一种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针及其构建方法和应用。本发明提供的HSV1-TK探针的制备方法，其步骤包括：（1）用限制性内切酶HindIII和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；（2）PCR扩增DnaE的C端，TK基因的C端，DEVD序列，TK基因的N端，蛋白内含子DnaE的N端；（3）通过基因重组技术将各个片段按一定顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组；（4）重组载体经过转化、提取质粒、酶切鉴定，获得HSV1-TK探针。本发明的分子影像探针可以活体监测细胞凋亡的发生发展，克服了电子显微镜或流式细胞术等技术只能在离体水平观察细胞凋亡的缺点，为活体监测提供了一个有利工具。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像 探针及其构建方法和应用。

背景技术

细胞凋亡，是生物体内一种生理性的程序性细胞死亡过程，为细胞死亡的一种特殊 方式（另一种为细胞坏死），是细胞针对所处环境因素的特定改变而产生的应答。常规 的细胞凋亡检测方法都为体外检测法，诸如电子显微镜形态学观察、DNA电泳、流式细 胞术、酶联免疫吸附法等，但这些方法自身多少都存在局限性。比如，标本处理过程复 杂，只能定性，不能定量，并且均具有创伤性，通常只能在某一特定时间点研究细胞凋 亡，不能连续动态监测凋亡在活体内的发生与发展过程。

分子成像可以无创、重复的提供活体、实时、动态、可视化的分子或基因信息，同 时进行定量研究，所获得的数据与常规研究手段所得到的数据比较，更加接近机体的真 实情况。近年来，随着分子影像技术的不断发展，人们逐渐将分子影像学应用于细胞凋 亡研究，这种方法克服了体外细胞凋亡检测方法的局限性，为活体内细胞凋亡的基础与 临床研究开创了一条全新的无创伤性研究手段。分子成像技术主要包括正电子发射计算 机断层成像（Positron Emission Tomography,PET）,单光子发射计算机断层成像（Single  Photon Emission Computed Tomography，SPECT），磁共振成像（Magnetic Resonance  Imaging，MRI），光学成像和超声分子成像等。然而，MRI和超声成像由于灵敏度较低， 光学成像由于穿透力和断层分辨率较低，其应用受到一定限制。SPECT由于具有较低分 辨率，其应用也受到一定限制。与其他分子成像技术相比，PET具有高灵敏度和断层分 辨率、标记药物半衰期短且不改变原药物的药理活性等显著优点，从而称为活体内检 测细胞凋亡的最佳技术。

单纯疱疹病毒1胸苷激酶（herpes simplex virus1-thymidinekinase,HSV1-TK）报告 基因是应用较广的PET成像的分子探针。其原理基本为，正电子核素标记的核苷类似物 如¹⁸F-9-[4-氟-3-(羟甲基)-丁基]鸟嘌呤(¹⁸F-9-[4-F-3-hydroxymethybuty]- guanine,¹⁸F-FHBG)经主动运输通过HSV1-TK转染细胞后，被该基因的编码产物胸甘激 酶（thymidine kinase，TK）磷酸化为5’-磷酸核苷，5’-磷酸核苷不能再次穿过细胞膜而 陷入被转染细胞中。因而，细胞内的放射性活度反映了TK基因的表达。因此，通过构 建HSV1-TK的分子影像探针，可以通过PET成像活体内监测细胞凋亡的发生发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的基于HSV1-TK的分子影像探针及其构 建方法，用于活体监测细胞凋亡的发生发展。

本发明的技术方案如下：

一种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针的构建方法，包括以下步骤：（1）用限 制性内切酶HindIII和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；（2）PCR扩增蛋白内含子 DnaE的C端DnaEc、TK基因的C端TKc、TK基因的N端TKn、DnaE的N端DnaEn，以及 公司化学合成DEVD序列，其序列为5’-gatgaagtcgac-3’；（3）通过基因重组技术将上述 各个片段DnaEc、TKc、DEVD、TKn、DnaEn依次与线性化的pcDNA3.1载体重组；（4） 重组载体经过转化、提取质粒、酶切鉴定，获得HSV1-TK探针。

所述的构建方法构建的检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针，其包含启动子、蛋 白内含子DnaE的C端，TK基因的C端，DEVD序列，TK基因的N端，蛋白内含子DnaE的 N端，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的HSV1-TK分子影像探针在活体监测细胞凋亡的发生发展中的应用。

该分子探针的原理如下：图1所示，在体内首先经过转录、翻译为一条线性的肽链， 然后在DnaE的作用下进行剪接从而形成一个环化的TK，这时TK的N端和C端连接 在一起，但是并没有活性。在细胞受到外界刺激引起凋亡的情况下，caspase-3酶会切割 DEVD位点从而形成一个线性的TK，但此时TK仍然没有活性。最后经过体内的蛋白 自折叠形成正确的三维结构，TK具有活性，从而能被PET成像捕捉到信号，反映体内 凋亡情况。本发明的分子影像探针可以活体监测细胞凋亡的发生发展，克服了电子显微 镜或流式细胞术等技术只能在离体水平观察细胞凋亡的缺点，为活体监测提供了一个有 利工具。

附图说明

图1为该HSV1-TK分子影像探针的工作原理图；

图2为HSV1-TK分子影像探针的构建示意图；

图3为细胞凋亡时HSV1－TK的活性测定结果；

图4为westernblot检测分子影像探针的蛋白构象结果；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1构建HSV1-TK分子影像探针，图2所示：

1.线性化载体：pcDNA3.1经过限制性内切酶HindIII和XhoI消化后，酶切产物用1 ％琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下切下目的DNA片段。目的条带用胶回收试剂盒回收纯化。

2.获得插入片段：

DEVD序列的获得：从上海生工公司利用常规化学合成方法合成DEVD序列，其序 列为5’-gatgaagtcgac-3’；

TKn和TKc序列的获得：分别PCR扩增HSV1-TK片段的N端和C端。为了降低TK在 体内的毒性，其N端前面45个氨基酸序列没有扩增，而是从第46个氨基酸开始。经过生 物信息学分析预测有3个潜在的位点，可以在此3个位点打断，从而插入DEVD序列。这 三个位点是TK的第76位、266位和276位氨基酸位点。故扩增的TKn分别是从46-76, 46-266,46-276个氨基酸；TKc分别是从77-375,267-375,277-375个氨基酸。最终得到的3 个探针分别命名为cTK76,cTK266和cTK276.

DnaEn和DnaEc序列的获得：分别PCR扩增DnaE全长片段的N端和C端。扩增DnaEc 两端的引物1引入酶切位点HindIII和BamHI，扩增DnaEn两端的引物2引入酶切位点NotI 和XhoI。扩增的程序为：在冰浴中，按以下次序将各成分加入到一无菌PCR-EP管中

调整好反应程序。置于PCR仪上，PCR反应参数为：94℃30秒；56℃30秒；72 ℃60秒，循环30次。最后72℃5分钟。

3.插入片段与载体的重组：将上述扩增得到的片段DnaEc、TKc、DEVD、TKn、 DnaEn和线性化载体pcDNA3.1混合制备成10ul的DNA溶液，然后加入等体积的10ulT4 DNA连接酶，充分混匀，16℃反应12小时。

4.转化：取10ul的重组反应液与0.1ml的大肠杆菌DH5a感受态细胞混合，冰上30分 钟，然后42度热激90秒后迅速放冰上5分钟。之后加入800ul的LB液体培养基，37度摇 床孵育1小时，然后取上述菌液涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，正面向上 放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置平皿，37度培养箱培养16小时。

5.阳性克隆鉴定：挑取单菌落进行培养，提取质粒，采用质粒小提试剂盒（OMEGA  Plasmid MiniKit）,用HindIII和XhoI双酶切并进行琼脂糖凝胶电泳。酶切鉴定为阳性的 克隆通过测序进一步验证。测序的DNA序列及对应的氨基酸序列为：

实施例2分子影像探针在细胞凋亡时活性的测定（见图3）

1.培养22B肿瘤细胞，取12孔板的培养皿，分别加入一定量3x105的22B细胞37度培 养至70％左右汇合度。

2.根据Lipofectamine2000的说明书分别加0.8ug的cTK76,cTK266和cTK276的质粒 DNA。

3.转染24小时后，往每孔细胞内加入5ug/ml的阿霉素（Dox）以诱导细胞凋亡。

4.诱导24小时后，往每孔细胞加入10uCi的放射性底物¹⁸F-FHBG,37度继续培养1 小时后，洗去培养基，然后用PBS洗3次，用0.1M的NaOH各200ml对每孔细胞进行裂解。

5.收集每孔细胞裂解液，计算其放射性活度，以％AD表示，并计算出各探针在细 胞内对¹⁸F-FHBG的相对变化值。图3A结果显示，当转染不同的探针到细胞内，24小时 后，采用5ug/ml终浓度的化疗药Dox（阿霉素）诱导细胞凋亡，24小时后收集细胞测 ¹⁸F-FHBG的放射性活度，cTK76探针的绝对放射性活度最高，cTK76的放射性活度最小。 但当其值与未加DOX药物组的值进行校正，得到每个探针的相对放射性活度（图3B）。 结果显示，cTK266探针的相对放射性活度最高，cTK276其次，cTK76最小。

实施例3细胞凋亡时分子影像探针的蛋白构象测定（图4）

1.培养22B肿瘤细胞，取6孔板的培养皿，分别往2孔中加入一定量3x106的22B细胞 37度培养至70％左右汇合度。

2.根据Lipofectamine2000的说明书加入1.6ug的cTK266质粒DNA。

3.转染24小时后，往其中一孔细胞内加入5ug/ml的阿霉素（Dox）以诱导细胞凋亡， 另一孔不加dox为对照。

4.诱导24小时后，收集细胞，用TK抗体做westernblot检测。结果可见（图4所 示），在没有dox诱导时（Dox为0），分子探针在细胞内主要为环化的TK条带（cyclic  TK），但也可以看到轻微的线性TK条带（linearTK），这是由于TK探针在细胞凋亡未 产生之前，主要以环状的蛋白结构存在体内；在细胞受到dox诱导产生凋亡后，即加dox 浓度为5ug/ml24小时后，由于caspase-3在凋亡后激活，对探针中的DEVD位点进行 了切割，导致探针中有一部分环化的条带变为线性的TK条带（linearTK），即可以看到 在dox5ug／ml时出现了2条带（cyclic TK和linear TK）。β-actin作为western blot的 内参。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。