包合物包合率测定仪的测定方法

摘要

一种包合物包合率测定仪的测定方法，所采用的测定仪包括检测部分(1)、控制部分(2)和显示部分(3)，检测部分(1)包括样品管(11)、第一透镜(12)、短波通滤光片(13)、第二透镜(14)、激发光源(15)、第三透镜(16)、长波通滤光片(17)、第四透镜(18)和光电倍增管(19)；控制部分(2)主要为芯片；显示部分(3)为液晶显示屏.采用本装置测定包合物包合率的方法按五个步骤进行：一是备料，二是溶液的制备，三是仪器校正，四是荧光强度-包合率标准曲线的建立，五是样品包合率的测定.本发明独创了无光谱特征的包合物采用荧光法测定的新途径，且所改进的仪器灵敏度高，样品量低，操作简单，应用范围广。

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学实验仪器的使用方法，具体是用于药物包合物包合率即β-环糊精-药物包合物包合率的测定方法. 

背景技术

环糊精是一类由6～8个葡萄糖单元通过1，4糖苷键相互连接形成的一类环状低聚糖，具有“外亲水、内疏水、特殊空腔”的性质，可以通过超分子相互作用与许多有机或无机分子形成主客体包合物，在超分子化学领域得到了极为广泛的应用.β-环糊精在环糊精种类中应用最广，是一类由7个葡萄糖单元通过1，4糖苷键相互连接形成的一类环状低聚糖，能够包合各种形状大小与环糊精内腔相匹配的疏水性客体药物分子，以此提高客体药物分子的溶解性. 

目前，对于药物包合物包合率的测定多采用光谱法直接进行测定，即根据包合前后药物分子光谱特性的变化来计算，此法不能测定无光谱特征的药物包合物分子，且操作复杂，样品用量高，存在一定缺陷. 

药物进入人体后通过体液输送到达体内能使具有内源荧光的蛋白质的荧光量子产率降低(荧光猝灭)，而药物包合物通过体液输送到达靶位缓慢释放出药物，对蛋白也有一定的荧光猝灭作用，因此可根据蛋白质的荧光猝灭差异来计算药物包合物的包合率，此法尚未见报道.所涉及的荧光计是一种重要的仪器，大多数传统的荧光计需要用大光束激发 样品，并需要大孔径光汇聚器件提高仪器的灵敏度，因此仪器庞大，样品用量大.CN203299124U公告了一种便携式荧光计，利用透镜将激发光进行汇聚，并通过空间滤光片或挡板去除背景及杂光，大大提高了仪器的灵敏度，本申请在此基础上，结合药物包合物对蛋白质的猝灭机理设计了一种新颖简便的包合物包合率测定仪及其测定方法. 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种改进型的包合物包合率测定仪的测定方法. 

为便于了解本方法，首先介绍一下本改进型的包合物包合率测定仪，它包括检测部分(1)、控制部分(2)和显示部分(3)，检测部分(1)包括样品管(11)的水平方向右侧设置有第一透镜(12)和第二透镜(14)，第一透镜(12)和第二透镜(14)之间设置有短波通滤光片(13)，第二透镜(14)右侧设置有激发光源(15)，样品管(11)的正上方设置有第三透镜(16)和第四透镜(18)，第三透镜(16)和第四透镜(18)之间设置有长波通滤光片(17)，第四透镜(18)的上端设置有光电倍增管(19)；控制部分(2)是根据操作规程自行编程制成的芯片，显示部分(3)是与芯片相连的液晶显示屏. 

用上述装置检测β-环糊精-药物包合物包合率的方法按如下步骤进行： 

(1)备料：市购或网购足量的三羟甲基氨基甲烷粉剂、质量浓度为37％的浓盐酸、蛋白粉、无水乙醇；按实验设计要求向有关企业订购梯度系列齐全的不同包合率的固态β-环糊精-药物包合物标准品； 

(2)溶液的制备： 

①取6.59g三羟甲基氨基甲烷和7.83mL浓盐酸，用蒸馏水配制成1000mL浓度为0.1mol·L^-1pH=7.43的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液； 

②以三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液为溶剂，配制与备料匹配的浓度为1.0×10^-5mol·L^-1的蛋白标准溶液； 

③以无水乙醇为溶剂，配制与备料匹配的浓度为1.0×10^-3mol·L^-1的梯度系列不同包合率的β-环糊精-药物包合物标准溶液； 

(3)仪器校正：取25μL已知包合率的包合物标准溶液注入含2.5mL蛋白标准溶液的样品管中，打开激发光源并将光引入样品管中，激发样品管中被测分子中的电子并导致发出荧光，此荧光经光电倍增管将光信号转化为电信号，经芯片计算出样品的包合率，通过比较当前的包合率与计算出的包合率，进行仪器校正； 

(4)荧光强度-包合率标准曲线的建立：将25μL不同包合率的β-环糊精-药物包合物标准溶液逐一注入含2.5mL蛋白标准溶液的样品管中，分别检测其荧光发射强度，此荧光强度经芯片拟合后得到以荧光强度为纵坐标，包合物的包合率为横坐标的荧光强度-包合率标准曲线； 

(5)样品包合率的测定：将25μL待测样品注入含2.5mL蛋白标准溶液的样品管中，检测其荧光发射强度，此荧光强度经过芯片代入已拟合的荧光强度-包合率标准曲线中，得到对应的包合率即为该样品的包合率. 

本发明的有益效果是能够独辟蹊径地提供一种实现无光谱特征的 包合物包合率的测定方法，而且所提供的仪器灵敏度较高，样品量低，操作简单. 

附图说明

图1为本包合物包合率测定仪的组成部件框示图. 

图2为本包合物包合率测定仪检测部分的结构示意图. 

图3为白藜芦醇对牛乳铁蛋白的荧光猝灭图. 

图4为β-环糊精对牛乳铁蛋白的荧光猝灭图. 

具体实施方式

下面本发明将结合实施例并参照附图作进一步详述，参见图1与图2，本包合物包合率测定仪，从功能上分，包括检测部分(1)、控制部分(2)和显示部分(3)，检测部分(1)包括有居中的样品管(11)，其水平方向的右侧设置有第一透镜(12)和第二透镜(14)，第一透镜(12)和第二透镜(14)之间设置有短波通滤光片(13)，第二透镜(14)右侧设置有激发光源(15)，样品管(11)的正上方设置有第三透镜(16)和第四透镜(18)，第三透镜(16)和第四透镜(18)之间设置有长波通滤光片(17)，第四透镜(18)的上端设置有光电倍增管(19)；控制部分(2)是根据操作规程自行编程制成的芯片，显示部分(3)是与芯片相连的液晶显示屏. 

本包合物包合率测定仪的样品管(11)为石英管；激发光源(15)为激发光二级管；四个透镜(12、14、16、18)均用于聚光；长波通滤光片(17)和短波通滤光片(13)均为玻璃滤光片，用来筛选出希望的激发光或荧光并滤除不需要的杂光干扰；控制部分(2)主要为自行编 程制成的芯片，由于不属专利法保护范畴，准备申请计算机软件保护，因此不赘述；光电倍增管(19)将光信号转化为点信号并放大；显示器部分(3)是液晶触摸显示屏，用于数据的显示及与荧光计交互作用如键入变量、设定参数等的输入。 

本包合物包合率测定仪使用时，将样品注入样品管(11)中，打开激发光源(15)，激发光经第二透镜(14)汇聚后通过短波通滤光片(13)过滤去除杂光，再经第一透镜(12)汇聚通入样品管中，激发样品管中被测分子中的电子并导致发出荧光，此荧光经第三透镜(16)汇聚后通过长波通滤光片(17)过滤去除杂光，再经第四透镜(18)汇聚通入光电倍增管中将光信号转化为电信号并放大，最后经过芯片计算出样品的包合率，并由液晶显示屏向用户显示正确的包合率. 

本包合物包合率测定仪用于检测β-环糊精-药物包合物包合率的方法按如下步骤进行： 

(1)备料：市购或网购足量的三羟甲基氨基甲烷粉剂、质量浓度为37％的浓盐酸、蛋白粉、无水乙醇；按实验设计要求向有关企业订购梯度系列齐全的不同包合率的固态β-环糊精-药物包合物标准品； 

(2)溶液的制备： 

①取6.59g三羟甲基氨基甲烷和7.83mL浓盐酸，用蒸馏水配制成1000mL浓度为0.1mol·L^-1pH=7.43的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液； 

②以三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液为溶剂，配制与备料匹配的浓度为1.0×10^-5mol·L^-1的蛋白标准溶液； 

③以无水乙醇为溶剂，配制与备料匹配的浓度为1.0×10^-3mol·L^-1的梯度系列不同包合率的β-环糊精-药物包合物标准溶液； 

(3)仪器校正：取25μL已知包合率的包合物标准溶液注入含2.5mL蛋白标准溶液的样品管中，打开激发光源并将光引入样品管中，激发样品管中被测分子中的电子并导致发出荧光，此荧光经光电倍增管将光信号转化为电信号，经芯片计算出样品的包合率，通过比较当前的包合率与计算出的包合率，进行仪器校正； 

(4)荧光强度-包合率标准曲线的建立：将25μL不同包合率的β-环糊精-药物包合物标准溶液逐一注入含2.5mL蛋白标准溶液的样品管中，分别检测其荧光发射强度，此荧光强度经芯片拟合后得到以荧光强度为纵坐标，包合物的包合率为横坐标的荧光强度-包合率标准曲线； 

(5)样品包合率的测定：将25μL待测样品注入含2.5mL蛋白标准溶液的样品管中，检测其荧光发射强度，此荧光强度经过芯片代入已拟合的荧光强度-包合率标准曲线中，得到对应的包合率即为该样品的包合率. 

荧光仪测定包合物包合率的原理： 

蛋白质分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸残基，可产生较强的内源荧光.药物通过体液输送到达体内能使具有内源荧光的蛋白质的荧光量子产率降低(荧光猝灭)，且存在一定的量-效关系，因此可以利用药物对蛋白质的荧光猝灭作用检知药物的含量. 

凡能使蛋白发生荧光猝灭的药物均可用上述方法可检知其含量，药物如结晶紫、水飞蓟宾、芥子碱、氧氟沙星、大黄酚、槲皮素、黄芩苷、 白藜芦醇、阿魏酸等，蛋白如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛乳铁蛋白等，下面我们以白藜芦醇对牛乳铁蛋白的猝灭为例进行实验，结果如图3所示，其中纵坐标表示荧光强度，横坐标表示扫描波长，牛乳铁蛋白浓度为1.0×10^-5mol·L^-1，曲线从上至下1～7表示白藜芦醇浓度分别为0、1.0×10^-5、1.6×10^-5、3.2×10^-5、4.0×10^-5、4.8×10^-5、6.4×10^-5(单位：mol·L^-1).从图3可以看出，白藜芦醇对牛乳铁蛋白的猝灭作用很大，且随着白藜芦醇浓度的增加，牛乳铁蛋白的荧光强度会逐渐降低，白藜芦醇浓度与牛乳铁蛋白的荧光强度呈一定线性关系，经线性拟合获得方程为：y=-63.1281x+2060.4481，相关系数为0.9925。一般而言，相关系数大于0.8时，认为两个变量有很强的相关性，越接近1相关性越好，本实验相关系数为0.9925，说明白藜芦醇浓度与牛乳铁蛋白的荧光强度的线性好，可用于白藜芦醇含量的测定. 

图4为β-环糊精对牛乳铁蛋白的荧光猝灭图，其中纵坐标表示荧光强度，横坐标表示扫描波长，牛乳铁蛋白浓度为1.0×10^-5mol·L^-1，曲线从上至下1～7表示β-环糊精浓度分别为0、1.0×10^-5、1.6×10^-5、3.2×10^-5、4.0×10^-5、4.8×10^-5、6.4×10^-5(单位：mol·L^-1).从图4可以看出，β-环糊精对牛乳铁蛋白几乎无猝灭作用. 

β-环糊精-药物包合物进入人体后通过体液输送到达靶位会缓慢释放出药物，对蛋白也有一定的荧光猝灭作用，而β-环糊精对牛乳铁蛋白几乎无猝灭作用，说明药物包合物对牛乳铁蛋白起猝灭作用的是包合物中释放的药物，而药物包合物中释放药物的含量与其包合率大小呈正相关性，据此可根据药物包合物中释放出的药物对牛乳铁蛋白的猝灭作 用，计算出释放的药物含量，进一步推测药物包合物的包合率.本申请是利用梯度系列不同包合率的药物包合物标准品对蛋白质的猝灭差异绘制标准曲线，用此来计算未知包合物的包合率。