类载脂蛋白C-I及其在制备治疗肾母细胞瘤的药物中的应用

摘要

本发明涉及一种新型的类载脂蛋白C-I及其在制备预防或治疗肾母细胞瘤的药物中的应用，本发明提供的用于预防或治疗肾母细胞瘤的药物，其有效成分是由55个氨基酸组成的单链多肽蛋白质，即类载脂蛋白C-I（SEQ ID No.1），可通过化学方法合成。实验表明，本发明的多肽蛋白质药物，通过抑制肾母细胞瘤的增殖与生长，达到治疗肾母细胞瘤的作用。本发明的多肽蛋白质药物可在治疗肾母细胞瘤中得到广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种类载脂蛋白C-I 及其在制备预防或治疗肾母细胞瘤的药物中的应用。

背景技术

肾母细胞瘤（Nephroblastoma)，又名肾胚胎细胞瘤、wilms瘤 (Wilms’Tumor,WT)，是最常见的儿童肾脏肿瘤，其发病率在小儿腹 部肿瘤中占首位。在发达国家患儿的五年生存率大约为80%，死亡率 小于5%[1]。在不发达国家中，大约有近一千万患儿死于肾母细胞瘤， 其中包括四百万新生儿[2]。肾母细胞瘤的治疗手段以手术切除为主， 辅以化疗，但这种治疗手段仍难以完全解决转移和复发的问题，且化 疗毒副反应严重，患儿难以承受。统计数据[3]表明：Ⅰ期肾母细胞瘤 8年存活率达90.5%-98.5%，Ⅱ-Ⅲ期的肾母细胞瘤患儿8年存活率为 73.4%-88.7%，而Ⅳ期肾母细胞瘤患儿的8年存活率则仅为 45.0%-57.1%。由以上数据可以看出，II期及以上肾母细胞瘤患儿的治 疗需要建立一种更高效、更安全的方法。因此，研究者一直在探索更 为有效的、可最大限度上杀伤肿瘤细胞，同时不伤及正常细胞的生物 治疗方法。

目前，肿瘤学研究的热点包括鉴定新的肿瘤标志物以提高早期诊 断水平，筛选更有效的靶向药物以及患儿的个体化治疗等，蛋白质组 学为上述研究提供了新的平台。蛋白质组技术可以从整体上，全面的、 动态的、定量的分析比较正常及病变标本中蛋白质种类和数量的改 变，有助于阐明蛋白质间的调控网络，从而有希望发现控制肿瘤进程 的关键分子，为肿瘤的诊断、分型、药物研究带来新的思路和途径[4]。

同时，多肽和蛋白质类药物是目前医药研发领域中最活跃，进展 最快的部分，是二十一世纪最有前途的产业之一。肿瘤的发生是多种 原因作用的结果，但最终都要涉及癌基因或癌蛋白的表达调控。不同 肿瘤产生时所需要的酶等调控因子不同，选择特异性肽作为肿瘤发生 时所需的调控因子等，封闭其活性位点，可防止肿瘤发生。现在已发 现很多肿瘤相关基因对肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异结合 的多肽，已成为寻找抗癌药物的新热点。日本科学家发现一种多肽聚 合物[5]，由能够与HER2蛋白特异性结合的靶向肽与lytic肽通过肽键 连接，该多肽聚合物具有高度细胞毒性作用，能够在对正常细胞无副 作用的情况下杀死乳腺癌细胞，这种方法为治疗这一死亡率很高的恶 性肿瘤开辟了新途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种在肾母细胞瘤患儿血清中低表达的新 型类载脂蛋白C-I。

本发明的另一目的是提供类载脂蛋白C-I在制备预防或治疗肾母 细胞瘤的药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种类载脂蛋白C-I，其氨基酸 序列为：1）SEQ ID No.1；或2）SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、 缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1）衍生的蛋白。

本发明还提供编码所述类载脂蛋白C-I的基因。

本发明还提供含有编码所述类载脂蛋白C-I基因的载体、转基因 细胞系和工程菌。

本发明还提供所述类载脂蛋白C-I在制备预防或治疗肾母细胞瘤 的药物中的应用。

本发明进一步提供一种用于预防或治疗肾母细胞瘤的药物，其有 效成分为类载脂蛋白C-I。

发明人在前期研究中应用蛋白质组学技术完成了肾母细胞瘤血 清和组织蛋白质标记物筛查及特异性标记物鉴定，鉴定出M/Z值为 6455.5的特异性多肽蛋白质标记物，经检测发现该特异性多肽蛋白质 标记物与载脂蛋白C-I的覆盖比达55.56%，将其命名为类载脂蛋白C-I 肽[6]，这种标记物在肾母细胞瘤患儿血清中低表达，在正常儿童血清 中高表达。发明人用蛋白质组学技术筛选肾母细胞瘤特异性多肽蛋白 质标记物类载脂蛋白C-I肽的同时，构建了肾母细胞瘤血清蛋白质指 纹图谱诊断模型[7]，肾母细胞瘤血清蛋白质指纹图谱临床分期模型 [8]，肾母细胞瘤血清蛋白质指纹图谱预后监测模型[9]，发现类载脂 蛋白C-I肽会随着病情的发展而不同，根治性手术切除肿瘤后患儿血 清中该标记物表达量接近正常儿童水平，姑息性手术切除肿瘤后患儿 血清中该标记物表达量无变化。因此，类载脂蛋白C-I肽可以作为肾 母细胞瘤血清特异性标记物，用于前期诊断肾母细胞瘤并作为肾母细 胞瘤治疗预后监测指标。

根据以上研究推测，类载脂蛋白C-I肽与肾母细胞瘤的发生发展 可能存在某种生物学关系。而多肽和蛋白质类药物是人体内源性物质 或针对生物体内调控因子研发而得，通过参与、介入、促进或抑制人 体内或细菌病毒中生理生化过程而发挥作用。相比化疗药物，多肽和 蛋白质类药物具有副作用低、药效高、针对性强，不会蓄积于体内而 引起中毒。本发明以开发一种能够治疗肾母细胞瘤的多肽蛋白质药物 为目标，对类载脂蛋白C-I肽对肾母细胞瘤生物学特性的影响进行了 进一步研究。

鉴于类载脂蛋白C-I肽在肾母细胞瘤患儿血清中的特异表达：肾 母细胞瘤患儿血清中低表达，在正常儿童血清中高表达；根治性手术 切除肿瘤后患儿血清中该标记物表达量接近正常儿童水平，姑息性手 术切除肿瘤后患儿血清中该标记物表达量无变化。本发明首先通过化 学合成方法，合成出类载脂蛋白C-I肽，由长度55个氨基酸的多肽 序列组成，通过高效液相色谱HPLC对其进行纯化，使其纯度达到 99%以上；临床手术中，完整切除III/IV期肾母细胞瘤志愿者的瘤体 后，剖开瘤体，选择生长良好的肿瘤标本，进行原代培养，培养出稳 定的细胞系以后进行鉴定为肾母细胞瘤细胞。再使用荧光标记物 FITC标记类载脂蛋白C-I肽，将标记有FITC的类载脂蛋白C-I肽与 肾母细胞瘤细胞共培养48h，在荧光显微镜下观察类载脂蛋白C-I肽 在细胞上的表达情况，结果表明该多肽蛋白质能够与肾母细胞瘤细胞 相结合（图1）。

本发明进行类载脂蛋白C-I肽干预肾母细胞瘤细胞生长的体内试 验。经类载脂蛋白C-I肽干预的肾母细胞瘤细胞列为观察组，未经类 载脂蛋白C-I肽干预的肾母细胞瘤细胞列为对照组：计算出细胞倍增 时间,绘制细胞生长曲线；经CCK8染色试剂处理后，酶标仪下获得 相关数据计算出细胞生长活性曲线和类载脂蛋白C-I肽IC₅₀\IC₈₀抑制 浓度；流式细胞仪技术检测观察组与对照组的细胞生长周期和凋亡 率。结果显示，类载脂蛋白C-I肽能够抑制肾母细胞瘤细胞的增殖。

进而本发明设计动物试验，对BALB/c裸鼠皮下种植肾母细胞瘤 细胞，成功构建荷瘤鼠后，未经干预的荷瘤裸鼠列为对照组，使用类 载脂蛋白C-I肽治疗的荷瘤裸鼠列为观察组。实验结果：观察组裸鼠 的肿瘤较对照组裸鼠的肿瘤体积明显缩小；观察组裸鼠的体重和健康 状况较对照组裸鼠的体重、健康状况和精神状态明显改善；观察组裸 鼠的肿瘤切片病理检查显示出现不同程度的凋亡坏死情况，对照组裸 鼠的肿瘤切片病理检查显示仍以活性较好的增生期肾母细胞瘤细胞 为主。以上结果表明类载脂蛋白C-I肽能够有效地治疗肾母细胞瘤， 且安全性高、副作用小、药效高。

由此，本发明提出一种治疗肾母细胞瘤的多肽蛋白质药物，其氨 基酸序列及相关信息如表1所示。

表1 类载脂蛋白C-I肽氨基酸序列及相关信息

本发明的药物形式为类载脂蛋白C-I肽氨基酸序列单链化合物， 可溶解于纯水、生理盐水或PBS缓冲液中，常温下可配制成浓度 0.1-1.0μmol/ml的试剂，体外使用剂量为0.2μmol/ml，直接加至细胞 培养体系中；体内使用剂量初步为4mg/kg，对于小鼠模型可采用腹 腔注射，尾静脉注射等方法。

本发明提供的一种用于预防或治疗肾母细胞瘤的药物，其有效成 分是由55个氨基酸组成的单链多肽蛋白质，即类载脂蛋白C-I（SEQ  ID No.1），可通过化学方法合成。实验表明，本发明的多肽蛋白质药 物，通过抑制肾母细胞瘤的增殖与生长，达到治疗肾母细胞瘤的作用。 本发明的多肽蛋白质药物可在治疗肾母细胞瘤中得到广泛应用。

附图说明

图1为本发明标记有FITC的类载脂蛋白C-I肽与肾母细胞瘤共同 培养48h后在两种显微镜下观察同一视野的结果；A.普通相差显微镜 下观察，20×10倍镜；B.荧光显微镜下观察，20×10倍镜。

图2为本发明实施例2中不同浓度梯度的类载脂蛋白C-I肽干预肾 母细胞瘤细胞生长的曲线图。

图3为本发明实施例2中不同浓度梯度的类载脂蛋白C-I肽干预肾 母细胞瘤细胞后，细胞倍增时间对比。

图4为本发明实施例3中不同浓度梯度的类载脂蛋白C-I肽对肾母 细胞瘤细胞生长的抑制。

图5为本发明实施例4中肾母细胞瘤细胞正常培养以及类载脂蛋 白C-I肽在IC₅₀、IC₈₀浓度下干预肾母细胞瘤细胞48h后，流式细胞仪检 测细胞凋亡率的结果。

图6为本发明实施例6中类载脂蛋白C-I肽腹腔注射至荷瘤小鼠模 型体内，治疗6周后解剖观察组裸鼠，测得的肿瘤直径。

图7为本发明实施例6中将生理盐水注射至荷瘤小鼠模型体内，6 周后解剖对照组裸鼠，测得的肿瘤直径。

图8为本发明实施例6中对照组与观察组裸鼠肿瘤直径对比。 p<0.05，观察组与对照组之间具有统计学意义。

图9为本发明实施例6中对照组与观察组裸鼠肿瘤体积对比。 p<0.05，观察组与对照组之间具有统计学意义。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 FOMC-保护氨基酸固相合成法合成类载脂蛋白C-I肽

本发明采用Fomc-Ser(tbu)-Wang-Resin树脂作为载体，具体合成 工艺步骤如下：1）用DCM将树脂充分溶胀后，然后用DMF清洗树 脂几遍；2）使用适当浓度的DBLK，将Fomc-保护基团脱出，使用 DMF清洗树脂数遍，洗去DBLK残余液；3）称取适合的缩合剂和活 化剂以及C端第二个Fomc-保护氨基酸（Fomc-Asp(otbu)-OH）进 行偶联，偶联完毕后使用茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全， 再使用DMF清洗几遍，洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂；4）依 类载脂蛋白C-I肽氨基酸序列将各氨基酸逐个进行偶联，重复上述步 骤2）、3）；5）将所有的氨基酸连接结束后，重复上述步骤2），脱去 最后的FOMC-保护基团；6）用切割液裂解树脂、氨基酸混合物，去 除树脂和氨基酸保护基团，得到粗品；7）质谱质谱仪检测类载脂蛋 白C-I肽粗品，确认产品正确；8）高效液相色谱分离提纯粗品类载 脂蛋白C-I肽，至纯度>99%，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2 类载脂蛋白C-I肽干预肾母细胞瘤细胞后对生长曲线和细 胞倍增时间的分析

选择对数生长期的肾母细胞瘤细胞重悬浮，分别加入数个24孔 培养板，接种密度为2×10⁴个/孔。接种1天后，取3孔细胞进行计数， 作为初始细胞数，将类载脂蛋白C-I肽按由低到高的浓度梯度加入上 述培养板每孔的细胞悬液中，被干预的细胞悬液作为观察组，未干预 的细胞悬液作为对照组。每隔24h取每种不同浓度的观察组细胞悬液 以及对照组细胞悬液各3孔，用台盼蓝染料染色，滴入细胞计数板内 在光学显微镜下进行计数，连续7天，绘制出细胞生长曲线（图2）。 根据所绘制的细胞生长曲线通过帕特森公式计算得到类载脂蛋白C-I 肽干预48h后细胞倍增时间（图3）。实验结果显示：未经干预的肾母 细胞瘤细胞数量在72小时达到5.741×10⁵个，细胞倍增时间为16.14小 时；经过药物浓度1×10^-2μmol/ml的类载脂蛋白C-I肽干预后，肾母细 胞瘤细胞数量在72小时仅达到0.65×10⁵个，倍增时间延长至66.98小 时。类载脂蛋白C-I肽对肾母细胞瘤细胞的生长增殖起到抑制作用。

实施例3 类载脂蛋白C-I肽干预肾母细胞瘤细胞后对细胞活性和半 数抑制率的分析

选择对数生长期的肾母细胞瘤细胞重悬浮，分别加入数个96孔培 养板，每孔板100μL介质，接种密度为5×10⁴个/孔。接种1天后，将 多肽蛋白质药物按0、5、10、15、20、25、30×10^-2μmol/ml的浓度分 别加入上述培养板每孔的细胞悬液中，被干预的细胞悬液作为观察 组，未干预的细胞悬液作为对照组。24h、48h和72h后，分别使用CCK8 试剂染色，2h后在酶标仪下，用450nm/630nm双波长光波检测，根据 存活细胞数，绘制出校正曲线（图4）。根据校正曲线，计算出类载脂 蛋白C-I肽在肾母细胞瘤细胞系中的24h、48h和72h半数抑制浓度 （IC₅₀）和80%抑制浓度(IC₈₀)，结果如表2所示。

表2 类载脂蛋白C-I肽在肾母细胞瘤细胞系中的24h、48h和72h 半数抑制浓度（IC₅₀）和80%抑制浓度(IC₈₀)

实施例4 类载脂蛋白C-I肽干预肾母细胞瘤细胞后流式细胞仪分析 细胞凋亡

选择对数生长期的肾母细胞瘤细胞重悬浮，分别加入数个6孔培 养板，每孔板1200μL介质，接种密度为5×10⁴个/孔。接种1天后，将 类载脂蛋白C-I肽按48h后IC₅₀和IC₈₀的浓度分别加入上述培养板的各 孔中作为观察组，无干预的孔内细胞作为对照组。48小时后，收集对 照组细胞，多肽蛋白质药物处理后的观察组细胞低温PBS冲洗2次后， 与100μL 1×结合缓冲液混合，室温下加入细胞凋亡Annexin-V/PI双染 试剂（annexin-V/PI(BD Biosciences)double staining solution）继续培养 15min。用流式细胞仪检测染色细胞并分析凋亡细胞百分比（图5）。 结果显示未经干预的和经过浓度IC₅₀、IC₈₀的类载脂蛋白C-I肽干预后 的肾母细胞瘤细胞在48小时早期凋亡率分别为8.4%、22.3%和69.6%， 由此可见类载脂蛋白C-I肽高效诱导肾母细胞瘤细胞的早期凋亡。

实施例5 类载脂蛋白C-I肽干预肾母细胞瘤细胞后采用流式细胞仪 分析细胞生长周期

选择对数生长期的肾母细胞瘤细胞重悬浮，分别加入数个6孔培 养板，每孔板1200μL介质，接种密度为5×10⁴个/孔。接种1天后，将 类载脂蛋白C-I肽按48h后IC₅₀和IC₈₀的浓度加入上述培养板作为观察 组，无干预的细胞悬液作为对照组。48小时后，收集对照组细胞，类 载脂蛋白C-I肽段处理后的观察组细胞（IC₅₀和IC₈₀），用低温PBS冲洗 2次后，加入300μL 1×结合缓冲液混匀，在室温下加入RNaseA和PI 继续培养15min。用流式细胞仪检测出生长周期及各阶段细胞百分比 （表3）。结果显示：经过浓度IC₅₀、IC₈₀的类载脂蛋白C-I肽干预后的 肾母细胞瘤细胞在G0/G1期上比未经干预的肾母细胞瘤细胞延长，证 明类载脂蛋白C-I肽能够诱导G0/G1期阻滞。

表3 经过浓度IC₅₀、IC₈₀的类载脂蛋白C-I肽干预后的肾母细胞瘤细胞在生长周 期及各阶段细胞百分比

^*表示p<0.05，IC₅₀、IC₈₀与对照组之间有统计学意义。

实施例6 动物体内模型试验验证类载脂蛋白C-I肽治疗肾母细胞瘤 疗效

采用4周龄雄性BALB/c Nude无胸腺小鼠，在标准化SPF级动物实 验室内饲养。建立稳定的12小时昼夜更替环境。所有操作均在无菌环 境下进行。所有程序均经动物伦理委员会批准。肾母细胞瘤细胞重悬 浮于1:1血清培养基和基底膜基质中，调整细胞浓度为1×10⁷个/0.2ml。 消毒裸鼠皮肤后，向左侧前肢腋窝皮下接种0.2ml细胞混合液，每3天 观测一次，持续35天。最后将裸鼠分为2组，每天向腹腔内给药，持 续6周，观察组注射剂量为4mg/Kg的类载脂蛋白C-I肽；对照组注入相 应体积生理盐水。类载脂蛋白C-I肽干预4周后，处死裸鼠，取出瘤 体测量体积、直径，根据相关数据作统计学对比（图6-9）。结果显示， 经类载脂蛋白C-I肽治疗后的肾母细胞瘤荷瘤小鼠模型肿瘤体积和直 径明显减小，由此可见，类载脂蛋白C-I肽对肾母细胞瘤能够起到有 效的治疗作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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