu Ser Ser Pro Ser Phe Lys Ala Ser Pro Ser Gln Ser Ser

    50                   55                  60

cca aat ctt gca gct ccc ctc tct ccg ccg cct ata gtt ctt agc cct         240

Pro Asn Leu Ala Ala Pro Leu Ser Pro Pro Pro Ile Val Leu Ser Pro

65                   70                  75                  80

tgt gct gct tgc aaa atc ctc cgc cgc aga tgc gtc gag aaa tgt gtt         288

Cys Ala Ala Cys Lys Ile Leu Arg Arg Arg Cys Val Glu Lys Cys Val

                 85                  90                  95

tta gct cca tat ttt cca cca acc gaa cca tac aag ttc acc att gct         336

Leu Ala Pro Tyr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Tyr Lys phe Thr Ile Ala

            100                 105                 110

tta gct cca tat ttt cca cca acc gaa cca tac aag ttc acc att gct         384

His Arg Val Phe Gly Ala Ser Asn Ile Ile Lys Phe Leu Gln Glu Leu

        115                 120                 125

cat aga gtc ttc ggt gct agc aat atc atc aag ttc ttg cag gaa ctg         432

Pro Glu Ser Gln Arg Ala Asp Ala val Ser Ser Met Val Tyr Glu Ala

    130                 135                 140

cca gaa tct caa cga gca gat gca gtg agc agc atg gtc tat gaa gca         480

Ser Ala Arg Ile Arg Asp Pro Val Tyr Gly Cys Ala Gly Ala Ile Cys

145                 150                 155                 160

cat ctc cag aaa caa gtc agt gag ctt cag gct cag tta gcc aag gca         528

His Leu Gln Lys Gln val Ser Glu Leu Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala

                165                 170                 175

cag gct gag ctt gtc acc atg gaa agc cag caa cgc aat tta ata act         576

Gln Ala Glu Leu Val Thr Met Glu Ser Gln Gln Arg Asn Leu Ile Thr

            180                 185                 190

cta att tgc atg gaa atg gca caa tct caa gaa caa gtc ttg cag cag         624

Leu Ile Cys Met Glu Met Ala Gln Ser Gln Glu Gln Val Leu Gln Gln

        195                 200                 205

cag cag cag cag cag caa cag ttc atg gat act agc tgt ttt ttg gat         672

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Phe Met Asp Thr Ser Cys Phe Leu Asp

    210             215                 220                 225

gac aat ggt att gga tca gct tgg gag cct ctg tgg aca tga                 714

Asp Asn Gly Ile Gly Ser Ala Trp Glu Pro Leu Trp Thr＊

                230                 235

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Citrus sihensis

<400>3

ATAAACCCCT _TTTGCCTT    18

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>Citrus sinensis

<400>4

AAAGGTACCA TGACGGTGGG AGCCGGGGTG    30

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>Citrus sihensis

<400>5

TCTAGAGCCT GGTGATACTT CCTTGCCAGA A    31

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>Citrus sinensis

<400>6

ATAGAAGAAT TTAACC    16

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>Xanthomonas citri subsp.citri

<400>7

GGCGGTCGAC CGGCGCTGGA GAGCAT    26

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>Xanthomonas citri subsp.citri

<400>8

AATGCATGCA AAGACGCCTG GTCCG    25。