一种蛋白质类泛素化修饰位点鉴定方法

摘要

本发明涉及一种蛋白质类泛素化修饰位点鉴定方法，该特异性富集标记鉴定方法首先是对纯化后的类泛素化修饰蛋白质进行酶解，通过特异性类泛素化抗体富集类泛素化修饰的酶切肽段，随后利用化学标记对所富集肽段中的非修饰化的赖氨酸氨基残基进行保护，并经去泛素化酶催化反应以裸露出底物肽段序列上被修饰的赖氨酸，经液相色谱串联质谱联用仪分析肽段序列，通过蛋白质质谱数据分析软件匹配得到被化学修饰的肽段序列，其序列中含有游离氨基的赖氨酸位点即为类泛素化修饰位点。与目前常用的基因突变方法获得位点方式比较，本发明的优点是无需繁琐的基因突变技术手段即可快速、高效、准确地得到蛋白质类泛素化修饰位点信息。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质组学领域，更具体地讲，涉及蛋白质类泛素化修饰位点 的鉴定及应用。

背景技术

细胞内存在多种蛋白质翻译后修饰方式，如磷酸化、乙酰化、泛素化、甲 基化等，它们都对蛋白质发挥正常的生物学功能起着重要作用。其中泛素化 (ubiquitylation)是介导蛋白质降解的重要方式之一，通过将76个氨基酸的泛素 (ubiquitin，Ub)结合到靶蛋白上形成多聚泛素链，被蛋白酶体识别，引起蛋白 质降解。近些年来几种类泛素蛋白(ubiquitin-likeproteins，Ubls)陆续被发现，它 们结构与泛素类似，在细胞内具有广泛功能，SUMO(small ubiquitin-related  modifier)就是其中的重要成员之一。SUMO是一类高度保守的蛋白质家族， 该家族的第一个成员SMT3于1995年在酿酒酵母中被首次发现，当时认为它 有参与有丝分裂和减数分裂的功能。随着研究的进一步深入发现，SUMO化 (sumoylation)功能远不限于此。SUMO可与包括雄激素受体(androgen receptor， AR)、IκBα、c-Jun、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)及p53 在内的多种蛋白质结合，参与了更为广泛的细胞内代谢途径，在转录调节、DNA 修复、核转运、信号转导和细胞周期调控等多方面均发挥着重要作用。

具有修饰功能的SUMO，是一类广泛存在于真核生物细胞中的高度保守的 蛋白家族，在芽殖酵母、线虫、果蝇及培养的脊椎动物细胞中均有表达。人类 基因组编码四种不同的SUMO蛋白，分别为：SUMO-1(又称PIC1,UBL1, sentrin,GMP1或SMT3)、SUMO-2(又称SMT3A或sentrin3)、SUMO-3(又称 SMT3B或sertrin2)和SUMO-4，其中SUMO-1、SUMO2及SUMO3在各种组 织中均有表达，而SUMO-4则主要在肾脏、淋巴结和脾脏中表达。其中 SUMO-2，3具有97%的同源性，而与SUMO-1的同源性仅50%。序列比对结 果表明：所有的SUMO蛋白都具有保守的泛素结构域和C端双Gly的断裂/连 接位点，N端延伸区域富含带电荷氨基酸、Gly和Pro，为特异的蛋白-蛋白相 互作用提供了结构基础。

SUMO化是动态的可逆性修饰过程，所有的SUMO都以非活性的前体形 式存在,需在泛素相似蛋白加工酶(ubiquilin like protein progressing enzyme， ULPs)或SUMO特异性蛋白酶(SUMO specific proteases，SENP)催化下水解C 端短肽以暴露出GlyGly残基,成为成熟的SUMO。与泛素化修饰相似,成熟的 SUMO在ATP存在下，经SUMO活化酶E1，SUMO结合酶E2，SUMO连接 酶E3的级联反应，最终其C端Gly残基与靶蛋白底物Lys侧链ε-氨基通过异 肽键偶联。研究发现，连接酶E3决定了底物特异性。超过50%SUMO底物靶 位点为一保守序列ΨKXE(Ψ代表L、I、V、F等疏水氨基酸,K代表赖氨 酸，X为任意氨基酸，E代表谷氨酸)。另一个具代表性的保守序列叫做磷酸 化依赖的SUMO序列，即ΨKXE紧连着P介导的磷酸化序列。SUMO修饰的 逆反应过程是由一组SUMO特异性蛋白酶（SUMO-specific proteases,SENPs） 完成。

对SUMO化修饰蛋白质的发掘已经从以往的利用突变技术集中单个或少 数蛋白修饰发展到目前利用高通量蛋白质组学技术，进行大规模SUMO化修 饰蛋白质的发掘与鉴定。与文献数以万计的磷酸化位点相比，目前鉴定到的 SUMO化位点鉴定的研究可谓凤毛菱角。主要原因如下：第一，由于SUMO 化修饰的动态性和可逆性，正常细胞内SUMO化的蛋白占总蛋白比例不超过 5%，许多蛋白只有处在特定刺激条件下如细胞周期、营养状态、热休克、DNA 损伤等才会被SUMO化修饰，如何富集到足够的SUMO化肽段进行鉴定而排 除未修饰肽段的干扰，一直是研究的难点；第二，SUMO化修饰使得被胰酶酶 切后的SUMO化修饰肽段分子量有显著迁移（SUMO-1修饰使得肽段分子量 增加2136Da，SUMO-2/3修饰使得肽段分子量增加3552Da）,若被修饰肽段 带电荷不足，荷质比不在质谱检测范围内（400-1800），则不能被选中，进行 MS/MS序列鉴定；第三，高分子量的SUMO化肽段在一级质谱中被选定进行 碰撞诱导解离时，由于碰撞能量有限，往往不能提供足够丰富的碎片离子供序 列鉴定之用；第四，与磷酸化修饰不同，SUMO修饰部分的氨基酸序列也会产 生碰撞解离，使得整张SUMO化肽段MS/MS质谱图相当复杂。尽管有所尝试， 目前尚未有可商业化数据分析软件，能够对这些SUMO修饰质谱的MS/MS进 行高通量识别，鉴定出底物肽段序列及修饰位点。体外反应体系鉴定到仅有少 量SUMO化位点。采取对SUMO序列特定氨基酸进行突变可获得一些位点数 据。

确定蛋白质SUMO化修饰位点不仅能够阐明可能发生修饰的保守氨基酸 序列或者结构基序的特定规律，而且为研究此类修饰对于蛋白质在信号通路的 潜在功能提供了重要证据，对于明确蛋白质SUMO修饰的生物学效应，深入 研究SUMO化修饰在细胞生长、发育、凋亡过程中的关键调控作用，具有重 要意义。

发明内容

为解决类泛素化修饰位点鉴定的困难，本发明提供一种可快速、准确鉴定 蛋白质类泛素化修饰位点鉴定的方法。

本发明的第二个目的，是提供化学标记在蛋白质类泛素化修饰位点鉴定中 的应用。

为了解决上述问题，本发明提供了一种蛋白质类泛素化修饰位点鉴定方 法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对纯化的SUMO化蛋白进行酶切；

（2）特异性抗体对SUMO化修饰肽段富集；

（3）化学标记对所富集肽段中的非修饰化的赖氨酸氨基残基进行保护；

（4）去泛素化酶催化反应以裸露出底物肽段序列上被修饰的赖氨酸；

（5）液相色谱质谱联用仪分析肽段序列；

（6）利用蛋白质质谱数据分析软件匹配得到被化学修饰的肽段序列，其序列 中含游离氨基的赖氨酸位点即为类泛素化修饰位点；

所述SUMO化修饰包括SUMO1，SUMO2和SUMO3类泛素化修饰。

作为一个优选方案，步骤（2）所述抗体是指对SUMO化肽段进行修饰的 特异性抗体，经兔血清免疫所得，可分别特异性识别类泛素修饰SUMO1， SUMO2或者SUMO 3所对应的特定氨基酸序列。

作为又一个优选方案，步骤（3）所述化学标记为二烷基化修饰或乙酰化 修饰或胍基化修饰中的一种。

所述二烷基化修饰包括如下步骤：

（a）将样品溶于pH7.5缓冲溶液中，加入新鲜配置的醛类溶液中，混合均匀；

（b）加入新鲜配置的还原试剂，混合均匀，反应完毕后用终止溶液淬灭反应;

（c）用色谱预柱脱盐。

作为一个优选方案，步骤（a）所述的醛类化学结构式为R¹CHO，R¹为 碘取代的C₁～C₁₀的烷基，浓度为0.01–1M之间；

步骤（b）所述的还原试剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠或者硼烷中的一种， 浓度为0.01–1M之间；反应温度0-60℃之间；反应时间1-48小时；所述的 终止溶液指酸性溶液，为盐酸、甲酸、乙酸或者三氟乙酸溶液中的一种或几种， 浓度在0.1-5%之间；

步骤（c）所述色谱预柱为Ziptip脱盐柱。

所述乙酰化修饰包括如下步骤：

（a）将样品溶于pH7.5缓冲溶液中，加入新鲜配置的N-乙酸基取代物溶液中， 混合均匀；

（b）加入新鲜配置的去酯化反应溶液，混合均匀，用终止溶液淬灭反应；

（c）用色谱预柱脱盐。

作为一个优选方案，步骤（a）所述的N-乙酸基取代物溶液为N-乙酸基乙 酰氯、N-乙酸基乙酸、N-乙酸基琥珀酰亚胺或者N-乙酸基甘氨酸中的一种或 几种，浓度为0.01-1M之间，反应温度25-60℃之间；反应时间1-24小时；

步骤（b）所述的去酯化反应溶液为盐酸羟胺、硫酸羟胺、N,N-二乙基羟 胺、硝酸羟胺或者磷酸羟胺中的一种或几种，浓度为0.01–1M之间，所述终 止溶液为谷氨酸、甘氨酸或者亮氨酸中的一种或几种，浓度在1-100mM之间；

步骤（c）所述色谱预柱为Ziptip脱盐柱。

所述胍基化修饰包括如下步骤：

（a）将样品溶解于碱性缓冲溶液中，加入新鲜配置的邻甲基异脲硫酸盐溶液， 启动化学反应；

（b）加入酸性缓冲溶液，调pH值至酸性淬灭反应；

（c）用色谱预柱脱盐。

作为一个优选方案，步骤（a）所述的碱性缓冲溶液为氢氧化钠、氢氧化 钾、碳酸钠或者氨水中的一种或几种，浓度为1-10M之间；反应温度在-20-100 ℃之间，反应时间1-24小时；

步骤（b）所述的酸性缓冲溶液为甲酸、乙酸、丁酸、醋酸或者三氟乙酸 中的一种或几种，浓度为0.01%-20%之间；

步骤（c）所述色谱预柱为Ziptip脱盐柱。

作为又一个优选方案，步骤（4）所述去泛素化酶催化反应包括如下步骤：

（a）将样品重新溶于去泛素化酶及酶催化反应缓冲溶液，混合均匀，37℃反 应；

（b）色谱预柱脱盐。

作为一个优选方案，步骤（a）所述去泛素化酶指SENP，包括SENP1， SENP2或者SENP3中的一种或几种；所述酶催化反应溶液为含有还原试剂和 氯化钠的磷酸、Tris-HCl或Hepes-HCl缓冲溶液，所述还原试剂为二硫苏糖醇 或者β-巯基乙醇溶液，还原试剂浓度为0.001–1M之间，氯化钠浓度为0.05–1 M之间；

步骤（b）所述色谱预柱为Ziptip脱盐柱。

为了实现本发明第二个目的，本发明提供化学标记在蛋白质类泛素化修饰 位点鉴定中的应用。

作为一个优选方案，蛋白质类泛素化修饰位点鉴定包括如下步骤：

（1）对纯化的SUMO化蛋白进行酶切；

（2）特异性抗体对SUMO化修饰肽段富集；

（3）化学标记对所富集肽段中的非修饰化的赖氨酸氨基残基进行保护；

（4）去泛素化酶催化反应以裸露出底物肽段序列上被修饰的赖氨酸；

（5）液相色谱质谱联用仪分析肽段序列；

（6）利用蛋白质质谱数据分析软件匹配得到被化学修饰的肽段序列，其序列 中含游离氨基的赖氨酸位点即为类泛素化修饰位点；

所述SUMO化修饰包括SUMO1，SUMO2和SUMO3类泛素化修饰。

作为一个优选，所述化学标记是指二烷基化修饰、乙酰化修饰或者胍基化 修饰。

本发明的SUMO化蛋白纯化和对纯化的SUMO化蛋白进行酶切为常规步 骤，一般包括如下步骤：

(a)将蛋白溶液中加入还原试剂，使蛋白二硫键打开；

(b)加入烷基化试剂,避光室温孵育30min，将蛋白巯基烷基化；

(c)取3-10mg蛋白，加入适量蛋白水解酶，酶解消化后中止酶活性；

(d)真空浓缩机浓缩干燥成粉末后，再加入1mL去离子水，反复重复此 过程3-4次。

步骤(a)所述的还原试剂推荐为二硫苏糖醇或者β-巯基乙醇等。

步骤(b)所述的烷基化试剂推荐为R₁(CO)NH₂，其中：R¹推荐为碘取代 的C₁～C₁₀的烷基，优选为碘取代的C₁～C4的烷基。

步骤(c)所述蛋白水解酶可以为typsin,Lys-C,Arg-C等。与蛋白的反应比 例推荐在1:50-1:100之间，视酶活性而定。

步骤（2）特异性抗体对SUMO化修饰肽段富集是采用肽段富集的常规操 作步骤，一般包括如下步骤：

（a）将酶解肽段溶于抗体富集缓冲溶液，加入抗体,温和转动孵育12h 后，用富集缓冲溶液洗三次，12000g离心30s；

（b）将可识别抗体的特异性微珠加入到（a）溶液中，温和转动孵育4-8 h；

（c）离心1000g，小心移去上清，1mL用洗涤缓冲溶液洗涤微珠三次；

（d）完全移去液体，加入150uL洗脱溶液，重复洗涤3次，收集所有 上清，真空干燥。

需要特别说明的是，步骤（2）所述对SUMO化肽段进行修饰的特异性抗 体，经兔血清免疫所得，其抗体特征在于，可分别特异性识别类泛素修饰 SUMO1，SUMO2或者SUMO3所对应的特定氨基酸序列。

步骤（a）所述的富集缓冲溶液为pH值8.0的缓冲溶液，含氯化钠，乙二 胺四乙酸钠、及少量表面活性剂。缓冲溶液推荐为Tris-HCl缓冲溶液。氯化钠 浓度为0.05-1M之间，乙二胺四乙酸浓度为5-100mM之间，表面活性剂可以 为Brij35,Triton-X100等，浓度在0.005-5%之间。

步骤（b）所述的可识别抗体的特异性微珠推荐为商品化的proteinA微珠。

步骤（c）所述的洗涤缓冲溶液可为磷酸、Tris-HCl缓冲溶液或Hepes-HCl 缓冲溶液。

步骤（d）所述的洗脱缓冲溶液指酸性溶液，可为盐酸、甲酸、乙酸、三 氟乙酸溶液，浓度在0.1-5%之间。

本发明所用的液相色谱-质谱连用仪器指纳升液相色谱-质谱联用仪，为本 领域常规使用的检测仪器，推荐使用液相色谱仪为Agilent1200，推荐使用质 谱为LTQ-Orbitrap。仪器参数根据仪器型号进行设定。

本发明所用的数据分析软件指Sequest、Moscot、Protein Discovery等商 用蛋白质质谱数据分析鉴定软件。搜索参数根据液相色谱-质谱连用仪器配置 决定，均为本领域技术人员的常规操作方法。

本发明的优点在于：（1）本发明首次在蛋白质类泛素化修饰位点的检测和 鉴定方法中通过特异性类泛素化抗体富集被修饰化的酶切肽段，随后利用化学 标记对所富集肽段的游离氨基进行保护，并经去泛素化酶催化反应以裸露出底 物肽段序列上被修饰的赖氨酸，仅需2-3天即可完成整个流程，不需要繁琐的 基因突变技术手段即可快速、高效、准确地得到蛋白质类泛素化修饰位点信息。 （2）可通过市售商品化搜索软件对质谱鉴定结果进行分析，无需专门编写 SUMO化肽段质谱分析程序，节约了开发软件耗费的大量人力物力财力。（3） 方法稳定可靠，重复性良好。

附图说明

图1为类泛素化修饰位点鉴定方法流程示意图。

图2A为IPTG诱导表达Rangap-His-SUMO1SDS-PAGE图；图2B为 Western Blot证明目标分子量区域，蛋白Rangap-His-SUMO1被表达。

图3为蛋白Rangap-His-SUMO1表达纯化色谱图。

图4为SUMO化修饰肽段 GFQANVFITSLLVQMGLL(ELGMEEEDVIEVYQEQTGG)KSEDK的二级质谱 图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方 法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特 殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring  Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例：Rangap-His-SUMO1类泛素化修饰位点鉴定

1．目的蛋白纯化

(1)构建含非洲爪蟾的RanGap片段与人源His-SUMO1共表达质粒(以下 简称Rangap-His-SUMO1)，25μl菌接种25ml LB培养基小摇，按1:100接种 菌液至2×YT培养基大摇，2L/菌，添加相应抗生素，280rpm，37℃，约2-3h 后检测菌液OD600，待菌液温度稍降至室温20℃左右，加IPTG诱导，180 rpm，25℃，12h。

收取IPTG诱导后的菌蛋白，也收取相等量的菌液2OD，考染检测蛋白是 否被诱导表达。12%SDS-PAGE考染如图2-A所示，在目标分子量区域，有蛋 白被表达，通过Western Blot证明该条带为Rangap-His-SUMO1如图2-B所示。

(2)加入裂解液,高压破碎，至菌液不再粘稠，超速离心，20,000rpm，1h， 4℃。

(3)采用蛋白纯化仪对目标蛋白进行纯化。色谱柱为镍柱。A相为20mM 咪唑，0.5M氯化钠，20mM磷酸钠；B相为200mM咪唑，0.5M氯化钠， 20mM磷酸钠。流速为5mL/min，采用20分钟梯度，20分钟内线性梯度从 0-100%B,随后10倍柱体积100%B，及10倍柱体积100%A冲洗色谱柱。

图3为蛋白纯化时色谱图。

2．蛋白酶切

(1)1ml蛋白溶液加入10μl0.5M还原试剂,室温30min。

(2)加入27μl0.55M烷基化试剂,避光室温孵育30min。

(3)取3-10mg蛋白，加入胰酶(1:50胰酶/蛋白)，37℃消化过夜,99℃加热 5min，中止胰酶活性。12000g离心10min,弃沉淀留上清。

(4)真空浓缩机浓缩干燥成粉末后，再加入1mL去离子水，反复重复此 过程3-4次。

(5)将所得肽段取适量进行液相色谱-质谱鉴定。液相采用固定相为 Michrom Bioresources公司Magic C18AQ，0.1×150mm,粒径3μm，孔径μm；A相为2%乙腈，98%水，0.1%甲酸，B相为2%水，98%乙腈， 0.1%甲酸。采用90分钟梯度，90分钟内线性梯度从0–35%B,8min内维持 80%B，12分钟内维持95%B，随后20分钟维持0%B。质量分析器:LTQ /Orbit rap;扫描模式:正离子；离子源:Michrom公司Advance nonoESI喷雾; 电压:1.6kV；管状透镜电压:125V；一级质谱使用全质量数扫描，m/z 350-1800,R=1000,000(at m/z400)，使用m/z=445.120025作为实时内标;and  ion accumulation to a target value of 106.二级质谱通过数据依赖的扫描方式，分 析一级质谱图中强度最高的十个母离子，动态质量排除时间27s；碰撞诱导解 离能量设置为35%。

(6)将步骤(5)获取的质谱谱图通过Sequest搜索算法对非洲爪蟾和人类蛋 白质序列数据库搜索引擎进行比对，明确肽段序列、肽段修饰位点及其对应蛋 白。搜索参数为：MS1质量精度±10ppm,MS2质量精度1Da,可变修饰： Oxidation(M)+15.99492，；肽段允许6个可变动态修饰，每种修饰最多出现3 次。

搜库得到结果如表1所示，从表1中可知，目标蛋白Rangap-His-SUMO1 被富集纯化。

表1.非洲爪蟾和人类蛋白质序列数据库搜索结果

3.抗体富集

(1)将上述2所得肽段溶于1-2mL抗体富集缓冲溶液。

(2)将200μg约200ul抗体与100μL protein A微珠加入富集缓冲溶液使 终体积达1mL,温和转动4h。

(3)用1mL富集缓冲溶液洗三次，12000g离心30s。

(4)将protein A Beads加入到e)得到的肽段溶液中，4℃温和转动4-8h。

(5)离心1000g<10s,小心移去上清。

(6)1mL PBS洗涤微珠三次。

(7)完全移去PBS，加入150uL洗脱溶液。

(8)重复洗涤3次，收集所有上清，真空干燥。

4．化学标记

(1)将样品溶于50uL 50mM pH7.5磷酸缓冲溶液中，加入新鲜配置的 终浓度为60mM甲醛磷酸溶液中，混合均匀。

(2)加入终浓度为10mM硼氢化纳磷酸溶液。混合均匀，0℃反应2小时。

(3)Ziptip脱盐。取适量样品溶于含0.1%三氟乙酸的2%乙腈溶液中，用预 平衡过的Ziptip C18柱反复吸附至饱和状态，用0.1%三氟乙酸的2%乙腈溶液 预脱盐后，用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈反复洗脱，将样品至于EP管内真 空干燥。

5．去泛素化

(1)将样品重新溶于50mM Tris pH8.0含2mM DTT,20mM NaCl,100 uM SENP1的缓冲溶液中，混合反应。

(2)Ziptip脱盐，步骤同4(3)浓缩后加入15uL2%乙腈,0.1%FA放入液 相色谱自动进样器内待分析。

6.液相色谱-质谱分析

液相色谱-质谱的条件参数同2（5）。

7.搜索软件分析及结果

将步骤(1)获取的质谱谱图通过Sequest搜索算法对人类蛋白质序列数据 库搜索引擎进行比对，明确肽段序列、肽段修饰位点及其对应蛋白。搜索参数 为：MS¹质量精度±10ppm,MS²质量精度1Da,可变修饰：Oxidation(M) +15.99492;dimethylation(K)+28.0313;N端修饰：Dimethylation,+28.0313；肽 段允许6个可变动态修饰，每种修饰最多出现4次。

对已鉴定的肽段修饰位点进行手动确认，获得含有SUMO修饰蛋白及修 饰位点的准确信息列表。

根据以上实验列出质谱鉴定出的非洲爪蟾Rangap蛋白相关肽段如表2所 示，所有肽段N端及SENP酶切前游离的赖氨酸残基亦被化学修饰（化学修饰 后的氨基酸以小写字母表示以与未修饰氨基酸区分），而lVQMGLLKSEDk， sLLVQMGLLKSEDk，iTSLLVQMGLLKSEDk，vFITSLLVQMGLLKSED， gFQANVFITSLLVQMGLLKSEDk等肽段中含有共同的未被化学修饰的赖氨酸 残基，表明了非洲爪蟾Rangap蛋白522位赖氨酸残基为SUMO化修饰位点， 符合SUMO化底物ΨKxE经典基序特征;而大多数肽段如lVQMGLLk， lTLNHMVQQNYFPk等，与SUMO化位点无关。

将IP后肽段不经化学修饰、SENP酶切直接进入液相色谱质谱联用仪分 析，通过手动搜索，找到SUMO1修饰肽段 GFQANVFITSLLVQMGLL(ELGMEEEDVIEVYQEQTGG)KSEDK，其二级质谱 图如图4所示,证实非洲爪蟾Rangap蛋白522位赖氨酸残基为SUMO1化修 饰位点。

表2.非洲爪蟾Rangap蛋白相关肽段

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。