一种脊髓性肌萎缩症SMN基因的敲除方法及细胞模型

摘要

本发明涉及脊髓性肌萎缩症SMN基因的敲除方法及细胞模型。该模型通过如下步骤构建：（1）构建和设计敲除SMN基因的锌指核酶质粒;(2)将构建好的SMN基因ZFN敲除质粒用脂质体方法转染进哺乳动物细胞；（3）利用ZFN特异敲除位点的基因组PCR产物和DNA序列测定以检测ZFN基因敲除的有效性；（4）针对ZFN基因敲除有效的细胞，进行单克隆分离并逐一鉴定细胞敲除类型；（5）对基因敲除细胞株进行mRNA水平鉴定；（6）对基因敲除细胞株进行蛋白表达水平鉴定。本发明的脊髓性肌萎缩症病理细胞模型可用于研究SMA致病机理，也可通过检测该细胞模型中SMN复合物的蛋白表达水平对药物进行筛选。

说明书

 

技术领域

    本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种脊髓性肌萎缩症SMN基因的敲除方法及细胞模型。

 

背景技术

脊髓性肌肉萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一种常染色体隐形遗传的神经肌肉疾病，病理特征显示为脊髓前角运动神经元变性，患者肢体近端和躯干肌肉无力和萎缩，最终导致呼吸衰竭甚至死亡。其在活产婴儿中发病率为1/6000~1/10000,人群携带率为1/40~1/60，居致死性常染色体隐形遗传病的第二位，仅次于囊性纤维化。该病的发生，给患者带来巨大的的身心痛苦，同时也给家庭带来沉重的负担。

随着分子生物学和遗传学的发展，现在研究发现：运动神经元存活（SMN）基因是SMA的主要致病基因。该基因定位于5q11.2-13.3。人类染色体组中SMN基因有多个拷贝：一个SMN1（位于端粒侧SMN）和多个SMN2（着丝粒侧SMN）。SMN1基因的全长转录本fl-SMN可以编码一种含有294个氨基酸的功能稳定的全长蛋白质（SMN蛋白）。而SMN2较SMN1对比来看编码区存在着一个单碱基的(840C→T)的变化，这一改变导致细胞剪切机制的选择性的跳跃形成的转录本缺失7号外显子，形成一个截短的mRNA异构体“Δ7SMN”，编码不具有生物功能并迅速降解的“截短蛋白质”，只有10%-20%的 SMN2前mRNA发生正常剪切表达SMN(SMN-fl)蛋白，此为SMN2的补偿作用。目前认为，SMN1基因改变导致SMN蛋白水平下调是引起SMA发病的根本原因，SMN2被普遍认为是SMA的修饰基因，其拷贝数和剪接效率则与疾病的严重程度相关。约95%的患者为SMN1纯合缺失或SMN1转化为SMN2导致SMN1缺失。

针对SMN1基因缺失后为何导致脊髓前角ɑ运动神经元变性而患SMA疾病，目前机制尚不明确。而SMA转基因模型制作迄今技术不成熟且花费巨大。因此，若能应用基因敲除技术特异性敲除SMN1基因，体外构建SMA病理细胞模型，则能为SMA病因及发病机制的深入研究及高通量筛选治疗SMA药物提供新的平台。

锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)是近年来兴起的一种基因敲除技术，其为一种人工改造的核酸内切酶，由一个人工锌指DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，锌指结构能特异性地结合DNA序列，每个锌指识别三个连续的DNA碱基，非特异性核酸内切酶行使剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI羧基端96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时(6~8 bp)，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，从而达到 DNA 靶向切割目的。针对靶序列设计8~10个锌指结构域，将这些锌结构域连在DNA核酸酶上，便可实现靶序列的双链断裂(Double strand break, DSB)。当两个ZFN切割靶位点，制造出双链断裂以后，细胞的修复机制被激活，包括同源重组修复和非同源末端连接(Non-homologous end-joining, NHEJ)。如果DNA修复是非同源的末端连接，将会有大约70%的概率通过随机删减或添加可以引起移码突变的碱基，或无义突变引起蛋白质长度变化，从而导致基因敲除。到目前为止，从包括中国专利在内的有关资料检索表明，利用ZFNs技术敲除SMN基因，建立SMA疾病的细胞模型，尚未见到相关报道。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于将脊髓性肌萎缩症SMN基因敲除的锌指核酸酶，及其质粒载体，以及所得到的细胞模型。本发明应用ZFN技术敲除SMN基因，采用脂质体转染方法，实现了建立脊髓性肌萎缩症（SMA）疾病的细胞模型，可以应用在脊髓性肌萎缩症致病机理的研究中，同时也为抗脊髓性肌萎缩症药物的高通量筛选提供细胞模型。

本发明提供了一种用于SMN基因敲除的表达锌指核酸酶的质粒载体，是指分别插入有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示碱基序列的质粒。

进一步地，所述的质粒是指pAVX。

进一步地，所述的碱基序列的下游还连接有FokI碱基序列。

另一方面，本发明提供了上述的质粒载体在哺乳动物细胞中表达出的锌指核酸酶。

另一方面，本发明提供了一种用于SMN基因敲除方法，包括如下步骤：将上述质粒载体转染哺乳动物细胞中，对SMN基因进行PCR扩增，再对扩增产物测序检测SMN基因发生敲除的细胞。

所述的哺乳动物细胞为Hela、K562、HEK293、A549、MCF-7或者LNCap中的任一种。

所述的基因敲除方法中，是采用脂质体Lipofectamine2000试剂进行转染。

另一方面，本发明提供了通过上述SMN基因敲除方法所制备得到的SMN基因被敲除的SMA病理细胞模型。

进一步地，上述的细胞模型是指SMN1基因纯合缺失、SMN2基因杂合缺失的哺乳动物细胞。

 

有益效果

本发明建立的脊髓性肌萎缩症（SMA）细胞模型，对于研究SMN基因在SMA疾病发病的作用机制提供了有力的工具，通过以此细胞模型为介导，进而进行相关小分子化合物和基因工程重组蛋白筛选，获得可显著增加SMN蛋白表达量的小分子化合物和基因工程重组蛋白质类药物。筛选方法简单，成本低廉，具有良好的稳定性和可靠性。

 

附图说明

图1是用于表达锌指核酸酶的质粒载体的图谱。

图2是转染后的细胞进行PCR扩增后的产物电泳图。

图3是转染后的细胞进行PCR扩增后的产物测序图谱，测序峰图在ZFN切割位点附近产生套峰。

图4是实施例1中得到的Hela细胞株HS-66和HS-1-7 WB检测结果。

图5是实施例4中Hela、HS-66和HS-1-7细胞株的SMN复合物核内聚点标记试验的细胞荧光图。

 

具体实施方式

 

下面对本发明的实施例结合附图作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下实施，给出了具体实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。凡依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

主要试剂及检测试剂盒：Hela细胞，ZFN敲除SMN基因质粒，购自sigma公司；转染试剂lipofectin2000购自Invitrogen公司；DMEM.胎牛血清FBS购自Hyclone公司；总RNA提取试剂Trizol为Invitrogen产品；兔抗SMN（H-195）单克隆抗体为美国santa cruz公司产品，二抗Anti-Rabbit IgG为美国GE公司产品；逆转录试剂盒购自天根生化科技有限公司 其他试剂菌为进口和国产分析纯试剂。实施例中，酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

 

实施例1 SMN基因的敲除

一、SMN基因ZFN质粒敲除设计与构建

根据ZFN技术原理，设计DNA靶向识别位点。该位点设计在SMN1.SMN2转录本共有第一外显子处，经过大量反复试验，确定的靶序列信息为：

TCCGTGCTGTTCCGGCGCggcacAGGCCAGGTGAGGTCGCA(SEQ ID NO.1)。两端划线部分为ZFN结合区，中间小写字母为ZFN切割区。其质粒构建由美国Sigma公司完成和鉴定。其ZFN质粒具体信息如图1所示。

所述人工锌指核酸酶表达载体的具体构建方法，表达载体骨架为pAVX(Sigma) 该载体含有pUC oir启动该质粒在原核细胞中的复制，具有卡那霉素抗性基因；在多克隆位点上游含有一个广谱启动子CMV序列，能使克隆到该多克隆位点基因高效表达。利用体外化学合成的方法构建锌指蛋白表达元件(EcoRI-Triple Flag-NLS-ZFP1-BamHI和EcoRI-Triple Flag-NLS-ZFP2-BamHI)，表达元件的整体序列分别如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示，合成的锌指蛋白表达元件两侧分别含有EcoRI和BamHI酶切位点，可以利用EcoRI和BamHI酶切位点分别将锌指蛋白表达域(ZFP1和ZFP2)克隆到载体pAVX的多克隆位点上；NLS是为核定位信号，可以引导重组ZFP进入核区；Triple Flag用于重组蛋白表达的WB检测中，这两种元件中的ZFP1和ZFP2域是用于表达锌指蛋白，分别与靶序列的左臂和右臂结合。同样，再在体外合成BamHI-FokI-XhaI基因，利用BamHI和XhaI酶切位点将FokI内切核酸酶表达元件克隆到该载体上ZFP元件的下游位置，这样将锌指蛋白DNA结合域以及FokI DNA切割域相互结合，构成了一个嵌合的限制性核酸内切酶。以此得到两种质粒，分别用于表达结合在靶序列的左臂和右臂的锌指蛋白酶，可以将靶序列敲除。

将鉴定好的ZFN敲除质粒扩增培养，提取质粒，纯度要求达到OD260/280=1.8~2.0以备转染。

 

二、 SMN基因ZFN敲除质粒转染

(1) 接种细胞。转染前一天将Hela细胞接种至六孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定，一般为1×10⁶个细胞。转染时要求细胞汇合度为80～90%。 

(2) 将分别取实施例1中得到的ZFN左臂和右臂的质粒载体DNA 3μg加至OPTI-MEM培养基使其终体积为250μl，混匀，得到DNA悬液。

(3) 将Lipofectamine2000放置于4℃冰盒架子或者冰上，使用前低转速离心，取10μl的Lipofectamine2000加至另外240μl 的OPTI-MEM中，轻轻混匀，此步骤操作要迅速以免脂质体在室温下暴露时间过长影响后面转染效率，而后将混合物室温静置5分钟。

(4) 将DNA悬液（250μl ）和Lipofectamine2000(250μl)悬液混合，总体积500μl，轻轻混匀，室温静置20分钟。

(5) 将DNA和Lipofectamine2000混合液加至六孔板的孔内，前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养。

(6）转染4～6小时后细胞换液，换成含抗生素正常培养基，六孔板容量每孔2ml培养基。

(7) 转染细胞48～72h后，收集5/6的细胞，用于基因敲除验证的基因组提取。剩余部分直接分散为细胞悬液，分入96孔板中分离单克隆。

 

三、 ZFN敲除SMN基因有效性的检测

针对ZFN特异敲除位点上下游设计引物，其序列为：

SMN Knockout-F：5’ -GGGCGATAACCACTCGTAGA-3’(SEQ ID NO.4)

SMN Knockout-R：5’-AAGACGTAGAAAAACGCGGA-3’ (SEQ ID NO.5)

收集转染48～72小时的Hela细胞：提取全基因组，步骤如下：

（1）将细胞转移到1.5ml EP管中，加入20 μl蛋白酶K和220 μl裂解液QS。 65℃温浴10-15min。溶液应呈黑色。简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（2）加入220 μl无水乙醇，上下来回颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀，将溶液及絮状沉全部淀转移到纯化柱中。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

（3） 加入500 μl去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

（4） 加入500 μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

（5） 加入500 μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

（6） 12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

（7）将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30～100 μl纯化液TE。室温放置2min。

（8）12,000 rpm离心2min，管底即为细胞基因组DNA。-20℃保存。

   提取到的转染细胞基因组，使用SMN Knockout-F和 SMN Knockout-R引物进行PCR，其扩增条件为：

94℃ 5min；

94℃ 45s，54℃ 30s，72℃  45s，（30～35个循环）；

72℃ 5min。

1%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统检测，PCR扩增ZFN作用靶位点片段长度为367 bp，如附图2所示，经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段连接T载体，转化感受态细胞E.coli.DH5α12 h后测定靶DNA序列以统计PCR产物片段中的突变比例和突变类型。如附图3所示，片段测序出现套峰，认为ZFN在此过程中对靶基因产生切割作用，说明在靶向敲出区域存在着敲出后的移码突变修复。

再通过有限稀释法进行单克隆分离。

 

四、鉴定单克隆SMN基因敲除的突变类型

培养于96孔板中的细胞克隆长至80～90%汇合度时，消化、收集细胞后一部分冻存，提取其余细胞的基因组DNA，共选用17个细胞株，通过PCR扩增ZFNs作用靶位点上下游367bp，判断单克隆在基因组水平上经ZFN作用后的改变，并进行T-A克隆后通过DNA测序鉴定敲除区域是否有细胞修复机制对DSB双链断裂产生的插入和缺失。

本实施例中，在采用的17株单克隆细胞中，经单克隆PCR片段的测序检测，证实有5株存在SMN基因突变的细胞。

 

实施例2 SMN基因敲除细胞株mRNA表达鉴定

对于鉴定SMN敲除有效的细胞，提取RNA，方法参见Trizol试剂盒说明书，总RNA提取后，用无RNAase活性的DNase消化以去除痕量基因组DNA，经紫外分光光度计测定RNA含量，电泳检测确定RNA质量；cDNA的合成按照Tiangen公司的逆转录试剂盒说明书进行。针对SMN1 、SMN2第七个外显子中的（C →T）不同设计引物，以SMN1、SMN2不相同的转录本为模板进行RT-PCR根据半定量的情况初步确定SMN1 、SMN2缺失情况。

然而我们发现外显子上的碱基缺失和碱基的插入并没有影响SMN1 、SMN2所转录的RNA 的稳定性。通过这一结论我们又在SMN1和SMN2都具有的全长转录本transcript variant d、transcript variant b进行设计引物，其序列为

SMN cDNAbd-F：5’-GAAGTTACTACAAGCGGTCCTC-3’(SEQ ID NO.6)

SMN cDNAbd-R：5’-GCTCTATGCCAGCATTTCTCCT-3’(SEQ ID NO.7)

RT-PCR后进行T-A克隆，测序后利用第七个外显子（C →T）的点突变以区别SMN1 、SMN2 突变情况。根据这种方式我们得到了两株SMN1-/- SMN2+/- 基因型的HeLa细胞株。称之为HS-66和HS-1-7。

例如：HS-66细胞的突变情况如下：

野生型的SMN1位点的部分序列是：

AGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAG[GAGGATTCCGTGCTGTTCCGGCGCGGCACAGGCCA]GAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGC

在HS-66细胞的SMN1的位点上缺少上述括号[]中的序列段，共35个bp，同时在缺失的位置处插入了103个bp的插入段。

AGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAG::::::::::(-35)::::::::::::GAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAG；

插入段是：

ACAACTCCAGTGAGCGGATCGACTTGATGCTGTCCCGAGGCTGCGGAAGGAGAGTTGGGCCGGAAGAAGGGTGCTGAGAGCGCTAATAGGGAGACTGCACTGG

在HS-66细胞的SMN1的另一个等位基因上，存在有4个bp的缺失，序列是：

GGATTCCGTGCTGTTCCGGCGCG::(-4)::AGGCCAGAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGCA

野生型的SMN2位点的部分序列是：

AGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAG[GAGGATTCCGTGCTGTTCCGGCGCGGCACAGGCCA]GAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGC

在HS-66细胞的SMN2的位点上缺少上述括号[]中的序列段，共35个bp，同时在缺失的位置处插入了103个bp的插入段。

AGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAG:::::::::(-35):::::::::GAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAG

插入段是：

ACAACTCCAGTGAGCGGATCGACTTGATGCTGTCCCGAGGCTGCGGAAGGAGAGTTGGGCCGGAAGAAGGGTGCTGAGAGCGCTAATAGGGAGACTGCACTGG

在SMN2的另一个等位基因上，未发现有突变的情况发生。

 

实施例3 Western blot检测SMN蛋白表达

 对于得到的两株SMN1-/- SMN2+/- 基因型Hela细胞株HS-66和HS-1-7待其在60mm细胞培养皿中长至80～90%时，胰酶消化，裂解细胞，提取蛋白，用酶标仪测定蛋白浓度，取45ug上样SDS-PAGE电泳，用10%分离胶，5%浓缩胶，PVDF膜湿转，转膜时间1h,兔抗SMN Antibody单抗孵育1h，Goat-Anti-rabbit二抗孵育1h,ECL荧光检测，显影定影并拍照。如附图4所示，跟正常HeLa细胞比较其SMN基因敲除细胞表达SMN蛋白的量明显降低。

 

实施例4 细胞中SMN复合物核内聚点检测

采用实施例2中得到的HS-66和HS-1-7细胞株，以Gemin3为SMN蛋白复合物细胞核内聚点标记物，如图5所示，第1列为DAPI 细胞核染色，第2列gemin3 染色，第3列为叠图，即双染染色全图。可以看出，在第一排的Hela细胞中，SMN复合物聚点数正常，而在敲除细胞株HS66和HS-1-7中，核内聚点数大大下降甚至消失不见，与病理特征相同。

                         SEQUENCE LISTING

<110>  江苏雄鸣医药科技有限公司

 <120>  一种脊髓性肌萎缩症基因的敲除方法及细胞模型

<130> 

<160>  7    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  41

<212>  DNA

<213>  smn片段

<400>  1

tccgtgctgt tccggcgcgg cacaggccag gtgaggtcgc a                           41

<210>  2

<211>  731

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

gaattcgcct agagatctgg cggcggagag ggcagaggaa gtcttctaac ctgcggtgac       60

gtggaggaga atcccggccc taggaccatg gactacaaag accatgacgg tgattataaa      120

gatcatgaca tcgattacaa ggatgacgat gacaagatgg cccccaagaa gaagaggaag      180

gtcggcattc atggggtacc cgccgctatg gctgagaggc ccttccagtg tcgaatctgc      240

atgcgtaact tcagtcagtc cggcgacctg acccgccaca tccgcaccca caccggcgag      300

aagccttttg cctgtgacat ttgtgggagg aaatttgccg acaccggcgc ccgcctgaag      360

cataccaaga tacacacggg cagccaaaag cccttccagt gtcgaatctg catgcgtaac      420

ttcagtcgct ccgccaacct ggcccgccac atccgcaccc acaccggcga gaagcctttt      480

gcctgtgaca tttgtgggag gaaatttgcc acctccggcc acctgtcccg ccataccaag      540

atacacacgg gatctcagaa gcccttccag tgtcgaatct gcatgcgtaa cttcagtcag      600

tccggcgacc tgacccgcca catccgcacc cacaccggcg agaagccttt ttgcctgtga      660

catttgtggg aggaaaattt gcccgccgcc agcacctgga cgcccatacc aagatacacc      720

tgcggggatc c                                                           731

<210>  3

<211>  651

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

gaattcgcca tggactacaa agaccatgac ggtgattata aagatcatga catcgattac       60

aaggatgacg atgacaagat ggcccccaag aagaagagga aggtcggcat ccacggggta      120

cccgccgcta tggctgagag gcccttccag tgtcgaatct gcatgcgtaa cttcagtcag      180

tccggccacc tggcccgcca catccgcacc cacaccggcg agaagccttt tgcctgtgac      240

atttgtggga ggaaatttgc cgactcctcc aaccgcgagg cccataccaa gatacacacg      300

ggcagccaaa agcccttcca gtgtcgaatc tgcatgcgta acttcagtcg ctccgacaac      360

ctgtccgtgc acatccgcac ccacaccggc gagaagcctt ttgcctgtga catttgtggg      420

aggaaatttg cccagtcctc cgacctgcgc cgccatacca agatacacac gggatctcag      480

aagcccttcc agtgtcgaat ctgcatgcgt aacttcagtc gtagtgacac cctgagccag      540

cacatccgca cccacacagg cgagaagcct tttgcctgtg acatttgtgg gaggaaattt      600

gcccacaaca gccaccgcac aaagcatacc aagatacacc tgcggggatc c               651

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

gggcgataac cactcgtaga                                                   20

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

aagacgtaga aaaacgcgga                                                   20

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

gaagttacta caagcggtcc tc                                                22

<210>  7

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

gctctatgcc agcatttctc ct                                                22