一种伊氏杀线真菌生产工艺及其制剂和生产装置

摘要

本发明公开了一种伊氏杀线真菌生产工艺及其制剂和生产装置，生产工艺采用液固双相培养方法进行伊氏杀线真菌的大量生产，通过液体发酵可以先获得大量的菌丝体、芽生孢子及少量的分生孢子，再转到固体培养基上使其产生大量的气生分生孢子，经本工艺可最终制得伊氏杀线真菌的丸剂或粉剂以便于储存，使用时在0.1M柠檬酸钠溶液中溶解或加水稀释即可；生产装置包括一盘体，盘体的底盘上打有若干孔，至少有一层可将所有孔罩住的金属网固定在底盘上，该装置保证了伊氏杀线真菌固体培养所需要的氧气、湿度，又有效地防止了杂菌污染，大大提高了伊氏杀线真菌的产孢量。

说明书

技术领域

本发明属微生物杀虫剂技术领域，尤其涉及一种伊氏杀线真菌生产 工艺及其制剂和生产装置。

背景技术

松材线虫病又称松树萎蔫病。是松树的一种毁灭性流行病。致病力 强，具有传播途径多、发病部位隐蔽、寄主死亡速度快；传播快，且常 常猝不及防；一旦发生，治理难度大。被称为松树的癌症。据不完全统 计，我国自1982年发生该病后的10年间，发生面积约达38000hm²，造 成松树死亡1400000株以上，损失木材50000m³。用于病害的防治经费 亦达645万元。它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及 生态环境，对我国丰富的松林资源构成严重威胁。

松材线虫通过松褐天牛补充营养的伤口进入木质部，寄生在树脂道 中。在大量繁殖的同时移动，逐渐遍及全株，并导致树脂道薄壁细胞和 上皮细胞的破坏和死亡，造成植株失水，蒸腾作用降低，树脂分泌急剧 减少和停止。所表现出来的外部症状是针叶陆续变为黄褐色乃至红褐 色，萎蔫，最后整株枯死。

现在实行的防治措施有以下几种：

法规防治：严格执行国家有关检疫法规，病区木材和其制成品未经 彻底处理不得流通。

化学防治：分为两类，一类是用化学农药杀灭传播媒介松褐天牛和 病原松材线虫，预防松材线虫病发生或者减轻为害程度；另一类是病害 发生后用化学农药处理伐倒的病木。

生物防治：主要是防治松褐天牛控制松材线虫病的扩散蔓延或减轻 发病危害程度，利用白僵菌防治松褐天牛幼虫，保护和繁殖啄木鸟等捕 食天牛幼虫和成虫鸟类，利用寄生天敌控制天牛数量。

引诱防治：包括饵木引诱、化学制剂处理立木引诱、引诱剂引诱和 灯光引诱，引诱防治法主要依据松褐天牛成虫被自然人工合成的化学物 引诱产卵的特性而设计的，利用松褐天牛成虫有微弱趋光性而采用的。

此外，还有林地病死树清理和发病林区皆伐、诱导抗性、综合治理 等等。

以上种种措施虽然是面面俱到，但都是围绕着防治松材线虫病传播 媒介松褐天牛展开的研究，而由于松材线虫生存在树体的木质部，具有 较强的隐蔽性，一般药物或者致病微生物很难与其接触，因此直接针对 松材线虫的防治研究却很少。

当前人类对环保、无公害、绿色食品的大量需求使生物农药的使用 量呈现不断上升的趋势。尤其是加入ＷＴＯ以后,如何保护生态环境免 受化学污染,降低林副产品农药残留量,提高产品品质和在国际市场上 的竞争力已显得非常重要。生物农药与化学农药相比有很多优越性，对 环境无污染、对其它生物比较安全，在害虫的可持续控制及生物多样性 保护方面发挥着重要的作用。

基于这种情况，尽快研制出直接针对松材线虫的微生物产品，显得 尤为重要，势在必行。

伊氏杀线真菌是世界上第一个被报道的松材线虫内寄生真菌。其主 要特征是能产生两种形态的分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子。第一种 分生孢子梗淡烟褐色至灰绿色，瓶形，顶端逐渐变细形成颈，有时呈弯 曲状；产孢细胞完整呈瓶梗状，极少有极顶的；分生孢子无色，单胞， 新月形，有凹面，内含明显的内孢子构造状结构，有粘性。第二种分生 孢子梗淡烟褐色至灰绿色，圆柱形或锥形，有隔，底部有点肿大；产孢 细胞完整，瓶梗状；分生孢子无色，单胞，杆状，常在顶端形成水滴状， 无粘性。仅第一种分生孢子能粘附到松材线虫体表进行侵染活动。

伊氏杀线真菌侵染松材线虫的机理，游走的线虫碰到粘性孢子凹面 时，孢子即粘附于线虫体表，并自产孢梗自动脱落随线虫移动。孢子能 随机的粘附到线虫体表的任意位置，但分布情形则以头部最多，尾端次 之，身体中段最少。松材线虫被粘性孢子附着18-24h后，会自内孢子状 构造处开始分化产生侵入钉，穿透线虫体壁，进入线虫体内后侵入钉继 续膨大形成球形、次球形的囊状体，脱落释放至虫体体腔，成长为纺锤 形的节状营养菌丝，于线虫体内生长、分枝、蔓延，最终菌丝充满体腔， 线虫死亡，菌丝从线虫死体内长出并向四周蔓延，形成分生孢子梗，并 在上面产生分生孢子，准备进行下一次侵染。通常接种8-10d后，100% 的线虫均被杀死。从线虫死体内长出的菌丝无一例外的都产生分散的瓶 状产孢细胞和新月形粘性孢子,在实验中未发现线虫被杆状孢子侵染的 情形。

固体培养基培养所得真菌中新月形孢子从孢子中间凹面处萌发长出 泡状物，接着形成一个或更多个芽管，之后芽管分枝形成营养菌丝。有 时，也会从孢子凸面中间处萌发。几乎90%的杆状或圆柱形孢子从孢子 的1/2或1/3地方产生芽管，仅有10%的孢子在末端发芽。伊氏杀线真 菌产生二型孢子与一些钩丝孢属真菌产生附着胞相似。现采用PDB （Potato Dextrose Agar）液体培养该菌时，主要产生形态不一的芽生 孢子，大部分为长椭圆形、圆形或卵形等，可经出芽方式再产生芽孢， 或发芽后形成细长的柄，并于其上产生粘性孢子；也有一个芽孢双边发 芽，分别产生两种产孢细胞，于其上着生不同分生孢子；或出芽产生其 他芽孢后，再分化产生瓶梗状产孢细胞，并产生粘性孢子，其出芽方式 十分富于变化。将液体培养得到的芽生孢子接种于WA（Wagstsuma Agar） 培养基上，芽孢会继续出芽，聚集形成芽孢堆；或于芽孢上直接产生粘 性孢子；有些则发芽延伸成为菌丝，并于其上着生瓶梗，再产生粘性孢 子。

采用上述培养基方式实现的产孢量大约是19000000个/ml，如何更 高效的生产仍是业内人士的追求。

另外，真菌固体培养特性对真菌生长和产孢的数量和质量影响很 大，不同真菌的生长及产孢对营养条件要求是有差异的，而伊氏杀线真 菌对于固体条件的要求尤为严格。在伊氏杀线真菌固体发酵过程中，温 度对其影响是很大的，温度适当升高对伊氏杀线真菌的固体发酵是有利 的，能使产孢量增加，但固体发酵的放热过程，很容易造成固体培养基 内热超过31度，就容易把菌落烧死，不利于产孢。伊氏杀线真菌是喜氧 的，因此适量增加通气量有助于提高孢子生长速度，但在固体发酵时又 不能使通风量过大，因为这样生长速度快，内热就会加大，温度不宜控 制，造成孢子减产。湿度对伊氏杀线真菌固体发酵的影响也很大，固体 发酵初期湿度越大产孢量就越大，但到了后期，培养基上的孢子已基本 成熟，湿度就应适当降低，因为湿度太大，孢子继续发芽，孢子产量必 然降低。由于伊氏杀线真菌的特异性，使得传统固体发酵的容器显示出 诸多弊端，极易造成固体发酵的失败和污染杂菌，而迅速发生的杂菌污 染甚至有可能造成含孢量很高的产品成为废品，因此对于伊氏杀线真菌 固体培养的容器也必须加以改进。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种生产效率高的伊氏杀线真菌的生产工 艺。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：

一种伊氏杀线真菌的生产工艺，包括有预先得到的伊氏杀线真菌菌 落，其方法步骤如下：

a）预处理：将操作间、超净工作台和发酵箱打扫干净并灭菌处理；

b）制备伊氏杀线真菌菌种:

按如下组份及重量百分比配料：马铃薯10-30%，葡萄糖1-3%，麦麸 0.25-1%，水66-88.75%，将配好的料放入培养容器内，常规高温高压灭 菌至少20分钟，冷却后接入伊氏杀线真菌菌落，置摇床上培养72-84 小时，其中，设定环境温度为25-28度，摇床转速为150-180转/分钟；

c）按如下组份及重量百分比制备液体培养基：蛋白胨1-3%，葡萄 糖1.5-3.5%，酵母粉0.3-1.5%，消泡剂0.03-0.15%，水91.85-97.17%； 将全部的液体培养基加入到发酵罐中采用常规高温高压定时灭菌，将前 期步骤a培养的伊氏杀线真菌菌种经接种口完全接入发酵罐内，然后盖 严发酵罐接种口的盖子；共培养72-96小时；

d）按如下组份及重量百分比制备固体培养基：麦麸15-30%，松木 屑10-30%，水40-75%；将制备得的的固体培养基按定量分成若干份，一 份定量的固体培养基装入一个纱布袋中，将袋口封好，使固体培养基在 袋中呈松散状，再用纸将纱布袋包好，放在底部带孔的不锈钢盘中，再 将一个同样的不锈钢盘反扣在装有固体培养基纱布袋的盘子上，放入灭 菌锅，在121.3℃的温度及1.05kg/cm2的压力下，维持至少60分钟；

将固体发酵盘及固体培养基接种用具均灭菌处理；灭好菌的固体培 养基和所有器具直接放入超净工作台，冷却至30度以下，期间紫外灯、 鼓风开启；

e）将步骤c制备的液体培养基培养的菌液分步从发酵罐中移出至若 干个分装容器内，各分装容器内盛有一份设定定量的菌液，分装过程中 保持洁净，每完成一份分装即刻封口；

f）取步骤d制备的1袋固体培养基倒入搅拌锅中，用搅拌器打散， 加入步骤e中的1个分装容器内的全部菌液，搅拌均匀，分别分装到若 干固体发酵盘中，各固体发酵盘采用保鲜膜铺底，每盘装有900～1100 克的前述固体带菌培养基初混物，用保鲜膜将发酵盘口封好，放入温度 为23-26度的发酵箱，每箱中放置10～20个发酵盘，培养7-10天；

g）将培养完毕的固体带菌培养基整理成松散状，分别装入若干尼龙 纱袋中，放入洗涤器中，加入10倍水，洗涤、过滤，滤液进入收集池后， 启动离心机离心处理；最终取出沉淀，收于低温冰箱中，得到伊氏杀线 真菌制剂半成品。

所述伊氏杀线真菌的生产工艺的步骤f中，1袋固体培养基的重量 与1个分装容器内全部菌液的体积量比例关系为：1kg/（150～180）ml。

所述伊氏杀线真菌的生产工艺的步骤c中，全部的液体培养基加入 到发酵罐中采用常规高温高压灭菌至少60分钟，之后，当发酵罐内液体 培养基冷却至30度以下时，以乙醇火焰不间断地消毒发酵罐的接种口， 直至将前期步骤b培养的伊氏杀线真菌菌种完全接入发酵罐内；盖严发 酵罐接种口的盖子后，撤掉火焰。

所述伊氏杀线真菌生产工艺的步骤c中，盖严后的发酵罐罐内的压 力保持为0.3-0.35Mpa,通气量为150-200m³/h。

所述伊氏杀线真菌的生产工艺的步骤d中，固体培养基中的麦麸和 松木屑先过10目分析筛，再加水搅拌均匀，之后装入30-35目的纱布袋 中。

本发明生产工艺采用液固双相培养方法进行伊氏杀线真菌的大量生 产，通过液体发酵可以先获得大量的菌丝体、芽生孢子及少量的分生孢 子，再转到固体培养基上使其产生大量的气生分生孢子。

本发明的另一目的是提供一种可实现高效率生产伊氏杀线真菌的制 剂。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：

一种伊氏杀线真菌制剂，为丸剂或粉剂。

所述的粉剂获得：首先由前述的伊氏杀线真菌生产工艺得到伊氏杀 线真菌制剂半成品，按照该伊氏杀线真菌制剂半成品的重量百分比，加 入吐温-800.1%，聚乙二醇100005%，海藻糖0.5%，葡萄糖1%，山 梨醇5%，甘油1%，再加入与沉淀物等量的可溶性淀粉，搅拌均匀；进而 进一步加工得到。

所述的丸剂获得：首先由前述的伊氏杀线真菌生产工艺步骤f中得 到固体带菌培养基，加10倍水，100目尼龙纱过滤，过滤后的滤液加等 体积的3-5%海藻酸钠溶液；再加入滤液体积的5-10%的粘土；继而再加 入青霉素0.05mg/ml，链霉素0.025mg/ml，搅拌均匀制得预制液，最 后加工制成球状颗粒的丸剂。其中，青霉素及链霉素的加入量是以前述 过滤后的滤液体积为基础（即1ml的滤液对应加入青霉素0.05毫克、链 霉素0.025mg）。

所述伊氏杀线真菌制剂中，所述最后制成球状颗粒的具体方法是： 将前面制得的预制液装入橡胶塞玻璃瓶内，把橡胶塞盖好，将带有橡胶 管的塑料尖嘴通过橡胶塞插入瓶中，橡胶管另一端的下方放置盛有0.2M 氯化钙溶液的烧杯，橡胶管上安一控制阀，使瓶中液体不断滴入烧杯中， 形成小球状颗粒，收集小球颗粒，灭菌水清洗3遍，保存于低温冰箱。

本发明的又一目的是提供一种使用效果极佳的伊氏杀线真菌生产装 置（固体发酵盘）。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：

一种所述伊氏杀线真菌生产工艺用生产装置，包括一盘体，所述盘 体的底盘上打有若干孔，至少有一层可将所有孔罩住的金属网固定在底 盘上。

所述生产装置还具有如下特征中的至少一种：

1）用铜钉将金属网固定在底盘上；

2）所述的金属网为铝制网，且铝制网网眼密度为30目；

3）所述盘底部的打孔为圆孔，孔径为0.6～1.0cm；

4）所述的盘体外形呈长方体形；或，盘体横截面呈长方形，纵截面 呈梯形，上口横截面大于下口的横截面；

5）还配设有至少一层可铺在盘底上以覆盖住金属网的保鲜膜和至少 一层可包封住盘口的保鲜膜。

本发明伊氏杀线真菌固体发酵盘可进行高温高压灭菌处理，不锈钢 盘、铝制网、保鲜膜的完美组合，既保证了伊氏杀线真菌固体培养所需 要的氧气、湿度，又有效地防止了杂菌污染，大大提高了伊氏杀线真菌 的产孢量，操作简单，价格低廉，是伊氏杀线真菌生产中重要且理想的 用具。

本发明的优点是：

1.采用本发明生产工艺生产伊氏杀线真菌，产出的孢子绝大部分为 新月形粘性孢子，萌发率高，产孢量大，孢子抗逆性强，操作简便，成 本低廉；

2.本发明生产工艺中创新开发的液体培养基和固体培养基使用效 果极佳，配合本发明的生产工艺实现的产孢量大约是104000000个/ml， 比现有技术PDB培养基方式实现的产孢量（19000000个/ml）可提高数倍， 效果可观，经济效益显著；

3.本发明生产工艺用的伊氏杀线真菌固体发酵盘所采用主材均为 金属材质，耐受高温高压，不会发生变形、锈蚀，利于发酵器皿的彻底 灭菌，杜绝污染；且均为低值耐耗品，可反复使用，最大限度地降低了 生产成本。另外，采用保鲜膜铺底和覆盖，具有良好的透氧性和透湿度， 可以调节被保鲜品周围的氧气和水分的含量，阻隔灰尘，从而使被保鲜 品免受细菌感染。

附图说明

图1为本发明伊氏杀线真菌固体发酵盘一实施例结构示意图。

图2为图1所示实施例的盘体结构示意图。

图3为图1所示实施例覆上金属网后（未使用铜钉）的主盘体结构 示意图。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明。

具体实施方式

首先，为实现本发明伊氏杀线真菌的生产工艺，本发明人创新设计 了伊氏杀线真菌固体发酵盘。

如图1所示，本发明伊氏杀线真菌固体发酵盘主要由盘体1、金属网2、 铜钉3、封底用保鲜膜和封口用保鲜膜（图中未示出）几部分组成。

所述的盘体1材质为不锈钢制，外形状呈长方体形，盘底部打有若干 孔4，以圆孔为佳，孔径为0.6～1.0cm，其他形状的孔亦不限。图1示出 了伊氏杀线真菌固体发酵盘一较佳实施例结构：盘体1外形呈长方形，尺 寸：长×宽×高为60×40×5cm；底盘上共均匀打圆孔260个，孔径为 0.8cm。

所述的金属网2采用30目的铝制网为佳，用铜钉3将其固定在底盘1 上以罩住所有的打孔4。在图1所示实施例中，铝制网的网面尺寸：长× 宽为30×50cm。铝制网的使用，可以起到支撑作用，避免保鲜膜直接贴 到盘底，影响其透气性。

同时还配设有至少一层可铺在盘底上以覆盖住铝制网的保鲜膜和至 少一层可包封住盘口的保鲜膜（图中未示出），为满足伊氏杀线真菌固 体发酵的需要，保鲜膜的厚度应大于0.6丝，选用厚0.8丝的保鲜膜为佳。 保鲜膜具有良好的透氧性和透湿度，可以调节被保鲜品周围的氧气和水 分的含量，阻隔灰尘，从而使被保鲜品免受细菌感染。其次，保鲜膜容 易与不锈钢面器具粘合并且容易被拉出及剪断。

本发明伊氏杀线真菌的生产工艺具体实施方法是：

a）预处理：操作间、超净工作台、发酵箱灭菌：操作间、超净台、 发酵箱打扫干净，超净台和发酵箱用75%乙醇擦拭，然后三者分别紫外 照射2小时左右。

灭好菌的所有器具直接放入超净工作台冷却至30度以下，期间紫外 灯、鼓风开启。

操作人员穿戴好灭过菌的工作服、帽、口罩，要将所有头发都放入 帽内，手用75%的乙醇进行彻底消毒。

b）伊氏杀线真菌菌种制备：按如下组份及重量百分比配料：马铃薯 10-30%，葡萄糖1-3%，麦麸0.25-1%，水66-88.75%，放入培养容器内 （小量化时，可采用实验室用三角瓶），常规高温高压（1.05kg/cm²蒸 汽压下，温度达到121.3℃）灭菌至少20分钟，较优方案是维持20～30 分钟，冷却后接入从平板上刮下的菌落，置摇床上，环境温度保持为 25-28度，摇床转速为150-180转/分钟（rpm），培养时间为72-84小 时。

c）按如下组份及重量百分比制备液体培养基：蛋白胨1-3%，葡萄 糖1.5-3.5%，酵母粉0.3-1.5%，消泡剂0.03-0.15%，水91.85-97.17%。 陆续将各料加入发酵罐中，常规高温高压灭菌至少要60分钟，当罐内培 养基冷却至30度以下时，以乙醇火焰不间断地消毒接种口，直至将前期 培养的菌种完全接入罐内，然后盖严接种口的盖子，撤掉火焰。罐内压 力应保持在0.3-0.35Mpa,通气量150-200m³/h，培养72-96小时。

d）按如下组份及重量百分比制备固体培养基：麦麸15-30%，松木 屑10-30%，水40-75%。首先将原料麦麸和松木屑分别过10目分析筛， 按比例分别备出麦麸和松木屑，并混装在容器中，加入水搅拌均匀，装 入提前备好的30-35目的纱布袋中（纱布袋可以为35×55cm，每袋装入 固体培养基3kg），装入固体培养基后，将袋口封好，使固体培养基在 袋中呈松散状，用纸将纱布袋包好，放在底部带孔的不锈钢盘中，再将 一个同样的盘子反扣在装有固体培养基纱布袋的盘子上，放入灭菌锅， 在1.05kg/cm²的压力下，温度121.3℃,维持至少60分钟。

将固体发酵盘及固体培养基接种用具均灭菌处理；灭好菌的固体培 养基和所有器具直接放入超净工作台冷却至30度以下，期间紫外灯、鼓 风开启；操作人员每接完一锅培养基，手都要再次消毒。

e）将步骤c制备的液体培养基培养的菌液分步从发酵罐中移出至若 干个分装容器（分装容器应采用玻璃制品或方便杀毒灭菌的金属制品， 小量时可直接用三角瓶）内，各分装容器内盛有一份设定定量的菌液， 分装过程中保持洁净，发酵罐出液口用乙醇消毒火焰消毒并维持火焰在 出液口外，将灭过菌的分装容器打开锡纸接在出液口下，打开出液开关， 让菌液流入分装容器（三角瓶）中，当菌液离达到设定定量（如：500ml） 刻度时，关闭出液开关，分装容器（三角瓶）上口盖好锡纸，换下一个 （瓶）。整个过程不得离开乙醇火焰。

f）取步骤d制备的1袋固体培养基倒入搅拌锅中，用搅拌器打散， 加入步骤e中的1个分装容器内的全部菌液，搅拌均匀，分别分装到若 干固体发酵盘中，每盘为900～1100克左右，先在铝制网上喷少许水， 再用厚0.8丝的保鲜膜覆盖住铝制网，经高温高压灭菌后，将接有1000 克左右的伊氏杀线真菌的固体培养基铺在盘内（将接有伊氏杀线真菌的 固体培养基1000克左右铺在盘内），盘口再用保鲜膜封好，放入温度为 23-26度的发酵箱，每箱中放置10～20个发酵盘，培养7-10天；其中， 3kg固体培养基的量对应约500ml的菌液为佳。

g）将培养完毕的固体带菌培养基整理成松散状，分别装入若干尼龙 纱袋中（100目即可，3公斤/袋），放入洗涤器中，加入10倍水，慢速 洗涤过滤，滤液进入收集池，收集池下端有一出液管连接管式离心机， 当滤液达到收集池五分之四的位置时，离心机启动，离心1小时，停机， 取出沉淀，收于低温冰箱中。

所述步骤c中，制备液体培养基用的蛋白胨和消泡剂均可由市场购 得。所述的消泡剂优选采用植物油消泡，其对真菌生长无影响，耐高温 高压，成本低。

在伊氏杀线真菌的生产中，如果菌液加的多了，培养基太湿影响真菌 的生长，菌液加的少了影响孢子的产量；故所述步骤f中，1袋固体培 养基的重量与1个分装容器内的全部菌液体积量的比例掌握在1kg/ （150～180）ml。利于孢子的萌发和增大产孢量。

下面以几个具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1：

a）准备工作，对操作间、超净工作台、发酵箱清洁及灭菌，超净台 和发酵箱用75%乙醇擦拭，然后三者分别紫外照射2小时；灭好菌的所 有器具直接放入超净工作台冷却至30度以下，期间紫外灯、鼓风开启。

进入操作间的操作人员自身进行彻底消毒。

b）伊氏杀线真菌菌种制备：按如下组份及重量百分比配料：马铃薯 10%，葡萄糖2%，麦麸0.5%，余量水；将全部料放入三角瓶，常规高温 高压灭菌30分钟，冷却后接入从平板上刮下的菌落，置摇床上，环境温 度保持为26度，摇床转速为180rpm，培养时间为72小时。

c）液体培养基：酵母蛋白胨1.5%，葡萄糖1.5%，酵母粉1.2%，消 泡剂0.1%，余量水；加入发酵罐中常规高温高压灭菌60分钟，当罐内 培养基冷却至30度以下时，以乙醇火焰不间断地消毒接种口，直至将前 期培养的菌种完全接入罐内，然后盖严接种口的盖子，撤掉火焰。罐内 压力0.3Mpa,通气量180m³/h，培养86小时。

d）固体培养基：麦麸20%，松木屑10%，水70%。麦麸和松木屑过 10目分析筛，加水搅拌均匀，装入一个30目的纱布袋中，纱布袋为35 ×55cm，装入固体培养基3kg，将袋口封好，使固体培养基在袋中呈松 散状，用纸将纱布袋包好，放在底部带孔的不锈钢盘中，再将一个同样 的盘子反扣在装有固体培养基纱布袋的盘子上，放入灭菌锅，在 1.05kg/cm²的压力下，温度121.3℃,维持60分钟。

固体发酵盘灭菌：先在固体发酵盘底部的铝网上喷少许水，再用保 鲜膜覆盖住铝网，在保鲜膜上铺上36×55cm的纸，加上垫片，放上另一 个盘子，操作同上，5-6个盘子为1摞，最上面的一个盘子用72×55cm 纸将盘口完全盖住，整摞盘子用保鲜膜完全包裹好，放入高压锅内灭菌， 压力1.05kg/cm²，温度121度，60分钟。

固体培养基接种用具灭菌：接菌种用500ml三角瓶若干，瓶口用锡 纸封好。搅拌锅材料为不锈钢，直径30cm,高40cm，用纸将锅口处封好。 搅拌器，木质，长50cm，宽6cm，用纸全部包好。操作人员穿戴的工作 服、帽、口罩用纸包好，置灭菌锅内，1.05kg/cm²的压力下，温度121.3 ℃,维持60分钟。

操作人员穿戴好灭过菌的工作服、帽、口罩，要将所有头发都放入 帽内，手用75%的乙醇进行彻底消毒。每接完一锅培养基，手都要再次 消毒。

e）将发酵罐中菌液移至三角瓶：发酵罐出液口用乙醇消毒火焰消毒 并维持火焰在出液口外，将灭过菌的三角瓶打开锡纸接在出液口下，打 开出液开关，让菌液流入三角瓶中，当菌液达到500ml刻度时，关闭出 液开关，三角瓶盖好锡纸，整个过程不得离开乙醇火焰。

f）固体接菌：将步骤d中的1袋固体培养基倒入搅拌锅中，用搅拌 器打散，加入步骤e中的一瓶菌液（500ml），搅拌均匀，分装到不锈 钢盘中，每盘1000克，用保鲜膜将发酵盘口封好，放入26度发酵箱， 培养8天。

g）将培养完毕的固体带菌培养基整理成松散状，装入一个100目尼 龙纱袋中，放入洗涤器中，加入10倍水，慢速洗涤过滤，滤液进入收集 池，收集池下端有一出液管连接管式离心机，当滤液达到收集池五分之 四的位置时，离心机启动，离心1小时，停机，取出沉淀物即为最终得 到的伊氏杀线真菌制剂半成品，收于低温冰箱中。

经上述方法可以得到伊氏杀线真菌制剂半成品。

实施例2：方法步骤a至步骤f同于实施例1，继而：

h）备3-5%海藻酸钠溶液，粘土，0.1M柠檬酸钠溶液，0.2M氯化钙 溶液，橡胶塞玻璃瓶，进行常规灭菌；

i）将培养完毕的固体带菌培养基，加10倍水，用100目尼龙纱过 滤，过滤后得到的滤液再加等体积的3-5%海藻酸钠溶液，加入10%的粘 土，再按0.05毫克/ml的比例加入青霉素，按0.025mg/ml的比例加入 链霉素，搅拌均匀，装入橡胶塞玻璃瓶内，把橡胶塞盖好，将带有橡胶 管的塑料尖嘴通过橡胶塞插入瓶中，橡胶管另一端的下方放置盛有0.2M 氯化钙溶液的烧杯，橡胶管上安一控制阀，使瓶中液体不断滴入烧杯中， 形成小球状颗粒，收集小球颗粒，灭菌水清洗3遍，保存于低温冰箱。

经上述方法可以得到伊氏杀线真菌的丸剂，使用时在0.1M柠檬酸钠 溶液中溶解2-3小时即可。

实施例3：

方法步骤a至步骤g类同于实施例1，不同点在于：

步骤c中，按如下组份及重量百分比制备液体培养基：蛋白胨3%， 葡萄糖1.5%，酵母粉1.5%，消泡剂0.15%，水91.85-97.17%。

步骤d中，按如下组份及重量百分比制备固体培养基：麦麸15%， 松木屑30%，水65%。

经上述方法可以亦得到的是伊氏杀线真菌制剂半成品。

实施例4：方法步骤a至步骤g类同于实施例3，继而：

h）按照伊氏杀线真菌制剂半成品的重量百分量，加入吐温-800.1%， 聚乙二醇100005%，海藻糖0.5%，葡萄糖1%，山梨醇5%，甘油1%，再 加入与沉淀等量的可溶性淀粉，搅拌均匀，继而加工成粉剂。

经上述方法可以得到伊氏杀线真菌的粉剂，使用时加水稀释125倍。

以上仅仅举出了典型化的四个实施例。具体实施的方案可在不脱离本发 明的范围下加以若干变化，故以上的说明所包含及附图中所示的结构应视为 例示性，而非用以限制本申请专利的保护范围。