平邑甜茶无融合生殖MhSERK4基因植物表达载体构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种平邑甜茶无融合生殖MhSERK4基因植物表达载体构建方法与应用，本发明所构建的表达载体pBI121-MhSERK4是由MhSERK4基因插入到PGM-T，经XbaI和SmaI双酶切后连接到pBI121的XbaI和SmaI位点得到的重组质粒。该植物表达载体用于植物遗传转化，MhSERK4在CaMV35S启动子的启动下表达，对植物的生殖发育过程产生调控作用，使植物不经过生殖细胞的融合可以正常产生种子，达到无融合生殖的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因表达载体和构建方法及应用。 

背景技术

无融合生殖是发育生物学领域的重要科学问题。与有性生殖获得的种子相比，无融合生殖后代的遗传背景与母本一致，不发生性状分离，在植物育种中，无融合生殖可以固定杂种优势；对于一些无性繁殖的植物，无融合生殖产生无性种子可以克服无性繁殖的不便，避免长期营养繁殖造成的亲本退化；因此，有关植物生殖机理方面的研究一直是生命科学研究领域的热点之一。 

平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.var.pingyiensis Jiang)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)湖北海棠(Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.)的一个变种，也是典型的无融合生殖型三倍体植物。主产于山东省平邑县蒙山白云岩和恶峪一带，小叶呈红色，似茶叶故称平邑甜茶。平邑甜茶是苹果的优良砧木之一，也是我国特有的植物资源，其耐涝性和耐盐性较强，在生产上具有重要的应用价值。同时，平邑甜茶具有高度的无融合生殖能力，与西府海棠、山定子等其它苹果砧木相比，其实生苗整齐一致，个体差异小，遗传稳定，因此，平邑甜茶是无融合生殖型矮化砧木育种的重要母本材料。多年来，平邑甜茶的相关研究主要集中在遗传育种、胚胎发育、抗性等方面；随着分子生物学的发展，在基因克隆、功能鉴定以及生理功能等方面开展了无融合生殖分子机理和遗传机理方面的研究，并通过基因工程方法对其生殖机理和功能进一步加以验证。 

近年来，对植物体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶(Somatic embryogenesis receptor-like kinases,SERKs)类基因的研究表明：在植物的生长发育过程中，SERK基因及其家族成员在小孢子发育、体胚发生、激素感应、无融合生殖及抗病抗逆反应中都具有一定的功能。课题组在前期研究过程中，在平邑甜茶子房中已分离 获得无融合生殖相关MhSERK4基因片段，该序列经NCBI数据库Blast比对，预测为体胚发生类受体蛋白激酶基因(本发明将其命名为MhSERK4)片段，而MhSERK4基因的功能是什么，是否可以使普通植物也具有无融合生殖特性，于是本发明将通过MhSERK4基因植物表达载体构建与遗传转化，希望获得该基因的具体功能，以便能够通过基因工程手段获得更好的品种。 

对于苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因，目前还未见其载体构建及其基因功能的报道，而本发明经实验验证，该基因在植物无融合生殖过程中可以使植物不经过两性生殖细胞的融合产生可育的种子，可以为深入研究无融合生殖的遗传机制和分子机理奠定基础。 

发明内容

本发明的目的在于为苹果属平邑甜茶无融合生殖基因调控途径的完善，提供一个新的平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因。 

本发明的另一目的在于提供该苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因的植物表达载体pBI121-MhSERK4。 

本发明的第三个目的在于提供平邑甜茶无融合生殖基因MhSERK4的重组植物表达载体pBI121-MhSERK4的构建方法。 

本发明提供的平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该基因全长1836bp。 

本发明提供的苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因的植物表达载体pBI121-MhSERK4，其由无融合生殖相关基因MhSERK4开放阅读框序列与植物表达载体pBI121构成。 

本发明提供的平邑甜茶无融合生殖基因MhSERK4的重组植物表达载体pBI121-MhSERK4的构建方法包括如下步骤： 

1）MhSERK4基因全长序列扩增 

提取平邑甜茶发育时期的子房总RNA，然后反转录获得cDNA第一链；设计引物扩增MhSERK4基因： 

上游引物S1：5’-ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3’ 

下游引物S2：5’-TCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3’ 

以反转录获得cDNA为模板，进行PCR扩增，产物连接到PGM-T载体，转化 TOP10感受态细胞，筛选并测序获得MhSERK4基因全长序列。 

2）植物表达载体pBI121-MhSERK4的构建 

根据MhSERK4的开放阅读框序列设计一对引物，并分别引入酶切位点XbaI和SmaI序列： 

上游引物MhSERK4-XbaI：5’-GGTCTAGAATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3’ 

下游引物MhSERK4-SmaI：5’-ACCCCGGGTCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3’ 

再以步骤（1）中的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，产物连接到PGM-T载体得到重组质粒PGM-T-MhSERK4，转化TOP10感受态细胞；提取质粒PGM-T-MhSERK4和pBI121，并用XbaI和SmaI双酶切后进行连接，转化，筛选并测序验证，植物表达载体pBI121-MhSERK4构建成功。 

本发明提供平邑甜茶无融合生殖MhSERK4基因在普通植物中的应用。 

本发明根据已获得的平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因，通过构建MhSERK4基因植物表达载体，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制无融合生殖新品种，提高无融合生殖能力，应用于植物品种遗传改良。 

附图说明

图1:MhSERK4琼脂糖凝胶电泳分析； 

M：Marker;MhSERK4基因cDNA全长序列 

图2:pGM-MhSERK4质粒XbaI和SmaI双酶切； 

M：左1kb，右100bp DNAmarker；泳道1-4：pBI121表达载体；泳道5-12：平邑甜茶 

图3:pBI121-MhSERK4表达载体PCR菌液鉴定结果检测图； 

M：DL2000DNAmarker；泳道1：阴性对照泳道2-5：平邑甜茶 

图4:植物表达载体pBI121-MhSERK4构建方法示意图； 

图5:转基因烟草植株与对照植株比较； 

图6:PCR鉴定烟草转基因植株MhSERK4基因表达； 

M：100bp Marker；泳道：1清水，2未转化对照植株，3质粒阳性对照；A：4-9是MhSERK4转化烟草植株 

具体实施方式

实施例1：平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因的克隆： 

1、总RNA的提取及反转录成cDNA： 

（1）总RNA的提取使用TIANGEN生化科技公司的RNAprep pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）获得，具体操作见试剂盒说明书。 

（2）反转录cDNA的合成利用宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用。 

2.利用Primer Primer5.0软件分析设计引物扩增MhSERK4； 

上游引物S1：5’-ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3’ 

下游引物S2：5’-TCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3’ 

以提取的子房cDNA为模板，进行PCR反应。 

反应体系：25μL体系，取1μL cDNA加入Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR Buffer2.5μL，dNTPs(2.5mmol·L^-1)2.0μL，正反向引物各1μL，最后用ddH₂O补足至25μL； 

反应程序：95℃5min；94℃40s，58℃40s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min； 

凝胶电泳：将PCR扩增产物经浓度为1%琼脂糖凝胶电泳发现特异条带，如图2所示，M为200bp Marker；1为扩增条带，可见在1800bp左右有一条特异条带。克隆、测序：使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将回收产物连接至pGM-T载体，然后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10（TIANGEN），经PCR筛选，将重组阳性质粒送至北京华大基因科技公司测序；经测序后结果说明成功获得MhSERK4基因序列。该MhSERK4基因的核苷酸序列为： 

MhSERK4(1836bp) 

5’-ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTCCGTCTGGCTGATTCTGCTGTTTGGCTTCTTTCACCTCCATAAGCTCGCTGCCAACGTCGAAGGTGACGCATTGAACGCGTTGAAGACCAATCTAGCTGATCCAAATAATGTTCTGCAGAGTTGGGATCCGACTCTCGTCAATCCCTGCACCTGGTTTCATGTCACTTGTAATAGCGAAAACAGCGTTACTCGAGTTGATCTTGGCAATGCCAATCTCTCTGGTCAATTGGTTGCACAGCTTGGTGTGCTTTCCAAGTTGCAGTACTTGGAACTTTACAGTAATAACATAACTGGAACCATTCCCGAAGAGCTTGGGGGTTTGGCAGACTTGGTCAGTTTGGATCTTTACTTGAACAAGTTACATGGTAACATTC CAGCGGCACTTGGCAACCTTGCAAAACTACGTTTCCTGCGTCTCAACAACAACACCTTGTCAGGGACTATTCCCTTGACTTTGACTAACATCCAATCATTGCAAGTCCTGGATCTTTCAAATAACAATCAGACAGGGGATATTCCAGTCAATGGATCTTTTTCACTTTTTACTCCCATCAGTTTTGCCAATAATCCTCTGAAACCACTTCCACCCTCTCCACCTCCTCCTGTTTCTCCGAACCCACCAAGTTCTCCAGGTACCACTGCTACTGGGGCTATTGCTGGAGGGGTTGCTGCTGGTGCTGCTTTGCTATTTGCTGCACCTGCAATTGCCCTTGCTTATTGGCGACGAAGAAAACCACAGGATCATTTCTTTGATGTACCTGCTGAGGAGGATCCAGAAGTTCATTTAGGACAGCTCAAAAGGTTTTCTTTGCGCGAACTACAAGTTGCAACGGATACCTTTAGTAACAAAAATATTCTTGGTAGAGGTGGATTTGGTAAGGTTTATAAAGGACGCTTAGCTGATGGAACTCTGGTTGCTGTAAAAAGACTTAAAGAGGAGAGAACCCAAGGTGGGGAGCTACAGTTTCAAACAGAGGTTGAAATGATTAGCATGGCTGTCCACCGCAATCTGCTTCGTCTGCGTGGTTTTTGCATGACACCAACAGAAAGGCTGCTTGTATATCCTTATATGTCTAATGGAAGTGTGGCATCATGTTTAAGAGATCGTCCAGAAGGACAACCTGCACTTGATTGGCCAATAGGACAACGCATTGCGTTGGGATCTGCAAGAGGCCTTGCTTATTTACATGATCACTGTGATCCAAAAATTATTCACCGTGATGTGAAAGCAGCAAACATATTGTTGGATGAGGAATTCGAAGCAGTTGTTGGAGACTTTGGGTTGGCTAAACTCATGGACTACAAGGATACACATGTTACCACAGCTGTACGTGGCACAATTGGTCATATAGCACCAGAGTACCTTTCAACTGGAAAATCTTCCGAGAAAACTGATGTTTTTGGATACGGAGTCATGCTTCTTGAACTCATCACTGGGCAGAGGGCTTTTGATCTTGCTCGGCTTGCGAATGATGATGATGTCATGTTACTTGATTGGGTCAAAGGACTACTGAAAGATCGGAAGTTGGAAACACTTGTTGATGCTGATCTGAATGGAAATTATGTTGACGATCAAGTGGAGCAGCTCATCCAAGTAGCTCTACTGTGCACACAAGGCACCCCAGGGGAACGACCCAAGATGTCAGAGGTTGTCCGGATGCTGGAAGGCGATGGTTTGGCTGAAAGATGGGAGGAGTGGCAAAAGGAGGAGGTGTTCCGCCAAGATTTCAACCCTATTCATCATCCAAGTACTACTTGGATCATAGACTCCACTTCTCATATTCCTCCGGATGAGTTGTCCGGTCCTAGATGA-3’。 

实施例2：苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因的重组植物表达载体pBI121-MhSERK4的构建 

1主要试剂：质粒提取试剂盒购自TIANGEN生化科技有限公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶XbaI和SmaI购自大连宝生物工程有限公司；含质粒pBI121的菌种由沈阳沈阳农业大学园艺学院提供。 

2重组植物表达载体pBI121-MhSERK4的构建 

2.1引物设计：根据目的基因MhSERK4开放阅读框序列设计上下游引物，分别引入XbaI（TCTAGA）和SmaI（CCCGGG）酶切位点，引物为： 

上游引物MhSERK4-XbaI：5’-GTCTAGAATGACGTCTTCCACCTCTGTTTC-3’ 

下游引物MhSERK4-SmaI：5’-CCCGGGTCATCTAGGACCGGACAACTCAT-3’ 

2.2PCR扩增：以实验例1中的cDNA第一链为模板，引物MhSERK4-XbaI和MhSERK4-SmaI做PCR扩增：体系为25μL：取1μL cDNA加入Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR Buffer2.5μL，dNTPs(2.5mmol·L^-1)2.0μL，正反向引物各1μL，最后用ddH₂O补足到25μL；反应程序：95℃5min；94℃40s，58℃40s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min； 

2.3电泳：将2.2扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳发现特异条带，与预期结果相符。 

2.4TA克隆机票的重组载体PGM-T-MhSERK4：将2.2中PCR产物电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至PGM-T载体得到重组载体PGM-T-MhSERK4，然后转化TOP10感受态细胞，经PCR筛选，将含有重组载体PGM-T-MhSERK4的阳性菌液送至北京华大生物科技有限公司测序； 

2.5测序结果：与预期结果完全一致。 

2.6重组植物表达载体pBI121-MhSERK4的构建：将2.4含重组载体PGM-T-MhSERK4的阳性菌液进行培养，并采取普通质粒提取试剂盒的方法提取菌液中的重组质粒PGM-T-MhSERK4；将含有植物表达质粒pBI121的菌种扩大培养，用同样的方法提取质粒pBI121，将提取的PGM-T-MhSERK4质粒和pBI121质粒分别用XbaI和SmaI限制性内切酶双酶切，酶切后电泳，并切下PGM-T-MhSERK4质粒的小片段和pBI121质粒的大片段，利用胶回收试剂盒进行回收。然后用NEB生物公司生产的T4DNA连接酶连接小片段和大片段（连接体系为：小片段2.7μL，大片段7μL，T4DNA连接酶1μL，10×Buffer1.5_μL，ddH₂O不足至15μL）过夜连接，然后利用热激法转化大肠杆菌TOP10；PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组表达载体pBI121-MhSERK4及含该重组表达载体的大肠杆菌。 

2.7pBI121-MhSERK4重组质粒转化农杆菌：从2.6中含pBI121-MhSERK4载体的菌株中提取重组质粒，用冷激法转化农杆菌EHA105，转化方法为：①去 10μL质粒DNA，加入30-100μL农杆菌感受态细胞EHA105，充分混匀，冰浴5min，转入液氮冷冻1min；②迅速转入37℃水浴5min后，加入800μLYEP液体培养基（称取胰蛋白胨1g，酵母浸粉1g，NaCI0.5g，融解于100mL无菌水中，经高温高压灭菌备用；下同）；③28℃，150rpm预培养4-5h，然后涂布于含有Kan（50mg.L^-1）、Rif（50mg.L^-1）的YEP固体平板上，28℃恒温箱中培养48h后可出现菌落；④挑取菌体做PCR鉴定，确定正确后保存于-70℃，即为植物遗传转化的工程菌株。 

实施例3：植物表达载体pBI121-MhSERK4的遗传转化 

1普通烟草的培养：普通烟草种子经过浓度70%酒精消毒30s,然后用浓度为0.1%的HgCI2消毒8-10min，用无菌水清洗5-7遍后接种于MS培养基上，20-30天后种子萌发长出幼嫩叶片，备用。 

2农杆菌侵染实验 

①将培养15-20d的普通烟草组培苗取出，剪取烟草新萌发的幼嫩叶片，去除叶脉，剪成0.5×0.5cm叶片置于悬浮培养液中侵染备用； 

②将实施例2步骤2.7中制备好的已转化含有重组质粒的pBI121-MhSERK4的农杆菌EHA105菌液扩大培养，放入含有10mL YEP液体培养基（含有50mg.L^-1Kan和50mg.L^-1Rif）的离心管中，28℃，150-200rpm·min^-1摇菌15-20h，按照菌液浓度进行稀释，加入10mL含有50mg.L^-1Kan的液体培养基（同上）中，28℃，150-200rpm振荡培养4-6h，至菌液浓度OD=0.4-0.6； 

③将悬浮液中的叶片放入农杆菌菌液中进行浸染8-10min，用灭菌的滤纸将多余的菌液吸净，将叶片置于培养基（MS+6-BA1.0mg.L^-1+NAA0.1mg.L^-1）上共培养3d； 

④共培养3d后，将浸染的烟草叶片用悬浮液进行清洗，然后用无菌滤纸吸干多余农杆菌菌液，再置于筛选培养基（MS+6-BA1.0mg.L^-1+NAA0.1mg.L^-1+Kan100mg.L^-1+Cef500mg.L^-1）上，黑暗条件下进行筛选培养； 

⑤1个月后，在浸染的叶片上长出愈伤组织，当叶片边缘出现抗性芽后，再将抗性芽转移到新的增殖培养基（MS+Kan100mg.L^-1+Cef500mg.L^-1）中进行增殖培养，至得到T0代转化植株。 

实施例4：植物表达载体pBI121-MhSERK4的遗传转化烟草抗性植株的基因功能验证 

待抗性苗长至5～7片叶时，选用基因组提取试剂盒提取抗性烟草植株叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，做PCR检测验证是否为转基因烟草，反应体系为25μL：体系为上下游引物（MhSERK4-XbaI和MhSERK4-SmaI）各1μL，ExTaq2.5μL，dNTP（2.5mol·L^-1）2μL，DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL。PCR反应程序为：95℃5min，94℃40s，58℃40s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。PCR结束后，用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测为阳性。 

将该MhSERK4基因转入普通烟草植物后，当根系长至5-7条时，进行炼苗、移栽，放入大棚中遮阴培育。 

经过2-3月培育T0代转化抗性株系后，烟草植株逐渐产生花蕾，在花蕾即将开放前将一部分烟草抗性植株采取去雄处理；未转化烟草对照植株采取去雄处理； 

经过一段时间生长发育后对处理植株进行观察发现：采取去雄处理的烟草抗性植株可以正常结种子，而对照（未转化烟草）植株经过去雄处理后未能结种子。 

通过上述实验说明MhSERK4基因是无融合生殖相关基因，验证了该基因无融合生殖功能，即不通过两性生殖细胞的结合仍然可以正常产生种子。 

综上所述，本发明构建了含有无融合生殖相关MhSERK4基因编码的植物表达载体pBI121-MhSERK4，其中MhSERK4基因为首次报道。所构建的载体可导入植物中，可用于研究植物的无融合生殖分子机理。 

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此，依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。 

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>沈阳农业大学

<120>平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK4基因植物表达载体和构建方法与应用

<160>5

 

<210>1

<211>1836

<212>DNA

<213>平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd. var. pingyiensis Jiang)

<220>

<223> 无融合生殖基因MhSERK4核苷酸序列

<400>1

   caactgacag ctgagttata cgatagttat gcatggaaac cgagacagtg tgcctccagc     1

   tattgttagg agaccccgat gctcgcgatg aatttttgtt acgacgttgt gatcagctat    61

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   acaaggtcaa cttgatctca aatggtcagt cttagttgaa cagctgcgga tcaactcgta   181

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   gtacaccagc gactcaggtc atgcacgaat gttaaaatgc caattgccgg tgtttgtgaa  1741

   caacactttg tctgttatcg aacaattttg cggtcg                            1801

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>PCR反应扩增MhSERK4基因用上游引物MhSERK4-F

<400>2

atgtttgttgcagctgatccttg            23

                   

 

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223> PCR反应扩增MhSERK4基因用下游引物MhSERK4-R

<400>3

           tcaccttggaccagataactcga          23

 

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223> PCR反应双酶切用上游引物MhSERK4-XbaI-F

<400>4

ggtctagaatgacgtcttccacctctgtttc           31           

 

<210>5

<211> 31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR反应双酶切用下游引物MhSERK4-SmaI-R

<400>5

 accccgggtcatctaggaccggacaactcat            31