提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法

摘要

本发明公开了一种提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，是以棉花黄化苗茎尖分生组织为受体，通过对茎尖顶端分生组织进行“十”字形或“米”字形、0.6～1.0mm深度的划伤，再用农杆菌介导法将目的基因导入棉花，获得转基因植株。本发明方法具有转化效率高、重复性好的优点，实验证实，利用本发明所述的转化方法棉花平均转化率比改进前的平均转化率提高了30%，对棉花的遗传改良具有重要价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高外源基因转化率的方法，尤其涉及一种提高棉花黄化幼苗茎尖分生 组织外源基因转化率的方法；属植物基因工程领域。

背景技术

自1987年Umbeck等（Umbeck et al.Bio/Technology,1987,5:263-266）通过农杆菌介导 法成功获得珂字棉转基因植株后，农杆菌介导法逐渐成为国际上最普遍的转化手段之一，并 取得了很大进展（Wu et al,2005,Plant Breeding,124(2):142-146；Guo et al.Biologia Plantarum. 2007,51(2):242-248）。到目前为止，发表有关棉花遗传转化的文章也为数不多。主要原因是 进行转基因后棉花愈伤组织一般比较难以再生，棉花体细胞胚胎发生和植株再生的组织培养 时间较长。从已有的报道来看，利用最适宜的基因型棉花品种进行遗传转化也需要8～10个 月（Umbeck et al，Bio/Technology,1987,5:263-266）。此外，长时间离体培养获得的再生植株 往往存在比较严重的遗传变异。一些学者试图利用基因枪直接转化棉花茎尖细胞，但转化效 率极低（McCabe et al.Bio/Technology,1993,11:596-598;Zapata et al.Theor.Appl.Genet.,1999, 98:252-256）；还有一些学者利用基因枪轰击棉花细胞悬浮细胞系（Fine et al.Plant Cell Rep. 1990,8:586-589；Rajasekaran et al.Plant Cell Rep.2000,19:539-545），但建立棉花细胞悬浮系受 基因型限制。珂字棉312(Coker312G)、珂字棉201(Coker201)目前发展成为众多实验室棉花 转基因的模式品种，但是珂字棉312和珂字棉201都是美国生产上过时的棉花品种，所获得 的转基因棉花材料通常要经过杂交选育和系统选育才能在生产上应用，费时费力。因此，建 立适宜的棉花遗传转化技术仍然是棉花基因工程研究的重要基础。

植株再生困难、基因型依赖性强、转化周期长及效率低是目前制约棉花遗传转化的主要 因素。实验室选用黄化小苗的茎尖为受体进行遗传转化，避免了植株再生过程，克服了基因 型限制建立了一个新的棉花遗传转化体系（吕素莲等，高技术通讯，2004，11:20-25）。但由 于影响棉花黄化小苗茎尖转化体系的因素较多，在实际应用中存在转化率不稳定、重复性差 的缺点，故提高棉花黄化小苗茎尖转化体系的转化率稳定性、重复性是急需解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是进一步提高利用棉花黄化幼苗茎尖分生组 织进行遗传转化的效率和重复性，提供一种有效提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转 化率的方法。

本发明所述提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，步骤如下：

a)棉花黄化幼苗的培养，获得转基因受体植株;

棉花种子经硫酸脱绒后，用70%乙醇浸泡0.5～1.5min、0.1%的升汞浸泡10～15min，然 后用无菌水洗涤3～5遍；消毒后种子放入铺有三层滤纸的无菌瓶中，加入适量无菌水，于 25～28℃温箱中暗处萌发；2～3天后当下胚轴长到1～2cm后转入pH5.8～6.0的CoM固体 培养基中，置暗处在25～28℃、相对湿度40～60%条件下生长至株高为8～10cm的黄化幼苗， 用于茎尖转化；

其中，上述CoM固体培养基是指在CoM培养液中添加了质量百分比为6%的琼脂而制 得的培养基；CoM培养液是指用蒸馏水配制的含表1所述溶质的培养液。

表1、CoM培养液的溶质成分

大量元素 培养基中浓度（mg/L） KNO₃1900 NH₄NO₃1650 CaCl₂·2H₂O 440 MgSO₄·7H₂O 370 KH₂PO₄·H₂O 170 微量元素 培养基中浓度（mg/L） FeSO₄·7H₂O 27.8 ZnSO₄·7H₂O 8.6 MnSO₄·4H₂O 22.30 H₃BO₃8.70 Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 CuSO₄·5H₂O 0.025 CoCl₂·6H₂O 0.025 KI 0.8     有机成分 培养基中浓度（mg/L） 盐酸硫胺素 10 盐酸吡哆醇 1 烟酸 1 肌醇 100 其他 培养基中浓度（g/L） 蔗糖 30

b)去掉黄化幼苗的种皮和一片子叶裸露出茎尖分生组织，然后划伤茎尖顶端；

上述划伤茎尖的方法是：对茎尖顶端的分生组织作“十”字形或“米”字形划伤，并控制划 伤伤口的深度为0.6～1.0mm；

c)用脱脂棉球蘸吸浸染液，并将其放置在划伤后的黄化幼苗茎尖顶端部位，用无菌吸水 纸吸去感染部位多余的残留菌液，在负压条件下实施浸染；

上述实施浸染的方法是：在真空负压为0.05～0.06MPa条件下，用吸有浸染液的脱脂棉 球置于划伤后的黄化幼苗茎尖顶端部位，在温度25～28℃、空气相对湿度40～60%的条件下 浸染10～15min；其中，所述浸染液组成是：在CoM培养液基础上添加了100～200mg/L的 乙酰丁香酮和质量百分比浓度为0.01～0.02%的表面活性剂Silwet-L77，以及含有重组外源基 因的菌体浓度为OD₆₀₀=0.6～0.8的农杆菌，所述浸染液pH为5.8～6.0；

d)将浸染后的黄化幼苗于25～28℃，暗培养3±0.5天，然后光培养2～3天；

e)将培养后黄花幼苗移栽入花盆，在温度25～28℃、湿度40～60%条件下培养，至生 长出2～3片真叶；

f)用脱脂棉球蘸吸选择剂，并将其放置在已长出2～3片真叶的转化苗茎尖顶端部位， 实施抗性筛选，获得抗性植株；

上述选择剂为除草剂，上述实施抗性筛选的方法是：在日温25～28℃、夜温20～22℃、 相对湿度40～60%条件下，用吸有选择剂的脱脂棉球置于转化苗茎尖顶端部位12～24h，10～ 15d后观察植株芽尖顶端分生组织的存活情况选出抗性植株，转基因植株茎端生长点保持绿 色，生长良好，非转化植株生长点发黑死亡。

上述提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法中：

所述的棉花可以是品种、品系、育种中间材料，可以是常规种或杂交种。

所述划伤伤口的深度优选为0.6～1.0mm。

所述浸染时间优选10～15min。

所述除草剂为氯磺隆，进一步的，优选浓度是20～40mg/L的氯磺隆。

本发明根据影响棉花茎尖遗传转化效率的主要因素，选取了浸染液中菌体浓度、浸染时 间、真空渗透、浸染液中表面活性剂Silwet-L77浓度和茎尖分生组织损伤方式，每个因素分 别选用3个水平，利用L₉（3⁴）正交表，通过多批次、不同棉花品种的试验，获得了提高棉 花遗传转化效率的组合。

本发明公开的提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法中关键是对茎尖顶 端分生组织进行“十”字形或“米”字形、0.6～1.0mm深度的划伤。这种损伤主要目的在于有效 损伤茎尖分生组织，提高农杆菌的浸染，提高转化率和重复性，且在实际生产中有助于应用 机器手程序化操作。实验证实棉花茎尖分生组织的损伤不能过大，否则破坏茎尖顶端分生组 织，对受体棉花生长造成危害，故本发明方法中的优化条件是经过大量试验筛选获得，较现 有方法有创造性。进一步的实验证实，利用本发明所述的转化方法棉花平均转化率比改进前 的平均转化率提高了30%，对棉花的遗传改良具有重要价值。

附图说明

图1：为重组载体pCAMBIA1300-TsVP-als的结构示意图。

图2：为利用农杆菌对棉花黄化幼苗茎尖分生组织进行直接转化流程：

1为灭菌后的棉花种子于铺有三层滤纸的无菌平皿中萌发；

2为将黄化小苗种皮和一片子叶剥去，用手术刀片划伤裸露的茎尖生长锥；

3为将灭过菌的蘸有农杆菌菌液的脱脂棉球置于茎尖上，辅以负压浸染10～15min；

4为浸染后暗培养3天后移栽；

5为2～3周后选择剂进行筛选时植株大小。

图3：为转基因植株的PCR结果

泳道M为DNA Marker DL2000；

泳道P为质粒DNA；

泳道WT为野生型对照；

泳道CP-1、CP-2、CP-3、CP-4为转基因植株。

具体实施方式

以下结合实施例详细叙述本发明。须说明的是，本发明的实施例只对本发明起说明作用 而没有限制作用。

实施例1、应用本发明方法获得转基因棉花

1、重组农杆菌的获得

将目的基因TsVP（genbank注册号AY436553）重组于植物双元表达载体 pCAMBIA1300-TsVP-als中。

构建植物表达载体所用到的质粒为：pCAMBIA1300-P35SMCSTnos–als（简称：pCPA） 和pCAMBIA1300-Pubi-TsVP-Tnos-als（简称：pCUA-TsVP），其中pCPA含有CaMV35S启 动子、抗除草剂筛选标记基因als和一个多克隆位点(MCS)，pCUA-TsVP含有TsVP基因。用 XbaI酶切pCUA-TsVP质粒DNA，回收TsVP片段，连接到pCPA多克隆位点中鉴定插入方向， 得到表达目的基因的植物表达载体pCAMBIA1300-P35S-TsVP-Tnos–als（图1）。

将pCAMBIA1300-P35S-TsVP-Tnos–als载体转入根瘤农杆菌LBA4404，得到含有TsVP-als 基因的重组根瘤农杆菌LBA4404。

2、农杆菌培养及活化

将带有双元载体（Mini-Ti质粒带有除草剂氯磺隆抗性基因als，genbank注册号X51514.1） 的根瘤农杆菌LBA4404在附加抗生素的YEP培养基中28℃震荡培养，震荡速率为180～200 r/min，使细菌处于对数生长期，菌液OD值在0.6～0.8之间（如0.6）。然后在5000r/min下 离心10min，弃上清液，得菌体。

菌体用CoM培养液洗涤，离心收集，备用。

在CoM培养液基础上添加100～200mg/L（优选150mg/L）的乙酰丁香酮和质量百分比 浓度为0.01～0.02%（优选0.15%）的表面活性剂Silwet-L77，然后再加入步骤2制得的菌体 并使菌体浓度为OD₆₀₀=0.6～0.8，即制得用于转化的浸染液，所述浸染液pH为5.8～6.0。

3、棉花黄化幼苗的培养，获得转基因受体植株

棉花种子经硫酸脱绒后，用70%乙醇浸泡0.5～1.5min、0.1%的升汞浸泡15min，然后用 无菌水洗涤3～5遍。

消毒后种子放入铺有三层滤纸的无菌瓶中，加入适量无菌水，于25～28℃温箱中萌发。 2～3天后下胚轴伸长到1～2cm（图2-1）。

将萌发种子插到CoM固体培养基（pH5.8～6.0）中继续暗培养(25～28℃，5～6d)，取 株高8～10cm小苗(优选8cm)用于茎尖转化（图2-2）。

4、棉花黄化幼苗分生组织转化

取株高8～10cm高的棉花黄化小苗，小心去掉黑色种皮和一片子叶，裸露出棉花黄化苗 茎尖分生组织；

从黄化幼苗茎尖顶部划伤茎尖分生组织，即：用手术刀片对茎尖顶端的分生组织作“十” 字形或“米”字形划伤，并控制划伤伤口的深度为0.6～1.0mm；

划伤黄化幼苗茎尖分生组织后（但不能破坏茎尖分生组织），用灭菌脱脂棉球蘸吸浸染液， 并将其放置在划伤后的黄化幼苗茎尖顶端部位（图2-3），用无菌吸水纸吸去感染部位多余的 残留菌液。在真空负压为0.05～0.06MPa条件下，用吸有浸染液的脱脂棉球置于划伤后的黄 化幼苗茎尖顶端部位，在温度25～28℃、空气相对湿度40～60%的条件下浸染10～15min（优 选10min）。

5、转化植株的移栽

浸染后的棉花黄化幼苗芽尖用无菌滤纸吸干菌液于黑暗中培养3天，培养温度为25～ 28℃，相对湿度40～60%。然后将无菌苗放在散射光下培养2天，培养温度为25～28℃，相 对湿度40～60%。

将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石和下层壤土的花盆中，蛭石覆盖顶部（图 2-4）。然后让植株在自然光照下生长，日温25～28℃，夜温20～22℃，隔日浇灌1/2改良 MS培养基无机盐，至生长出真叶。

6、转基因棉花的抗性筛选

当生长至有2～3片真叶后（图2-5），利用蘸有选择剂氯磺隆的脱脂棉球置于转化苗茎尖 顶端部位，进行抗性筛选，获得抗性植株。

在温室（日温25～28℃，夜温20～22℃，相对湿度40～60%）待转化植株长出2～3片 真叶后，将含有20～40mg/l（因受体基因型而有差异）氯磺隆（沈阳农药厂生产，有效成分 25%）水溶液的脱脂棉球放在植株芽尖顶端12～24h，以未转化植株为对照。10～15d后观察 植株芽尖顶端分生组织的存活情况。非转化植株生长点发黑死亡，转基因植株茎端生长点保 持绿色，生长状况良好。

待存活植株长到5～6叶期，将其定植到大田。收获抗性植株棉铃中的种子。

7、分子检测

用CTAB法微量提取存活植株基因组DNA。采用PCR技术检测外源基因。扩增TsVP基 因的PCR引物：P1，5’-CAGAACTCGCCGTAAAGACT-3’；P2，5’-GCAGAAACCGAAG ATAACG-3’。转基因植株的PCR结果：转化植株扩增出预期550bp大小的片段（见图3）。

8、转化效率

从步骤（3）～（6）得到除草剂抗性植株并完成PCR验证。以n/N*(100%)计算转化率（n 为PCR验证的植株数目、N为转化苗数）。以每组转化2000株黄化苗、5次重复获得的PCR 验证的阳性植株计算转化率，利用改进后的转化方法，鲁棉研21号、鲁棉研19号、鲁棉研 35号的转化率分别为7.56±0.45%、15.47%±0.66和6.82±0.37%，而改进前转化方法的平均转 化率分别为5.51±1.29%、11.8±3.21%和5.2±1.11%。棉花的转化率提高30%以上，且组间重 复性好。