拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途

摘要

本发明公开了一种拮抗抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）与其受体（VEGF-R）结合的小鼠单克隆抗体及其重链可变区与轻链可变区氨基酸序列。本发明还公开了该抗体的人源化制备过程及该人源化抗体重链可变区与轻链可变区氨基酸序列。该人源化抗体或其衍生体可作为药物组合物成分或制备成合适药物制剂，单独给药或与化疗药物等其他治疗手段合并使用，用于广谱治疗结肠癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤等各种实体瘤。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术单克隆抗体领域。本发明涉及一种可拮抗抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）与其受体（即VEGF-R）结合的单克隆抗体及其用途。 

背景技术

血管新生或增生(angiogenesis)在生物学上是指体内的已存在的血管(如毛细血管和微小动、静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生也与许多病理变化（如肿瘤的增生扩散、炎症等）息息相关。体内的血管能够不断地增生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有不断分裂增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)则是已知的最重要及最强烈的促血管内皮细胞分裂增生及血管增长的因子。VEGF在血管增生中的重要性已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被充分证实：因为只要当VEGF基因中的一份被敲除后，小鼠胚胎在仅发育至11至12天时就会因血管增生受阻及异常而死亡(Carmeliet P等Nature 1996,380:435;Ferrara N等Nature 1996，380:439)。 

VEGF在多种恶性肿瘤组织中（如结直肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、多发性骨髓瘤等）呈过度表达，且其表达水平高低与肿瘤生长与转移复发程度呈高度正相关(Dvorak HF等：J Exp Med1991;174:1275-8；Brown LF等Cancer Res 1993;53:4727-35；Weidner N,Semple JP,Welch WR及Folkman J:N Engl J Med 1991；324:1-8.4-5)。近年来国内外一系列动物试验及临床实践已证明：通过基因调控或给予外来药物来阻断体内VEGF及其受体（VEGF-R）介导的促血管增生，则可导致肿瘤组织因缺血而坏死，从而达到抑制肿瘤生长和转移及延长患者生存期的良好疗效。因此,以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤血管增生药物已成为当今国内外药物研发竞争热点。 

在以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤血管增生药物的开发上，目前主要有两大模式： 

模式一是研制拮抗VEGF受体（VEGF-R）中位于细胞膜内的酪氨酸蛋白激酶活性的抑制剂，这类拮抗抑制剂一般都属于小分子化学类药，其中的代表性药物为2006年由美国Pfizer(辉瑞)开发上市的Sutent(舒尼替尼);及由德国Bayer(拜耳)与美国Onyx Pharmaceuticals开发上市的Nexavar。 

模式二是研制可直接阻断VEGF与其受体（VEGF-R）结合的抗体或抗体Fc融合蛋白等大分子蛋白类生物制剂。该类代表性药物为由Roche/Genentech公司研发生产并于2004年2月获美国FDA批准上市的人源化抗VEGF单克隆抗体药Bevacizumab（贝伐单抗）,商品名Avastin（阿瓦斯丁)。Avastin是目前为 止全球市场上唯一的一个抗VEGF单克隆抗体药物。Avastin通过与体内VEGF的高度特异结合,从而阻止VEGF与其受体的结合，进而达到阻断血管增生与抑制肿瘤增生的疗效（Presta LG等Cancer Res，1997，57:4593;Hurwitz H等N Engl J Med，2004;350:2335）。Avastin目前已获美国FDA批准用于治疗转移性结肠癌(metastatic colorectal cancer,mCRC)、晚期肺癌(advanced non-squamous non–small celllung cancer,NSCLC)、脑胶质瘤(glioblastoma)、转移性肾癌(metastatic kidney cancer，mRCC)等多种实体瘤。Avastin 2010年2月获中国SFDA批准用于治疗结肠癌。 

Avastin其前身可追溯到代号为A4.6.1的小鼠单克隆抗体。该小鼠单克隆抗体的来源及分泌它的杂交瘤细胞系与用途在专利号为US6,582,959的美国专利（发明人：Kim，Kyung Jin，专利授权日期：June 24,2003，专利名称：Antibodies to vascular endothelial cell growth factor）；及专利号为US7,227,004的美国专利（发明人：Kim，Kyung Jin专利授权日期：June 5,2007，专利名称：Antibodies to vascularendothelial cell growth factor）中都有所描述。该鼠源抗体及其人源化抗体rhuMab-VEGF（即Avastin）的序列及其制备方法在专利号为US6,054,297的美国专利（发明人：Carter;Paul J.及Presta;LeonardG，专利申请日期：May 9，1995，专利授权日期：April 25,2000，专利名称：Humanized antibodiesand methods for making them）公开并在国际期刊杂志上发表（Presta LG等Cancer Res，1997，57:4593）。 

但该抗体还存在如下不足： 

1）与大多数的单克隆抗体一样，小鼠单克隆抗体A4.6.1及其人源化抗体Avastin也仅只是能结合VEGF抗原表位中的部分位点，无法结合或涵盖VEGF抗原表位中众多的其他位点。 

2）先前在动物实验中及近年来的临床研究中发现仅单独给予小鼠单克隆抗体A4.6.1或Avastin抗体，无法达到完全中和抑制体内VEGF及其介导的促血管新生。 

因此，研制具有新的VEGF结合位点的，且可拮抗抑制VEGF与其受体（VEGF-R）结合的全新单克隆抗体或药物制剂显得很有意义与必要。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种拮抗抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）与其受体（VEGF-R）结合的抗体或其衍生体。该抗体包括人源化抗体或其衍生体如抗体Fab片段、单链抗体等。 

本发明的另一个要解决的技术问题是提供编码上述抗体的DNA分子或基因。 

本发明的另一个要解决的技术问题是提供含有上述抗体的药物组合物。 

本发明的还一个要解决的技术问题是提供制备上述抗体的方法。 

为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种拮抗抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）与其受体（VEGF-R）结合的鼠源单克隆抗体，该抗体的特征是其轻链可变区具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列， 重链可变区具有SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。该鼠源单克隆抗体来源于代号为PV19-5的小鼠杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCC No 5889.保藏地点：中国，北京）。此外，本发明还提供编码上述鼠源单克隆抗体的DNA分子,其轻链可变区具有SEQ ID NO.：3所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO.：4的核苷酸序列。 

本发明另一方面提供了来源于上述鼠源单克隆抗体的人源化单克隆抗体。与鼠源单克隆抗体相比，人源化单克隆抗体作为治疗药物具有在人体中半衰期长（可长达20天）及免疫原性低等优点，便于长期或反复多次体内使用。本发明中将上述鼠源单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区基因都进行了人源化改造，其中包括框架区和抗原结合区域/互补决定区临近位点的氨基酸置换。该人源化单克隆抗体的特征是其轻链可变区具有SEQ ID NO.:5所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO.:6所示的氨基酸序列。此外，本发明还提供编码该人源化单克隆抗体可变区的DNA分子。其轻链可变区具有SEQ ID NO.：7所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO.：8的核苷酸序列。 

本发明的第三方面是提供上述人源化单克隆抗体的衍生体，其特征是该衍生体的轻链抗原互补决定区（complementarity-determining regions，CDR-L）包含SEQ ID NO.：9，SEQ ID NO.：10及SEQ ID NO.：11的氨基酸序列，其重链抗原互补决定区(CDR-H)包含SEQ ID NO.：12，SEQ ID NO.：13及SEQ ID NO.：14的氨基酸序列。 

本发明第四方面是提供了一种表达载体，它含有编码上述人源化单克隆抗体的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。 

本发明第五方面提供了一种重组宿主细胞，它由上述表达载体转化而成。该重组宿主细胞或其子代细胞表达上述人源化单克隆抗体。 

本文所采用的术语“单克隆抗体（单抗）”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂（通常是具有针对不同决定簇的不同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。 

本文所采用的术语“人源化单克隆抗体”系将鼠源单克隆抗体的氨基酸序列除保留互补决定区（CDR）外，其它序列（包括可变区中的框架区序列）全部或大部分替换成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以达到通过基因工程手段最大限度地降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性。 

本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链（L）和两个相同的重链（H）组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不 同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区（VH）。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区（VL），另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。 

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区（CDR）或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区（Frameworkregions，FR）。抗体重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位（参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷1，647-669页（1991））。抗体恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性（ADCC）或补体介导毒性（CDC）。 

本发明的抗体通常可以通过以下方法来制备。 

首先，将含有编码本发明的抗体的基因插入到含有合适的表达调控序列的表达载体中。 

本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制基因表达的序列。表达调控序列包括与目标基因操作性相连的启动子和终止信号。编码本发明抗体的基因（DNA）序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的蛋白质序列人工合成或用PCR法扩增得到。其后可用本领域熟知的各种方法将合成或PCR扩增得到的DNA片段插入到合适的表达载体中。本发明中所用的表达载体可以是本领域技术人员已知的市售表达载体，如Invitrogen公司的pCDNA3.1表达载体。 

用于接纳表达载体转化的合适宿主细胞一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。在本发明中，较佳的宿主细胞是哺乳动物细胞，尤其是中华仓鼠卵巢（CHO）细胞。 

表达载体转化的宿主细胞在合适的条件下（如以无血清培养基在细胞培养瓶或生物反应器中贴壁或悬浮培养）培养后，收获培养上清液，然后用包括protein-A亲和层析、离子交换层析、过滤等本领域技术人员熟知的常规分离步骤或手段纯化得到本发明的抗体。 

纯化得到的本发明抗体可以溶于适当的溶剂如生理盐水或PBS液体中，理想的最终溶度可以制备成0.1至100mg/ml之间。 

本发明第六方面提供了一种药物组合物，它含有药学上有效量的如本发明中描述的人源化单克隆抗体或其衍生体以及药学上可接受的载体。 

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当该抗体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生 过敏或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的抗体蛋白相容，即能与其共混而不会大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子包括糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；稳定剂；抗氧化剂；无热原无菌注射用水；生理盐水溶液；磷酸盐缓冲剂等。 

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型如冻干粉剂、注射剂、滴眼剂等给药，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。 

本发明第七方面提供了上述药物组合物在制备治疗与血管增生相关的疾病的药物制剂中的应用。在本发明的具体实施实例中，描述了该人源化抗体在体内抑制人结肠癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤等多种移植肿瘤生长的应用。 

本发明第八方面是提供制备上述人源化单克隆抗体的方法，该方法包括如下步骤： 

a)提供一表达载体，该表达载体含有编码所述人源化单克隆抗体的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列； 

b)用步骤a）所述的表达载体转化宿主细胞； 

c)在适合所述人源化单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞：和 

d)从该宿主细胞培养液中分离纯化获得所述人源化单克隆抗体。 

为获得可拮抗抑制人VEGF蛋白与其受体（VEGF-R）结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，本发明选取由酵母表达的重组人VEGF165蛋白为免疫抗原，通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗VEGF多克隆抗体；再从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合、再经药物筛选及亚克隆等步骤而建立了多株稳定分泌抗人VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞。其中一代号为PV19小鼠杂交瘤细胞株，经ELISA、免疫印迹、免疫组化等多种方法鉴定，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并高亲合力结合人VEGF（包括VEGF121、165及VEGF189等主要亚型）。体外测试表明该鼠源单克隆抗体可高效抑制VEGF与其受体（VEGF-R）的结合。在人类移植肿瘤裸鼠模型上的测试结果还表明该鼠源单克隆抗体能有效抑制乳腺癌、横纹肌肉瘤等多种肿瘤在体内的生长。 

本发明通过蛋白分离纯化及基因工程等手段获得了编码该鼠源抗体的重链及轻链可变区基因，并在此基础上完成了该抗体的人源化改造。人源化改造后的抗体基因插入表达载体（pCDNA3.1）后转入中华仓鼠卵巢（CHO）细胞，获得重组工程细胞，并从重组工程细胞培养液中分离纯化得到具拮抗肿瘤体内增长生物活性的人源化抗体蛋白。该人源化抗体可作为药物组合物成分或制备成合适药物制剂，单独给药或与化疗药物等其他治疗手段合并使用，用于广谱治疗结肠癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤等各种实体瘤。 

本发明还公开了该抗体的人源化制备过程及该人源化抗体重链可变区与轻链可变区氨基酸序列。 

附图说明

图1为本发明实施例1中以重组人VEGF165蛋白包板，以ELISA法检测小鼠杂交瘤细胞（PV19）培养上清液与重组人VEGF蛋白结合的实验结果示意图。其中，M23为已知分泌抗人VEGF单抗的杂交瘤细胞上清液，为阳性对照。P16为非相关杂交瘤细胞培养上清液，为阴性对照；SP2/0代表未融合的骨髓瘤细胞培养上清液。 

图2为本发明实施例2中以SDS-PAGE分析鉴定从PV19瘤细胞的培养上清液中经亲合层析柱纯化获得的鼠源PV19单克隆抗体蛋白。图2中，泳道1为DTT还原的PV19抗体蛋白；泳道2为未还原的PV19抗体蛋白；Marker为蛋白质分子量标志。 

图3为本发明实施例3中竞争性ELISA结果的代表性示意图。其中的mPV19&Biotin-VEGF为PV19鼠源抗体组，W10&Biotin-VEGF为非相关的抗体组，作为阴性对照。 

图4为本发明实施例8中以SDS-PAGE分析鉴定从培养上清液中经亲合层析柱纯化获得的人源化hPV19单克隆抗体蛋白。图2中，泳道1为DTT还原的hPV19抗体蛋白；泳道2为未还原的hPV19抗体蛋白；Marker为蛋白质分子量标志。 

图5为本发明实施例8中以直接ELISA法比较由表达上清中纯化获得的人源化抗体（hPV19）、嵌合抗体（chPV19）及鼠源抗体（mPV19）与人VEGF165蛋白结合的相对活性结果示意图。其中的chP16为非相关嵌合抗体，作为阴性对照。 

图6为本发明实施例8中以竞争ELISA法比较人源化抗体（hPV19）、嵌合抗体（chPV19）及鼠源抗体（mPV19）体外阻断生物素标记的人VEGF165蛋白（bio-VEGF）与其受体（VEGFR1）结合的相对活性的结果示意图。其中的W10为非相关嵌合抗体，作为阴性对照。 

图7为本发明实施例9中以ELISA法比较分析人源化hPV19抗体及Avastin抗体与野生型（VEGF165）及点突变型人VEGF蛋白(VEGF-G88/A)的结合活性的结果示意图。 

图8A及图8B为本发明实施例10中人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人Ls-174-T结肠癌生长的实验结果示意图。其中图8A为实验期间各组相对肿瘤体积增长趋势图；图8B为实验结束时与阴性对照组相比，各治疗组平均肿瘤瘤重下降率（瘤重抑制率%）。 

图9A及图9B为本发明实施例11中人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人MD231-MBA乳腺癌生长的实验结果示意图。其中图9A为实验期间各组相对肿瘤体积增长趋势图；图9B为实验结束时与阴性对照组相比，各治疗组平均肿瘤瘤重下降率（瘤重抑制率%）。 

图10A及图10B为本发明实施例12中人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人人A673横纹肌瘤结果示意图。其中图10A为实验期间各组相对肿瘤体积增长趋势图；图10B为实验结束时与阴性对照组相比， 各治疗组平均肿瘤瘤重下降率（瘤重抑制率%）。 

图11A及图11B为本发明实施例13中人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人HCT8结肠癌结果示意图。其中图11A为实验期间各组相对肿瘤体积增长趋势图；图11B为实验结束时与阴性对照组相比，各治疗组平均肿瘤瘤重下降率（瘤重抑制率%）。 

代号为PV19-5的小鼠杂交瘤细胞株已于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCCNo.5889；保藏地点：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）。 

具体实施方式

下面将结合实施实例来进一步描述本发明，这些实施例只是为了起说明作用，而不是用来限制本发明。 

实施例1:分泌抗血管内皮细胞生长因子抗体的小鼠杂交瘤细胞系的建立与筛选鉴定 

步骤1.重组人VEGF165蛋白（免疫抗原）的制备 

利用PCR技术从人肺组织细胞cDNA文库中扩增得到编码人VEGF165完整开放读码框架序列(openreading frame,ORF）的基因片断，经序列测定鉴定正确，用限制性内切酶处理后，将其克隆到酵母表达载体pPic9K(Invitrogen公司)载体中，获得重组表达质粒pPic9K-VEGF165，用其转化毕赤酵母菌后，筛选出高效表达酵母菌。酵母菌经发酵、诱导表达，分离纯化后，获得纯度95％以上的重组人VEGF165蛋白。 

步骤2、动物免疫 

将上述纯化的重组人VEGF165蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射Balb/c小鼠（100μl/只，共10μg VEGF165蛋白）。首次免疫2-3周后，小鼠再给予皮下多点注射含VEGF165蛋白与不完全佐剂的混合物，加强免疫2-3次后，取少量小鼠血清，用包被人VEGF165蛋白的96-板以ELISA法检测小鼠血清中抗VEGF蛋白抗体的效价，取效价高者小鼠的脾细胞用于下一步的细胞融合。 

步骤3、细胞融合 

在末次免疫后3天，无菌制备小鼠脾细胞悬液，与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞(购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心），以5：1的比例在50%PEG-1000（Sigma公司产品）作用下融合。融合按常规法（KohlerG.and Milstein C:Nature 1975;256:495-497）,PEG用量1ml，1分钟内缓慢加完。反应90秒后，以无血清的RPMI-1640培养基终止反应，1000rpm离心10min,去除上清液，再将离心沉淀下的细胞以含10%HAT(H为次黄嘌呤、A氨基碟呤、T胸腺嘧啶核苷，为Sigma公司产品)的RPMI 1640-10%FCS培养基将细胞浓度调节至1×10⁶/ml，加入96孔平底细胞培养板（每孔200μl），于37℃，5%CO2培养箱中培养2-3周。 

步骤4、酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选抗体分泌阳性的小鼠杂交瘤细胞 

以重组人VEGF165蛋白（2μg/ml，pH 9.6，0.1M NaHCO3液）包被酶标板，37℃包被2小时或4℃过夜；2%牛血清白蛋白（BSA）4℃封闭过夜。经PBS-0.1%Tween20液洗涤后加入待检杂交瘤细胞培养上清（以未融合的SP2/0骨髓瘤细培养上清为阴性对照）37℃孵育2小时；经PBS-0.1%Tween20液洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP）-标记的羊抗小鼠IgG（Sigma公司产品），37℃孵育1小时；再经PBS-0.1%Tween20液充分洗涤后，加入邻苯二胺（OPD）-0.1%H₂O₂底物液显色10-15min,以0.1M HCl终止反应。在MK3-Multiskan酶标仪(Thermo Scientific公司产品)中读取492nm处OD值。测得的OD 492值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存。 

步骤5、阳性杂交瘤细胞的亚克隆-有限稀释法 

将上述初筛得到的阳性细胞以RPMI-1640-10%FCS培养基稀释至每孔1-10个细胞，铺于96-孔细胞培养板，于37℃，5%CO2培养箱中培养2-3周。待克隆长成，取上清液以ELISA再次检测鉴定抗VEGF抗体的分泌。经检测鉴定，获得多个抗体分泌阳性细胞株。其中，经再次亚克隆鉴定，获得了一株代号为P19-5（简称PV19)的稳定分泌抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。图1为以ELISA法检测鉴定PV19杂交瘤细胞上清液与重组人VEGF165蛋白结合，结果证明该杂交瘤细胞上清液含高效价抗人VEGF165蛋白的抗体。该抗体经鉴定为IgG类。该杂交瘤细胞株再经大量扩增，长期传代培养并于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCC No 5889.保藏地点：中国，北京）。 

实施例2.鼠源抗人VEGF单克隆抗体（PV19）的体外制备及纯化 

本实施例中，鼠抗人VEGF单克隆抗体（PV19）的分离纯化采用亲合层析法。 

其纯化步骤如下： 

将PV19杂交瘤细胞扩增后，接种于200ml无血清的1640培养基中，37℃培养5天，随后收集培养上清，经过0.45μm滤膜过滤后上样至含Protein G-Sepharose Fast Flow（购自通用电气GE公司）亲合层析柱；层析柱先以PBS液漂洗去除杂蛋白后,再以低pH(2.7-3.0)甘氨酸(0.1M)液洗脱被吸附的PV19抗体蛋白。洗脱液以1mol/L Tris(pH 8.5-9.0)调节pH至7.0，再对10倍体积的PBS液透析12～16后（期间换液2-3次），透析后的样品再经0.45μm滤膜过滤后即获得纯化的PV19抗体。 

将纯化的PV19抗体按常规方法在DTT还原及未还原条件下进行经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（SDS-PAGE）（分离胶为10%，浓缩胶5%）。图2为该电泳分析结果图谱，其中泳道1为DTT还原的PV19抗体，泳道2为未还原的PV19抗体。如图2所示：与未还原的PV19抗体样品相比后，DTT还原的PV19抗体分离为2条主带，其中处于上面的条带为PV19抗体重链，处于下面的条带为PV19抗体轻链。 

实施例3鼠源PV19单克隆抗体生物活性测定：竞争性ELISA法检测鉴定鼠源PV19单克隆抗体体外阻断VEGF与其受体的结合 

鼠源PV19单克隆抗体的生物活性测定方法之一是竞争性ELISA法检测鉴定抗体体外阻断VEGF与其受体的结合。该竞争性ELISA法的基本原理与过程是先将生物素标记的人VEGF165蛋白与不同溶度的单克隆抗体混合，之后再将混合物转入预先包被有重组可溶性VEGF受体蛋白（如可溶性VEGFR1蛋白）的96-孔板，经孵育及洗脱后，加入酶标记的Avidin（如辣根过氧化物酶标记的Avidin）。再经孵育及洗脱后，加入底物显示并测定OD值。 

检测具体步骤如下： 

1）用重组可溶性人VEGFR1蛋白（美国R&D公司产品）包被96-孔板（2μg/ml,50μl/孔)，4℃过夜； 

2）经PBS液漂洗及2%BSA(稀释在PBS-0.1%tween20液中)室温封闭后,分别加入固定溶度的生物素标记的VEGF165单克隆抗体（Bio-VEGF，1：1000）与不同溶度的PV19抗体，或非相关的抗体（W10），37℃孵育2h； 

3）经PBS-T洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的Avidin（1：5000），37℃孵育1h； 

4）经PBS-T洗脱后，加入显色液(邻苯二胺)-3%双氧水，室温10min至显色； 

5）加入HCL终止反应，以酶联免疫仪测定492nm波长处各孔的吸光值。 

图3为竞争性ELISA结果的代表性示意图。如图3所示:在PV19抗体（mPV19&Biotin-VEGF）组中，其OD值与抗体蛋白量成反比关系：即加入的PV19抗体的量越高，其OD值越低。而非相关的抗体（W10&Biotin-VEGF）组，各孔OD值不受加入的抗体蛋白量影响。此结果表明PV19抗体体外可阻断VEGF与其受体（VEGFR1）的结合。 

实施例4.编码鼠源PV19抗体可变区基因的克隆 

取纯化的鼠源PV19抗体，在DTT还原条件下经SDS-PAGE分离重链和轻链，然后将电泳条带转印至PVDF膜，用考马斯亮蓝R250显色后，分别剪取PV19抗体重链和轻链蛋白条带，用Edman降解法进行N-端氨基酸测序，获得该抗体轻链的N-端氨基酸序列。抗体重链由于N-端封闭，常规氨基酸N-端测序未获结果。 

1）．PV19抗体轻链可变区基因的克隆 

步骤1、采用试剂盒（江苏海门碧云天公司产品）从小鼠PV19杂交瘤细胞中提取出总RNA； 

步骤2、采用逆转录PCR(RT-PCR)方法在eppendorf管获得cDNA模板。其中用于逆转录PCR引物（mIg-kappa）序列为：TGTCGTTCACTGCCATCAAT（SEQ ID NO.：15）； 

其中RT-PCR反应体系如下： 

随后加入： 

于42℃温度下反应1小时，随后温度升至75℃，15分钟灭活后将获得的cDNA置于-20℃，保存备用。 

步骤3、根据PV19抗体轻链的N-端氨基酸序列信息，设计如下一对引物： 

正向引物（5’primer）:GAC ATT GTG ATG TCA CAG TCT CCA T（如SEQ ID NO.：16所示） 

反向引物（3’primer）：AAT TGG ATC CAG TTG GTG CAG CAT CAG C（如SEQ ID NO.：17所示） 

以上述引物及步骤2中获得的cDNA为模板进行PCR扩增获得PV19抗体轻链可变区编码基因。 

其中用于PCR扩增轻链DNA的反应体系如下： 

该PCR反应循环参数设置如下： 

步骤4、PCR结束后将反应产物在1%agarose胶中电泳。电泳结束后，将分离的DNA条带切下并进行测序获得抗体轻链可变区DNA的核苷酸序列。 

测得的该抗体轻链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO.:3，由该DNA的核苷酸序列推测得到的抗体轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.:1。该轻链抗原互补决定区（complementarity-determining regions，CDR）的CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列分别见SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11。 

2）．PV19抗体重链可变区基因的克隆 

重链由于缺乏N-端氨基酸序列信息，故采用简并引物PCR法，克隆获得重链可变区编码基因。其中用于克隆扩增该抗体重链可变区基因的一对引物为： 

正向引物（5’primer）：TCA G GCC ATT ACG GCC MMY CWM ACC AT（如SEQ IDNO.：18所示），其中M＝A或C，Y＝C或T代表:W＝A或T。 

反向引物（3’primer）：AAT TGG ATC CTG GGG GTG TCG TTT TGG C（如SEQ ID NO.：19所示） 

用上述引物及从小鼠PV19杂交瘤细胞中获得的cDNA模板采用PCR（PCR反应体系与参数类同上述轻链PCR）扩增获得重链可变区DNA.PCR扩增得到的DNA产物在1%agarose胶中电泳分析。电泳结束后，将分离的DNA条带切下并进行测序获得抗体重链可变区DNA的核苷酸序列。测得的该抗体重链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO.:4，由该DNA核苷酸序列推测得到的抗体重链可变区氨基酸序列见SEQ IDNO.:2。该重链抗原互补决定区的CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列分别见SEQ ID NO.:12、SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14。 

实施例5.人-鼠嵌合抗体（chPV19）的制备 

将实施例4中克隆扩增获得的PV19抗体轻链可变区基因和重链可变区基因分别与人-kappa轻链恒定区（C-domain）和人IgG1-重链恒定区基因片段融合，获得人-鼠嵌合轻链基因（chPV19L）及人-鼠嵌合重链基因（chPV19H）。其后将轻链嵌合基因与重链嵌合基因分别克隆至pcDNA3.1表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量含人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒。 

含人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒再与脂质体（Roche Fugen6）混合后共转染入CHO细胞。细胞转染后2-3天，取培养上清液，用包被人VEGF165蛋白的96-孔板，用HRP酶标记的Goat-anti-human-IgG为二抗（购自上海西塘生物公司)，为检测二抗，以ELISA法检测上清中的嵌合抗体（chPV19）与人VEGF165 蛋白结合。ELISA法检测结果表明表达质粒转染的CHO细胞上清中含有可与人VEGF的蛋白结合的嵌合抗体。 

实施例6.人源化抗体（hPV19）的初步制备与鉴定 

在ELISA法检测初步证明人-鼠嵌合抗体（chPV19）保持有与人VEGF蛋白高亲合力结合活性的基础上，采用PCR等系列基因工程克隆手段将该嵌合抗体轻链和重链中的抗原互补决定区(CDR)基因片段分别移植到对应人kappa-轻链和IgG1-重链可变区骨架（framework regions，FR）上，获得人源化的hPV19抗体。 

1）抗体轻链人源化 

通过氨基酸序列分析，确定人免疫球蛋白Kappa轻链第四V区胚系基因的表达产物(IgKV4-1，Gene ID:28908)与PV19轻链具有最高同源性。据此，将PV19轻链可变区基因与人免疫球蛋白Kappa轻链的恒定区(GenBank:BC095489.1)编码序列拼接，获得嵌合型轻链全长基因(cPV19-L)。然后，将cPV19-L轻链骨架区(FR)用人IgKV4-1的同源序列替换，经基因重组克隆最后成功获得人源化的轻链编码基因(hPV19-L)。其中人源化hPV19抗体轻链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO.:5。 

2）抗体重链人源化 

通过氨基酸序列分析，确定人免疫球蛋白重链第七V区胚系基因的表达产物(IgHV7-81，NCBI Gene:28378)与PV19抗体重链具有最高同源性。据此，将PV19抗体重链可变区基因与人免疫球蛋白IgG-Gamma1链恒定区(GenBank:BC073782.1)编码序列拼接，获得嵌合型重链全长基因(cPV19-H)。然后，将cPV19-H重链骨架区(FR)用人IgHV7-81的同源序列替换，获得人源化的重链编码基因(hPV19-H)。其中人源化hPV19抗体重链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO.:6。 

将含嵌合型重链基因（cPV19H）、嵌合型轻链基因（cPV19L）、人源化重链基因（hPV19H）、人源化轻链基因（hPV19L）分别克隆到pcDNA3.1表达载体，转入大肠杆菌后扩增分离获得各表达质粒。其后将各表达质粒两两组合后，瞬时转染人CHO细胞。转染48小时后，吸取孔内细胞培养上清，以VEGF165蛋白为包被抗原，HRP酶标记的Goat-anti-human-IgG为检测二抗（购自上海西塘生物公司)，OPD为显色底物，以直接ELISA法检测转染细胞上清中抗体与人VEGF165抗原结合的活性。 

下表1为ELISA代表性检测结果。如表1中结果所示：与嵌合型抗体一样，人源化hPV19抗体保持与人VEGF165蛋白结合的活性。 

表1ELISA分析瞬时转染细胞培养上清结合人VEGF165蛋白活性 

实施例7稳定高效表达人源化hPV19抗体的重组工程细胞的筛选与建立 

为了获得具产业化意义的、可稳定高效分泌表达hPV19抗体的重组工程细胞株，在本发明实施例中采用的方案是：先将含人源化hPV19抗体重链及轻链的基因同时插入到已含仓鼠二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的克隆质粒中（pCDNA3.1-DHFR），获得同时含人源化hPV19抗体重链及轻链基因的重组质粒(pQY-hPV19D-DHFR)。再将该重组质粒与脂质体混合后共转染人DHFR缺陷型中华仓鼠卵巢细胞细胞（CHO-DHFR-/-），通过逐渐增加细胞培养基中的氨甲喋呤（MTX）的溶度而提高转染细胞中DHFR基因（及抗体基因）的拷贝数及抗体蛋白的表达，从而筛选获得稳定高效表达人源化hPV19抗体的重组工程细胞株。 

有关该重组质粒的构建及重组工程细胞株的筛选与建立过程如下： 

1）含人源化hPV19抗体基因及DHFR基因的表达质粒(phPV19D-DHFR)的构建 

在本实施例中，选取含仓鼠二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的pCDNA3.1-DHFR质粒作为克隆载体，将含人源化hPV19抗体轻链基因（hPV19L）和重链基因（hPV19）同时插入到该克隆载体，获得名为pQY-hPV19-DHFR的表达质粒。该表达质粒中，用于驱动DHFR基因在哺乳动物细胞中表达的启动子是SV40早期启动子(pSV40)，用于驱动hPV19抗体轻链基因(hPV19L)表达的是人延伸因子1-α亚基启动子(pEF1-a)，用于驱动hPV19抗体重链基因(hPV19H)表达的是巨细胞病毒早期启动子(pCMV)。 

2）重组工程细胞的初步筛选 

采用罗氏（Roche）公司生产的FUGENE-HD脂质体作为转染试剂，将上述含人源化hPV19抗体基因的表达质粒phPV19D-DHFR(HEX)与FUGENE-HD脂质体按一定比例混合后，转染至DHFR缺陷型中华仓鼠卵巢细胞（CHO-DHFR-）。转染48小时后，吸取孔内细胞培养上清，在包被人VEGF165蛋白的96-孔板中以实施例6描述的直接ELISA法检测转染细胞上清中hPV19抗体的表达。ELISA法检测结果表明转染细胞上清中含有可与人VEGF165抗原结合的hPV19抗体。其后转染的细胞用胰蛋白酶液处理后再重悬于不含HT的IMDM培养基，以有限稀释法（limited dilution）接种培养于多个96孔细胞培养板中，培养5-7天后再挑取细胞上清以ELISA方法初步筛选检测细胞克隆。ELISA方法共筛选检测了400个样品孔上清，结果显示有380个样品为阳性克隆（上清阳性的克隆比例为95%），表达量介于1-10μg/ml之间。 

3）重组工程细胞在含氨甲喋呤的培养基中加压筛选 

上述初筛获得的几个表达相对较高的阳性克隆再接种培养在24-孔细胞培养板中，通过逐渐增加细胞培养基中氨甲喋呤（MTX）的溶度而提高抗体基因与抗体蛋白的表达。 

首轮（初始）MTX筛选浓度为5nM，培养3-4天后取细胞上清液，以ELISA法检测细胞上清中hPV19抗体蛋白浓度，从中挑选出表达量相对较高的细胞再铺至新的24孔细胞培养板中，进人下一轮（第2轮）MTX筛选（该轮MTX的筛选浓度增至为10nM）；以此类推，直至到培养基中MTX浓度增至320nM以上轮筛选结束。经7-8轮筛选最终获得了多个上清中抗体蛋白表达量高达150-200μg/ml的细胞株（与MTX筛选前相比，该轮筛选结束后抗体蛋白表达量增加20倍以上）。其中多株细胞经过多轮无血清培养基中悬浮培养与驯化后，在未经培养基配方与工艺优化条件下，其上清中hPV19抗体的表达浓度介于150-200μg/ml，这与驯化前的细胞株表达量相同。 

实施例8.人源化抗体（hPV19）的大规模制备与鉴定 

将无血清培养基悬浮培养驯化后的细胞株在培养瓶或生物反应器中规模培养。培养结束后收集细胞上清，上样至protein-A亲合层析柱纯化，再经过离子交换、病毒灭活及过滤等步骤，获得纯度达99%以上的人源化hPV19抗体。图4为从培养液中纯化获得的人源化抗体（hPV19）在DTT还原及未还原条件下的SDS-PAGE电泳一代表性图谱，其中泳道1为DTT还原的抗体，泳道2为未还原的抗体。结果显示DTT还原的抗体分为2条主带，其中处于上面的条带为hPV19抗体重链，处于下面的条带为hPV19抗体轻链；未还原的hPV19抗体则位于150kD附近，与理论预期的完整IgG1抗体的分子量一致。 

图5为以直接ELISA法比较纯化获得的人源化抗体（hPV19）、嵌合抗体（chPV19）及鼠源抗体（mPV19）与人VEGF165蛋白结合的相对活性的代表性结果图谱，ELISA检测具体方法同实施例5，其中的chP16为非相关嵌合抗体，为阴性对照。检测结果显示：纯化的人源化抗体（hPV19）保持与人VEGF165蛋白高度结合的活性，且其结合活力与其前身鼠源抗体（mPV19）非常接近。 

图6则为以竟争性ELISA法检测比较人源化抗体（hPV19）、嵌合抗体（chPV19）及鼠源抗体（mPV19）体外阻断人VEGF165蛋白（biotin-VEGF）与其受体（VEGFR1）结合的相对活性，竟争性ELISA检测具体方法同实施例6，其中的W10为非相关嵌合抗体，为阴性对照。检测结果显示：该人源化抗体（hPV19）可以阻断VEGF与其受体的结合，且其阻断活性与其前身鼠源抗体（mPV19）非常接近。 

实施例9.人源化hPV19抗体及Avastin抗体在VEGF抗原的识别位点比较 

根据公开文献报道，A4.6.1或Avastin抗体识别人VEGF蛋白的关键抗原表位在于第88位的甘氨酸（Gly,G88）附近，若将此甘氨酸突变为丙氨酸（G88/A点突变）则A4.6.1或Avastin抗体与该突变型VEGF 蛋白的结合强度则明显下降。为了比较hPV19抗体与Avastin在识别人VEGF抗原的位点方面是否存在差异，在此先体外构建含G88/A点突变的人VEGF165（G88/A），再以ELISA法分析检测人源化hPV19抗体及Avastin抗体与野生型及突变型VEGF蛋白的结合活性。其中具体实施步骤及结果描述如下： 

实施步骤1、G88/A突变型VEGF蛋白的表达、纯化 

采用重叠－延伸PCR法（重叠-延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，此技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计，重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用），利用一组引物（正向引物：VEGFG88F：CCT CAC CAA GCC CAG CAC ATA，如SEQ ID NO.:20所示，反向引物：VEGFG88R：CTA TGT GCT GGG CTT GGT GAG，如SEQ ID NO.:21所示）进行点突变，获得编码G88/A突变型人VEGF165的cDNA。其后将突变编码序列插入pPic9K表达载体中，然后将质粒导入毕赤酵母GS115菌株，诱导表达、纯化后获得突变型VEGF蛋白(VEGF G88/A)。 

实施步骤2、hPV19抗体及Avastin与对野生型人VEGF165结合力比较 

实验方法： 

1）将野生型人VEGF165或突变型VEGF蛋白(VEGF G88/A)蛋白包被在96孔-ELISA板。 

2）hPV19抗体及Avastin各对倍梯度稀释后，加至96孔板中，每孔100μl。37℃放置1小时。 

3）洗板后，加入1:2000稀释的HRP-Goat anti-human Fc抗体，每孔100μl。 

4）洗板后，加入底物OPD显色。 

ELISA检测结果如图7。如图7所示：hPV19抗体及Avastin与野生型人VEGF165的结合强度几乎相近。hPV19抗体及Avastin与突变型VEGF蛋白(VEGF G88/A)蛋白的结合强度则明显不同。与野生型人VEGF165的结合相比，Avastin与突变型VEGF蛋白(VEGF G88/A)蛋白的结合强度下降约25-50倍，而hPV19与突变型VEGF蛋白(VEGF G88/A)蛋白的结合强度仅下降约3-6倍。此结果表明hPV19抗体结合人VEGF蛋白的位点与Avastin的结合位点并不完全相同。 

实施例10.人源化hPV19抗体在裸鼠体内抑制人结肠癌细胞Ls-174-T移植瘤的生长 

步骤1：人Ls-174-T移植结肠癌裸鼠移植瘤模型的建立 

将对数生长期人Ls-174-T结肠癌细胞（购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心），按1×10⁷ 个/只接种于2只裸鼠右侧腋窝皮下或已有瘤块制备成1.5mm3左右，接种于动物右侧腋窝皮下，制备荷瘤种鼠；待肿瘤生长至400~600mm3左右，选择肿瘤生长及健康情况良好的荷瘤动物，无菌条件下取瘤，制备成1.5mm3左右，接种于动物右侧腋窝皮下，用于正式试验。 

裸鼠接种后观察肿瘤生长情况，待肿瘤体积为50-100mm3左右时，按瘤体积大小进行筛选，瘤体积过大及未成瘤者不予入选。筛选后随机分组给予不同剂量药物。 

步骤2：人源化PV19抗体治疗Ls-174-T移植结肠癌 

将上述接种了Ls-174-T结肠癌细胞的裸鼠分成以下5组（每组8只）给药，每周通过腹腔注射给药2次，连续4周，第29天（D29）试验结束。 

给药分组情况为： 

1)人源化hPV19抗体高剂量组（供试品高剂量组，10mg/kg体重）； 

2)人源化hPV19抗体中剂量组（供试品中剂量组，5mg/kg体重）； 

3)人源化hPV19抗体低剂量组（供试品低剂量组，2.5mg/kg体重)； 

4）Avastin对照组（5mg/kg体重）； 

5)生理盐水阴性对照组。 

给药期间每天2次观察动物一般临床症状、每周进行2次体重和瘤径测量，安乐死后剥取肿瘤，称量瘤重。以相对肿瘤增殖率T/C%来评价疗效，T/C%≤40%且P<0.05为有效，同时以瘤重抑制率大于60%为有效性参考指标。 

试验结果： 

1）对肿瘤生长情况的影响 

首次给药后每周2次测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积V及其相对肿瘤体积RTV。计算公式为RTV=Vt/V0,其中Vt为各时间点（天）测量得到的肿瘤体积，Vo为初始（给药前)肿瘤体积。 

各组Ls-174-T肿瘤相对体积增长趋势见图8A，结果表明与生理盐水阴性对照组相比，人源化hPV19抗体可明显抑制肿瘤的生长。 

2）对肿瘤重量的影响 

D29试验结束，动物安乐死，剥离肿瘤并称重，计算各组间平均瘤重差异： 

生理盐水阴性对照组平均瘤重2.957g。 

阿瓦斯汀Avastin组平均瘤重0.767g，显著低于阴性对照组（P≤0.01）。 

供试品（人源化hPV19抗体）低、中、高剂量组平均瘤重0.883g、0.631g、0.467g，显著低于阴性对照组（P≤0.01或P≤0.001）。 

根据各组平均瘤重计算瘤重抑制率（图8B），可见Avastin组的瘤重抑制率为74.05%，人源化hPV19抗体低、中、高剂量组的瘤重抑制率分别为70.15%、78.66%、84.21%。此结果表明各剂量组的人源化 hPV19抗体均可明显抑制肿瘤生长，且其抑制程度不亚于Avastin。 

实施例11.人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制移植人MDA-MB-231乳腺癌的生长 

步骤1：人MDA-MB-231乳腺癌模型的裸鼠移植瘤模型的建立 

建立方法基本同实施例10。 

裸鼠接种人MDA-MB-231乳腺癌细胞后观察肿瘤生长情况，待肿瘤体积为50-100mm3左右时，按瘤体积大小进行筛选，瘤体积过大及未成瘤者不予入选。筛选后随机分组给予不同剂量药物。 

步骤2：人源化PV19抗体治疗人MDA-MB-231乳腺癌 

将上述接种了人MDA-MB-231乳腺癌的裸鼠分成以下5组（每组7只）给药，每周通过腹腔注射给药2次，连续5周，第36天（D36）试验结束。 

给药分组情况为： 

1)人源化hPV19抗体高剂量组（供试品高剂量组，10mg/kg体重）； 

2)人源化hPV19抗体中剂量组（供试品中剂量组，5mg/kg体重）； 

3)人源化hPV19抗体低剂量组（供试品低剂量组，2.5mg/kg体重)； 

4）Avastin对照组（5mg/kg体重）； 

5)生理盐水阴性对照组。 

给药期间每天2次观察动物一般临床症状、每周进行2次体重和瘤径测量，安乐死后剥取肿瘤，称量瘤重。以相对肿瘤增殖率T/C%来评价疗效，T/C%≤40%且P<0.05为有效，同时以瘤重抑制率大于60%为有效性参考指标。 

试验结果： 

1）对肿瘤生长情况的影响 

首次给药后每周2次测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积V及其相对肿瘤体积RTV(Vt/V0)。各组MDA-MA-231肿瘤相对体积增长趋势见图9A，结果表明与生理盐水阴性对照组相比，人源化hPV19抗体可明显抑制肿瘤的生长。 

2）对肿瘤重量的影响 

D36试验结束，动物安乐死，剥离肿瘤并称重，计算各组间平均瘤重差异： 

阴性对照组平均瘤重0.890g。 

Avastin组平均瘤重0.543g，与阴性对照组比较差异不显著（P>0.05）。 

人源化hPV19抗体低、中、高剂量组平均瘤重0.576g、0.298g、0.357g，与阴性对照组比较差异均不显著（P>0.05）。 

根据各组平均瘤重计算瘤重抑制率（图9B），可见Avastin组的瘤重抑制率为38.99%，人源化hPV19抗体低、中、高剂量组的瘤重抑制率分别为35.20%、66.56%、59.92%。此结果表明中、高剂量组的人源化hPV19抗体均可不同程度抑制肿瘤生长，且其抑制程度高于同剂量组的Avastin。 

实施例12.人源化hPV19抗体在裸鼠体内抑制移植人A673横纹肌瘤的生长 

步骤1：人A673横纹肌瘤模型的裸鼠移植瘤模型的建立 

建立方法基本同实施例10。 

裸鼠接种人A673横纹肌瘤细胞后观察肿瘤生长情况，待肿瘤体积为50-100mm3左右时，按瘤体积大小进行筛选，瘤体积过大及未成瘤者不予入选。筛选后随机分组给予不同剂量药物。 

步骤2：人源化PV19抗体治疗人A673横纹肌瘤 

将上述接种了人A673横纹肌瘤的裸鼠分成以下6组（每组6只）给药，每周通过腹腔注射给药2次，连续3周，第22天（D22）试验结束。 

给药分组情况为： 

1)人源化hPV19抗体高剂量组（供试品高剂量组，10mg/kg体重）； 

2)人源化hPV19抗体中剂量组（供试品中剂量组，5mg/kg体重）； 

3)人源化hPV19抗体低剂量组（供试品低剂量组，2.5mg/kg体重)； 

4)人源化hPV19抗体超低剂量组（供试品超低剂量组，0.5mg/kg体重)； 

5）Avastin对照组（5mg/kg体重）； 

6)生理盐水阴性对照组。 

给药期间每天2次观察动物一般临床症状、每周进行2次体重和瘤径测量，安乐死后剥取肿瘤，称量瘤重。以相对肿瘤增殖率T/C%来评价疗效，T/C%≤40%且P<0.05为有效，同时以瘤重抑制率大于60%为有效性参考指标。 

试验结果： 

1）对肿瘤生长情况的影响 

首次给药后每周2次测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积V及其相对肿瘤体积RTV(Vt/V0)。各组A673肿瘤相对体积增长趋势见图10A，结果表明与生理盐水阴性对照组相比，人源化hPV19抗体可明显抑制肿瘤的生长。 

2）对肿瘤重量的影响 

D22试验结束，动物安乐死，剥离肿瘤并称重，计算各组间平均瘤重差异： 

阴性对照组平均瘤重8.726g。 

Avastin组平均瘤重3.323g，显著低于阴性对照组（P≤0.05）。 

人源化hPV19抗体低、中、高、超低剂量组平均瘤重3.811g、3.046g、2.499g、7.056g。与阴性对照组比较，人源化hPV19抗体低、中、高剂量组平均瘤重显著降低（P≤0.05）。 

根据各组平均瘤重计算瘤重抑制率（图10B），可见Avastin组的瘤重抑制率为61.92%，人源化hPV19抗体低、中、高、超低剂量组的瘤重抑制率分别为56.33%、65.09%、71.36%、19.13%。结果表明中、高剂量组的人源化hPV19抗体均可明显抑制肿瘤生长，且其抑制程度不亚于Avastin。 

实施例13.人源化hPV19抗体在裸鼠体内抑制移植人HCT-8结肠癌的生长 

步骤1：人HCT-8结肠癌模型的裸鼠移植瘤模型的建立 

建立方法基本同实施例10。 

裸鼠接种人HCT-8结肠癌后观察肿瘤生长情况，待肿瘤体积为50-100mm3左右时，按瘤体积大小进行筛选，瘤体积过大及未成瘤者不予入选。筛选后随机分组给予不同剂量药物。 

步骤2：人源化PV19抗体治疗人HCT-8结肠癌 

将上述接种了人HCT-8结肠癌的裸鼠分成以下7组（每组8只）给药，每周通过腹腔注射给药2次，连续4周，第30天（D30）试验结束。 

给药分组情况基本同实施例9，但增加顺铂化疗药对照组，及顺铂与hPV19抗体合并使用的联合给药组。 

给药分组情况具体如下： 

1)人源化hPV19抗体高剂量组（供试品高剂量组，10mg/kg体重）； 

2)人源化hPV19抗体中剂量组（供试品中剂量组，5mg/kg体重）； 

3)人源化hPV19抗体低剂量组（供试品低剂量组，2.5mg/kg体重)； 

4)人源化hPV19抗体超低剂量组（供试品超低剂量组，0.5mg/kg体重)； 

5）顺铂化疗对照组（5mg/kg体重）； 

6）联合给药组（供试品hPV19抗体5mg/kg+顺铂5mg/kg体重）； 

7)生理盐水阴性对照组。 

给药期间每天2次观察动物一般临床症状、每周进行2次体重和瘤径测量，安乐死后剥取肿瘤，称量瘤重。以相对肿瘤增殖率T/C%来评价疗效，T/C%≤40%且P<0.05为有效，同时以瘤重抑制率大于60%为有效性参考指标。 

试验结果： 

1）对肿瘤生长情况的影响 

首次给药后每周2次测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积V及其相对肿瘤体积RTV(Vt/V0)。 

各组HCT-8肿瘤相对体积增长趋势见图11A，结果表明与生理盐水阴性对照组相比，各剂量组的人源化hPV19抗体均可明显抑制肿瘤的生长。 

2）对肿瘤重量的影响 

D30试验结束，动物安乐死，剥离肿瘤并称重，计算各组间平均瘤重差异： 

阴性对照组组平均瘤重1.608g。 

顺铂化疗单用组平均瘤重1.201g，与阴性对照组比较差异不显著。 

hPV19单抗供试品低、中、高、超低剂量组平均瘤重0.405g、0.278g、0.311g、0.604g，显著低于阴性对照组（P≤0.01或P≤0.05）；hPV19单抗与顺铂化疗联合用药组平均瘤重0.193g，显著低于阴性对照组（P≤0.01）。 

根据各组平均瘤重计算瘤重抑制率（见图11B），可见顺铂化疗单用组的瘤重抑制率为25.29%，供试品低、中、高、超低剂量组及联合用药组的瘤重抑制率分别为74.81%、82.73%、80.65%、62.46%和87.98%。此结果表明各剂量组的人源化hPV19抗体均可明显抑制肿瘤生长；且在超低剂量（0.5mg/kg）依然有效。此外，在与顺铂化疗药合并使用治疗，其治疗效果明显优于单用5mg/kg顺铂组和单用5mg/kg hPV19单克隆抗体组。