一种彩色棉胚珠离体培养的方法

摘要

本发明公开了一种彩色棉胚珠离体培养的方法，其步骤如下：采集绿色棉或棕色棉的当天的0-2天幼铃，将花冠拉去，剥去花萼，保留花柄；将所取幼铃用蒸馏水洗涤2次，于无菌条件下用75％酒精消毒5-15min后用0.1%氯化汞浸泡5-15min，再用无菌水冲洗5-8次，剥取胚珠；将所取胚珠于无菌条件下接种于含有激素ZR、GA

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种彩色棉胚珠离体培养的方法。

背景技术

天然彩色棉是棉纤维中含有天然色素的特殊类型的棉花。棉纤维是外珠被的 表皮细胞中生毛细胞经突起、伸长以及次生壁加厚等过程形成的厚壁管状单细胞 毛；以大田植株条件下的棉纤维为研究对象，其结果往往因不明因素的影响而难 以解释。Kim和Triplett曾指出，棉纤维的离体培养让人们能够进行温室和大 田中不能进行的生理和生化试验。通过棉花胚珠离体培养，可以研究营养、低温、 光照、植物生长调节剂以及其他化学物质对棉纤维细胞起始和伸长效应的影响。 虽然白色棉胚珠离体培养体系较成熟，但由于棉花胚珠离体培养体系存在很明显 的品种差异，彩色棉胚珠离体培养体系还鲜见报道。从而本发明为彩棉的育种研 究提供了稳定良好的研究样本。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种彩色棉胚珠离体培养的方 法，该方法可以降低污染率，提高存活率，促进棉纤维生长和色素合成。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种彩色棉胚珠离体培养的方法，包括以下步骤：

（1）取材：采集绿色棉或棕色棉的当天的0-2天幼铃，将花冠拉去，剥去 花萼，保留花柄；

（2）消毒处理：将所取幼铃用蒸馏水洗涤2次，于无菌条件下用75％酒精 消毒5-15min后用0.1%氯化汞浸泡5-15min，再用无菌水冲洗5-8次，剥取 胚珠；

（3）接种和培养：将所取胚珠于无菌条件下接种于含有激素ZR、GA3和IAA 的BT培养基中，每瓶接种同一个子房的胚珠15-25粒，于(31±1)℃进行暗培养 30-40天。

所述绿色棉胚珠接种的BT培养基的激素配比为GA₃0.5-3.0μmol/L+IAA 1.0-10.0μmol/L+ZR0.5-3.0μmol/L,优选为GA₃1.0μmol/L+IAA5.0μ mol/L+ZR2.5μmol/L。

所述棕色棉胚珠接种的BT培养基的激素配比为GA₃0.5-3.0μmol/L+IAA 1.0-10.0μmol/L+ZR0.5-3.0μmol/L,优选为GA₃1.0μmol/L+IAA1.0μ mol/L+ZR1.0μmol/L。

本发明与已有技术相比，其有益效果体现在：

1、本发明取材时保留花柄，保证了短时间内叶柄对幼铃的营养供给，使得 幼胚的活力得以保存、离体培养时胚珠的存活率大大提高。

2、本发明提供一种彩色棉胚珠离体培养的方法，该方法可以降低污染率、 死亡率和褐化率，提高成活率，促进棉纤维生长和色素合成。在实验室能够实现 稳定良好的批量培养。

3、本发明提供一种彩色棉胚珠离体培养的方法，避免了在大田条件下不明 因素对纤维生长发育和色素合成的影响。便于后续能够进行温室和大田中不能进 行的生理和生化试验，从而本发明为彩棉的育种研究提供了稳定良好的研究样 本。

4、本发明BT培养基其激素配比中对胚珠鲜重和纤维伸长影响大小的顺序为 ZR＞IAA＞GA₃，其中，ZR对胚珠鲜重的影响达极显著水平，对纤维伸长的影响达 显著水平；而IAA和GA₃对两者的影响不显著。ZR对彩色棉胚珠离体培养极其重要。

5、棕色棉胚珠在激素配比为GA₃1.0μmol/L+IAA1.0μmol/L+ZR1.0μmol /L的BT培养基中其30DAC（离体培养30天）棉纤维长度经多重比较分析均显著 高于其他激素配比。绿色棉胚珠在激素配比为GA₃1.0μmol/L+IAA5.0μmol/ L+ZR2.5μmol/L的BT培养基中，其30DAC的棉纤维长度经多重比较分析均显著 高于其他激素配比。

附图说明

图1为实施例1不同培养方式棕色棉胚珠的生长情况，其中，a、40天暗培 养，b、40天光培养。

图2为实施例2不同培养方式绿色棉胚珠的生长情况，其中，a、40天暗培 养，b、40天光培养。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明:

实施例1：

一、棕色棉胚珠的离体培养

棕色棉(棕彩选1号)大田种植，常规管理。于早上9点左右对当日花挂牌。 将当天采集的花后1天的幼铃花冠拉去，并剥去花萼，仅留适当长度的花柄。并 将这些幼铃用蒸馏水洗涤2次放入超净工作台，用75％酒精消毒10min后再用 0.1%氯化汞浸泡5min，消毒后用无菌水冲洗6次，剥取胚珠。将胚珠接种于BT 培养基上，其激素配比为GA₃1.0μmol/L+IAA1.0μmol/L+ZR1.0μmol/L。每 瓶接种同一个子房的胚珠约20粒，置于(31±1)℃条件下进行暗培养并观察生长 情况。

二、棕色棉胚珠离体培养的不同取材和消毒处理方法的比较研究

实验总计9个处理，每处理均接20瓶左右，结果表明，取花后1天的幼铃 用75％酒精消毒10min后再用0.1%氯化汞浸泡5min可以降低污染率和提高存 活率。

三、棕色棉胚珠离体培养的不同激素配比的比较研究

实验总计9个处理，每处理均接20瓶左右，结果表明，激素配比为GA₃1.0 μmol/L+IAA1.0μmol/L+ZR1.0μmol/L最有利于棉纤维生长，其30DAC的胚 珠鲜重和纤维长度分别为0.2360g和20.16mm。

四、在棕色棉胚珠离体培养的基础上进行光诱导实验研究

结果表明，光培养较暗培养有利于胚珠的生长，光培养的彩色棉的胚珠鲜重 均高于暗培养。光培养的纤维长度均短于暗培养。暗培养较光培养有利于色素合 成。当40DAC时，棕色棉胚珠鲜重和纤维长度分别为0.2258g、0.2687g和 22.67mm、19.43mm。

实施例2：

一、绿色棉胚珠的离体培养

绿色棉（绿絮棉1号）大田种植，常规管理。于早上9点左右对当日花挂牌。 将当天采集的花后2天的幼铃花冠拉去，并剥去花萼，仅留适当长度的花柄。并 将这些幼铃用蒸馏水洗涤2次放入超净工作台。用75％酒精消毒10min后再用 0.1%氯化汞浸泡10min，消毒后用无菌水冲洗7次，在超净工作台中剥取胚珠， 并将胚珠接种于激素配比为GA₃1.0μmol/L^-1+IAA5.0μmol/L+ZR2.5μmol/L 的BT培养基上。每瓶接种同一个子房的胚珠约20粒，每处理均接20瓶左右，置 于(31±1)℃条件下进行暗培养并观察生长情况。

二、绿色棉胚珠离体培养的不同取材和消毒处理方法的比较研究

实验总计9个处理，每处理均接20瓶左右，结果表明，取花后2天的幼铃 用75％酒精消毒10min后再用0.1%氯化汞浸泡10min可以降低污染率和提高 存活率。

三、绿色棉胚珠离体培养的不同激素配比的比较研究

实验总计9个处理，每处理均接20瓶左右，结果表明，激素配比为GA₃1.0 μmol/L+IAA5.0μmol/L+ZR2.5μmol/L最有利于棉纤维生长，其30DAC的胚 珠鲜重和纤维长度分别为0.1923g和23.17mm。

四、在绿色棉胚珠离体培养的基础上进行光诱导实验研究

结果表明，光培养较暗培养有利于胚珠的生长，光培养的彩色棉的胚珠鲜重均高 于暗培养。光培养的纤维长度均短于暗培养。暗培养较光培养有利于色素合成。 当40DAC时，绿色棉胚珠鲜重和纤维长度分别为0.308g、0.196g和16.33mm、 17.83mm。