一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法及检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，该方法将全长的猪瘟病毒（CSFV）E

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，本发明还涉及用于该检测的ELISA检测试剂盒。 

背景技术

Langedijk等研究发现，在CSFV的E^rns蛋白上存在一处抗原表位，该表位具有鉴别诊断功能，位于E^rns蛋白C末端191-227氨基酸处，它不仅能够将CSFV、BVDV、BDV区分开来，而且在未来的新型疫苗（以E2为目的蛋白）应用中，能够将疫苗免疫猪和野毒感染猪鉴别开，因此具有很好的应用前景。猪瘟病毒感染猪后能够诱导产生针对E^rns糖蛋白的抗体。E^rns糖蛋白的分子解析能够确定病毒感染后诱导产生的抗体，能够帮助设计有效的诊断抗原和疫苗。Lin等将猪瘟病毒Alfort/187多聚蛋白氨基酸序列297到776之间做缺失分析，Alfort/187多聚蛋白包括E^rns的C端(aa)27-227，整个E1蛋白(aa)1-195和E2蛋白N端(aa)1-87。不同缺失的基因片段连接于原核表达载体pET30，在原核细胞中表达，通过WesternBlot方法检测它们与猪瘟病毒感染猪血清的反应性，显示E^rns基因可以分为三个抗原区域：E^rns(aa)65-145、E^rns(aa)84-160和E^rns(aa)109-220。每一个独立的区域或包含这3个区域的片段，都能跟猪瘟病毒感染猪血清很好的反应。尽管不同的瘟病毒株E^rns基因内存在保守的或变异的区域，猪瘟病毒感染特异的血清学检测和瘟病毒感染的普遍性检测都能通过使用E^rns基因某一片段或多个片段的组合应用。 

当标记疫苗采用E2蛋白作为免疫原时，E^rns蛋白可以作为配套 的鉴别诊断试验的抗原来检测自然感染产生的抗体。最常用的检测CSFV抗体的方法所用抗原多为CSFVE2蛋白或浓缩纯化的细胞培养CSFV抗原，对于大多数比较成功的标记疫苗来说，这些方法大都不能作为配套的鉴别诊断实验。到目前为止，作为诊断抗原的E^rns(E0)蛋白都是由重组鸡痘病毒、昆虫细胞表达的或直接以合成肽的形式或用原核表达系统来表达的^【1-7】，成本较高，且产量方面也受到一定限制。 

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法。 

为实现上述目的，本发明首先提供E^rns蛋白体外表达方法，包括如下步骤：人工合成SEQIDNo.1所示序列的基因并克隆到毕赤酵母表达载体中得到重组表达载体，将重组表达载体转化毕赤酵母，筛选阳性克隆，培养并诱导表达，分离纯化得到E^rns蛋白。在本发明实例中所述毕赤酵母表达载体为pPIC9K，所述基因克隆到α因子信号肽序列下游；所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。 

进而本发明提供一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，包括如下步骤：将上述方法制备的E^rns蛋白作为抗原包被酶标板，将待测样品经稀释后加入酶标板温育，加入酶标二抗温育后显色。 

优选，所述抗原包被浓度为6.25μg/mL，包被条件为37℃，2h，再于4℃过夜。 

优选，待测样品为血清，按1:100稀释后加入酶标板，37℃温育1小时。 

优选，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，稀释10000倍后加入酶标板，37℃反应30min。 

当被检血清样品的OD₄₅₀≥0.38时，判为阳性；OD₄₅₀＜0.33判为阴性，介于两者之间的视为可疑，重检。 

本发明还提供一种猪瘟病毒ELISA检测试剂盒，其包括包被上述方法制备的E^rns蛋白的酶标板和选自以下试剂中的一种或多种：酶标二抗、稀释液、显色液、终止液、阳性标准品、阴性标准品。 

本发明用酵母真核表达系统来表达猪瘟兔化弱毒株E^rns蛋白并建立检测E^rns抗体的间接ELISA方法，为进一步开发诊断试剂盒和研究Erns蛋白的免疫学功能奠定基础。另外,本发明研究发现酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关，本发明将猪瘟病毒（CSFV）E^rns蛋白基因进行了改造，即选择性地对密码子的优化，并在片断5’端加EcoRI酶切位点，3’端加NotI酶切位点，实现E^rns蛋白的有效表达，具有较高的表达效率。 

本发明采用巴斯德毕赤酵母高效表达具有生物学活性的E^rns蛋白，其中，毕赤酵母真核表达系统具有原核表达系统或低级真核表达系统不具备的优势：①毕赤酵母更接近高等真核细胞，不含内毒素和其他有害物质，使用安全；②同酿酒酵母一样，繁殖速度快，对培养条件要求低，培养基价廉，能进行高密度培养，且能耐受较高的液体静压，便于工业化生产；③该系统的载体能与核基因组进行整合，因此构建的菌株较稳定，一般不会在传代过程中出现丢失现象；④在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可在分泌信号作用下将蛋白分泌到胞外；⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因（AOX1）或磷酸甘油酸脱氢酶（GAP）基因启动子作为外源基因启动子，可对外源蛋白的表达进行严格的调控；⑥作为真核表达系统，可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰，即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化，从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性；⑦外源蛋白表达量高，同时自身分泌 的背景蛋白少，表达产物易于纯化；⑧和酿酒酵母相比，毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8-14个甘露糖残基，比酿酒酵母每条侧链平均50-150个甘露糖残基短得多。毕赤酵母极少出现过度糖基化，可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能，而且糖链中不含具有致敏作用的α-1，3-甘露糖，使其作用更加安全。 

本发明使用的载体pPIC9K具有酿酒酵母α-factor分泌信号肽，在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外，以分泌方式表达外源蛋白。外源蛋白可占培养物上清总蛋白的80%左右，更有利于目的蛋白的分离纯化，此表达载体还具有pAOX1诱导型强启动子，受甲醇的严格调控，可以有效的调控外源基因的表达，存在抑制/去抑制和诱导两种调控机制：培养物中抑制物（如葡萄糖或甘油）去除后，并不能使基因大量转录，只有在甲醇诱导下，基因才能大量转录。 

本方法获得的阳性克隆表达量可达54mg/L。利用巴斯德毕氏酵母表达的E^rns蛋白接近天然E^rns蛋白，没有出现过度糖基化，建立的间接ELISA反应表现出对E^rns蛋白产生抗体的专一性和敏感性，这提供了一种更为低价猪瘟诊断试剂盒的方法。由此，可建立一种大规模筛查猪瘟特异性抗体的血清学ELISA诊断试验，也为E2蛋白标记疫苗的推广应用打下基础。 

本发明检测试剂盒具有良好的特异性、敏感性和重复性，能够快速有效地对猪瘟病毒抗体进行检测。本发明在很大程度上促进我国的猪瘟血清抗体的监测的发展，并促进猪瘟分子标记疫苗的使用和推广，推动我国的活猪和新鲜猪肉的出口贸易，具有良好的经济效益和社会效应。 

附图说明

图1是重组载体pGM-T/E^rns酶切鉴定图，其中1-2为阳性克隆的质粒酶切条带；M为DL2000分子量marker。 

图2是重组分泌载体pPIC9K/E^rns构建示意图。 

图3是重组酵母基因组DNAPCR分析图，其中1-6为重组酵母PCR结果；M为DL2000分子量marker。 

图4是重组酵母培养诱导上清SDS-PAGE电泳分析结果，其中1-2为重组酵母诱导上清液；3为空载体转化子诱导上清液；4为GS115菌诱导上清；5为重组酵母诱导沉淀；Marker为SDS-PAGE低分子量标准蛋白质。 

图5是重组酵母Western-Blotting分析结果，其中M为SDS-PAGE低分子量标准蛋白质；1为重组酵母菌诱导沉淀；2，3为阳性重组酵母菌诱导上清。 

图6是E^rns蛋白纯化收集图谱。 

图7是可溶性E^rns蛋白纯化后SDS-PAGE结果，其中M为SDS-PAGE低分子量标准蛋白质；1为阳性诱导菌纯化后上清。 

图8是本发明ELISA方法构建的流程图（图8A、图8B）。 

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。任何不背离本发明精神和实质下的修该或替换，均属于本发明要求保护的范围。 

实施例1 E^rns蛋白的体外表达及活性检测 

1.重组表达载体构建 

1.1将猪瘟病毒（CSFV）E^rns蛋白基因进行了改造，选择性地对密码子进行优化，并在片断5’端加EcoRI酶切位点，3’端加NotI酶切位点。优化过的E^rns全长序列如SEQIDNo.1所示，进一步通过人工合成得到所述序列。 

1.2将人工合成得到的SEQIDNo.1与pGM-T质粒按照5：1的比例建立反应体系连接，然后将连接产物10μL轻轻加入到DH5α感受态细胞中，轻轻转动EP管以混匀内容物，冰上放置30min。42℃水浴热激90sec后快速转移至冰上，放置2～3min后加入800μLLB液体培养基，200rpm振摇45～60min，使菌体复苏并表达抗性基因。然后吸出100μL涂在Amp抗性的LB板上，培养16h～18h至平板上长出菌落。 

使用限制性内切酶EcoRI、NotI双酶切鉴定阳性克隆菌株的质粒，1%琼脂糖凝胶电泳，分别出现片段条带和质粒条带，说明目的基因片段通过连接后整合进入克隆载体。（见图1）。 

1.3将含有E^rns基因全编码序列的pGMT/E^rns进行进行EcoRI和NotI双酶切，回收后插入到相同酶切的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中，并位于α因子信号肽序列下游，获得重组质粒pPIC9K/E^rns，构建过程（见图2） 

表达载体构建完成后，随机挑取转化子提取质粒进行0.8%琼脂糖电泳，以阴性质粒作为对照，根据质粒电泳速度，初步判断出插入目的片段的转化子，阳性质粒迁移速度比阴性对照迁移速度慢，进而通过测序验证阳性质粒目的片段的存在以及序列是否与设计序列一致。 

2.重组酵母构建 

pPIC9K/E^rns线性化转化酵母GS115后涂布MD平板，从MD平 板挑取60个酵母重组转化子点种于含有1-6mg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子，在6mg/mLG418的YPD板上共获得6个阳性高拷贝转化子。根据酵母操作手册，当转化子是甲醇利用快型时，则引物P1、P2可扩增出两条条带，分别为2.2Kb和1174bp，当转化子是甲醇利用慢型时，引物P1、P2只能在1174bp处扩增出1条条带。重组酵母的菌落PCR鉴定如图3示，6个阳性转化子均在1174bp处和2.2Kb处各有1条带，将在1174bp处扩增出条带的酵母进行MM平板筛选，点种在MM平板上的重组酵母全部不能够正常生长，说明获得的重组酵母全部为甲醇利用快型。 

P1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′ 

P2：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′ 

3.E^rns蛋白的诱导表达及分离纯化 

3.1挑取筛选到的重组酵母接种于25mLBMGY培养基中，菌体生长16-18h后，即OD₆₀₀在4时，转入到1L的BMGY中继续28-30℃培养，至OD₆₀₀在4左右，再转入4LBMMY培养基中进行诱导表达，28～30℃、250rpm摇床连续培养，每24h加100%的甲醇至甲醇终浓度为0.5%～1%，每24h收集1mL菌液，直至最佳诱导时间出现为止。培养96h或144h后，12000rpm离心5min，将上清和沉淀分开放于-80℃冰箱，后续试验备用。以电转化时使用pPIC9K阴性质粒获得的重组酵母作为阴性对照。分别处理上清和菌体后进行SDS-PAGE，结果样品上清在约47-48KDa左右处有特异条带，空载体转化子诱导后的上清无此条带，样品沉淀进行蛋白电泳后只有微弱的特异条带（见图4），说明重组蛋白主要以分泌的形式得到表达。 

3.2E^rns蛋白生物活性分析如图5示：对重组酵母表达上清和空载体转化的酵母进行SDS-PAGE和Western-Blotting，结果96h诱导上清在47-48KDa处出现特异性条带，重组菌诱导沉淀只有很微弱的条 带出现，表明重组蛋白主要以分泌的形式进行表达，且用酵母表达系统使表达的目的蛋白具有天然的生物活性，为进一步研究E^rns蛋白的特性奠定了扎实的基础。 

3.3利用CLCProtein Workbench Version5.1蛋白分析软件对E^rns蛋白进行分析，其pI值为7.57，根据其等电点，将诱导表达96h上清经pH计调至所用交换柱要求的pH范围内，0.22μm过滤器过滤待纯化。利用GE公司的purifier100层析仪对可溶性蛋白E^rns进行离子交换层析，首先将A1管道放入缓冲液或平衡液中，将B1管道放入高盐溶液中或洗脱液中进行泵清洗；然后选择流速为1mL/min、输入填料的耐受压力为高耐受，待阴离子交换柱平衡好了（观察电导COND，pH的数值和变化趋势）即准备上样；将E^rns样品约4～5mL吸进注射器，推掉气泡，推入样品环，用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线后收集洗脱液，每管收集体积为1mL/管。观察蛋白峰图，记录下蛋白达到峰值时的样品管编号并储存以备下一步检测和利用。用Microcon超滤管YM-10将纯化后的E^rns蛋白进行进一步浓缩。 

使用Unicon5.20蛋白纯化分析软件对E^rns进行了结果分析（图6），对洗脱峰后的两个蛋白峰分别进行多管超滤浓缩后进行SDS-PAGE和Western-Blotting，结果显示收集管为15～16两管的蛋白为目的蛋白，在280nm蛋白吸收光下，此目的蛋白峰为486.915mAu，除了洗脱过程、蛋白处理过程和蛋白本身降解外，此得率说明蛋白纯化纯度和质量都不错。更有利于下步ELISA的操作。 

收集到的峰蛋白进行SDS-PAGE鉴定，目的蛋白条带上有一条杂带出现（图7），利用蛋白含量分析软件BandScan version5.0对蛋白条带进行了分析，结果显示目的蛋白占85.2%，可见纯化效果比较好。 

4.纯化E^rns蛋白浓度的测定 

纯化后E^rns蛋白，经紫外分光光度计测定样品在A260nm和A280 nm波长的光吸收值。A280=1.038；A260=1.801代入公式蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45×A280－0.74×A260)×稀释倍数，计算蛋白浓度为：17.24mg/mL。 

用上述软件并对其抗原性进行了分析，E^rns是唯一可分泌到猪瘟病毒浸染细胞培养上清的糖蛋白。 

E^rns的抗原表位位于332-412位氨基酸、351-427位氨基酸和376-487位氨基酸三个重叠抗原区中。 

实施例2猪瘟病毒抗体检测ELISA方法的建立 

1.猪瘟病毒抗体检测ELISA方法的建立 

使用方阵滴定的方法确定抗原E^rns的最佳抗原包被浓度和待检猪血清的稀释度，同时确定最佳反应程序。以阳性、阴性血清孔OD值之比即P/N值作为指标，对包被抗原浓度、血清稀释倍数、酶结合物最适工作浓度、各步反应时间等项目进行比较试验，确定各项最适反应条件，将纯化的重组E^rns蛋白用0.025mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释至适当浓度，包被96孔酶标板，每孔加入50μL经1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640倍比稀释的纯化重组抗原，每个稀释度重复两排，置湿盒中，37℃，4h后，再4℃包被过夜，用含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS(pH7.4)的(PBST)洗涤5次，间隔2min，期间振摇；以50g/L脱脂奶粉37℃封闭2h，同上步骤洗板；将猪瘟阳性和阴性血清分别用PBST进行1：25、1：50、1：100、1：200倍比稀释，加入封闭后的酶标板，每孔50μL，用封口膜封闭，37℃感作60min，同上步骤洗板；将辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG以不同比例稀释，每孔加入50μL，37℃感作30min，同上洗板；加入50μL底物液（TMB），避光显色15～30min，最后加入50μL终止液(2mol/LH₂SO4)终止反应，用酶标仪检测OD₄₅₀，计算阳性血清孔的平均OD₄₅₀值(P)和阴性血清孔的平均OD₄₅₀值(N) 之比(P/N)。 

利用方阵滴定法对抗原包被浓度、血清稀释浓度、酶标二抗工作浓度等ELISA参数进行优化。结果抗原稀释在1：40和抗体稀释在1：100时P/N值相对最大，且阴性血清的非特异性反应不明显，所以选择抗原作1：40，血清1：100为最佳稀释度。此时抗原的最佳包被浓度为6.25μg/mL。（当用此抗原包被浓度和血清稀释度时，经过几次试验验证，标准阴性血清的OD₄₅₀值≤0.10，标准阳性血清的OD₄₅₀值≥0.7）。 

根据抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定结果，将纯化抗原和CSFV阳性血清分别作最佳稀释后进行ELISA操作，酶标抗体分别作1:8000，1:10000，1:15000，1:20000四个稀释度进行ELISA试验，测其OD₄₅₀值并计算P/N。通过OD₄₅₀值下降幅度及ELISA判定标准，认为二抗浓度均作10000倍稀释最佳。 

用重组蛋白E^rns以其最佳抗原包被浓度条件下包被ELISA反应板，37℃，2h，再4℃过夜，将血清及其酶标二抗都作最佳稀释倍数，分别在37℃下反应1.5h，1h，40min，30min，进行ELISA测定，测定OD₄₅₀值并求其P/N值，以确定血清和酶标二抗的最佳反应时间，通过试验最终确定一抗结合时间为1h，二抗结合时间为30min。 

对50份阴性血清进行间接ELISA检测，按照已经确定的ELISA程序进行测定，读出OD₄₅₀值，进行样本OD₄₅₀值平均值（X）、标准方差（S.D）的计算。计算出50份血清的OD₄₅₀的平均值和标准方差S.D，确定阳性血清临界值为0.37，阴性血清临界值为0.33，即当被检血清样品的OD₄₅₀≥0.37时，判为阳性；OD₄₅₀＜0.33判为阴性，介于两者之间的视为可疑，需要重检。 

2.猪瘟病毒抗体检测ELISA方法的特异性 

建立的E^rns-ELISA检测猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清、猪伪狂犬病毒（PRV）阳性血清、口蹄疫病毒（FMDV）阳性血清、猪传染性胸膜肺炎阳性血清（TGEV）、副猪嗜血杆菌病阳性血清（HPS）、猪圆环病毒-2型（PCV-2）阳性血清、猪细小病毒（PPV）阳性血清，结果显示被检血清的OD₄₅₀值均低于0.30，均为阴性，表明该ELISA法具有良好的特异性。见表1。 

表1猪瘟抗体间接ELISA交叉特异性检测结果 

3.猪瘟病毒抗体检测ELISA方法的敏感性 

将E^rns重组蛋白按最佳包被浓度进行包被，将猪瘟阳性血清做1:50，1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，6个稀释度，其余条件按最适反应条件进行ELISA试验。结果重组蛋白当阳性血清稀释到1:800时，通过ELISA显色后靠肉眼观察颜色变化难以判断阴性、阳性结果，但酶标仪仍然可以检出，1:1600稀释的阳性血清检测结果为阴性。表明本方法的敏感性高。 

4.猪瘟病毒抗体检测ELISA方法的重复性 

通过批内和批间重复性试验，发现被检血清样品的OD₄₅₀值没有太大的变化，其中批内检测57份猪血清（列出19份），重复4次，变异系数≤4%，批间检测猪血清293份（列出30份），重复3次，变异系数为≤5%，表明本方法具有很好的重复性。见表2和表3。 

表2间接ELISA板内重复检测结果(CV between-run) 

表3间接ELISA板间重复OD450检测结果(CV between-batch) 

5.猪瘟病毒抗体检测ELISA方法与商品化试剂盒比较的符合性 

分别用IDEXX猪瘟抗体ELISA试剂盒（购自北京爱德氏元亨生物技术有限公司）检测和自制的E^rns-ELISA检测293份血清，阻断ELISA检测试剂盒检出阳性血清178份，E^rns-ELISA检测试剂盒检出阳性血清141份，符合率为80.2%。结果见表4。 

表4E^rns重组蛋白建立的间接ELISA与IDEXX CSFV Ab blocking ELISA试剂盒进行比较试验 

实施例3试剂盒的组成 

酶标板：包被E^rns重组蛋白，包被浓度为6.25μg/mL，每孔50μL； 

酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG； 

显色液：3′，3′，5′，5′-四甲基联苯胺（TMB）单相液 

终止液：2MH₂SO₄溶液 

稀释液：含5%脱脂奶的洗涤液 

洗涤液：PBST 

阳性标准品：已知猪瘟阳性血清 

阴性标准品：已知猪瘟阴性血清 

注：阴、阳性标准品购自国家兽医微生物菌种保藏中心。 

参考文献 

【1】陈振海，等；猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立.北京：中国农业大学动物医学院，2005. 

【2】王生育，等；猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其重组蛋白活性测定.福建厦门：厦门波生生物技术有限公司，2006. 

【3】周鹏程，等；猪瘟病毒糖蛋白E0基因的克隆及其表达研究.北京：北京大学生命科学学院细胞及遗传学系，2000. 

【4】高华峰，等；猪瘟病毒E^rns基因的克隆及原核表达.云南昆明：云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，2007. 

【5】Langedi jk JP,MiddelW G，Meloen R H,etal Enzyme-linked immunosorbent assay using a virus type-specific peptide based on a subdomain of envelope protein Erns for serologic diagnosis of pestivirus infections in swine.J.Clin Microbiol2001,39(3):906-912. 

【6】陈振海，等；猪瘟病毒E^rns基因在CHO细胞中的表达.北京：中国兽医药品监察所农业部兽药创新与生物安全评价重点开放实验室，2005，27（6）：483-485. 

【7】王养会，等；表达猪瘟病毒石门株E^rns基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验.陕西杨凌：西北农林科技大学动物医学院，2008，1。