一株产生ACC脱氨酶人参促生细菌的获得及应用

摘要

本发明公开了人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株，保藏编号为CGMCCNo.8239，它是在大量人参内生细菌中，经初选得到了几株可产生ACC脱氨酶的菌株，再反复筛选得到的，经大量的实验证明，菌株JJ8-3不仅可产生ACC脱氨酶，同时也具有很强的促进人参生长作用，无致病性，经鉴定，菌株JJ8-3为荧光假单孢菌（Pseudomonasfluorescens），解决了我国最为重要的中药材之一，人参的种子发芽率低、生长缓慢、抗逆性差等缺点，该菌株的发现为人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。

说明书

技术领域

本发明属微生物技术领域，具体地说是一株产生ACC脱氨酶人参促生细菌及其应用。 

背景技术

近年来，自然灾害的发生以及化肥的不合理利用对土壤和作物生长造成了极大的负面影响。从环境中筛选具有促进植物生长，提高植物抗逆能力并改善环境的微生物菌株具有重要的意义。目前已报道的一些具有促生功能的菌株，其主要特性包括产IAA、固氮、解磷、解钾、产铁载体等。而1-氨基环丙烷1-羧酸（ACC）脱氨酶及其活性菌株研究的报道较少，也是近年来比较受关注的植物促生菌特性之一。乙烯是一类重要的植物内源生长调节剂，主要在植物果实成熟、植株衰老或不利条件下发挥调节作用，亦称“应激激素”，乙烯的过量产生会抑制植物种子根的伸长、植株的生长、抗性下降、提早凋谢等。而ACC脱氨酶具有降解乙烯并促进植物生长的作用。据报道ACC脱氨酶在促进植物抗盐碱、干旱、重金属离子及植物促生方面具有重要的调节作用。 

植物遭受胁迫会产生乙烯。高水平的乙烯会抑制植物的生长。具有A CC 脱氨酶的细菌能够吸收植物细胞分泌到胞外的用来合成乙烯的直接前体A CC , 通过A CC 脱氨酶催化, 将A CC 水解成a 一酮丁酸和N H 3 , 从而降低植物体内胁迫乙烯的水平, 解除胁迫乙烯对植物生长的抑制。大量的研究证实接种具有A CC 脱氨酶的细菌能够促进植物的生长, 尤其是在植物遭受生物或非生物胁迫的逆境下。因此, 具有A C C 脱氨酶活性已经成为评估细菌是促植物生长细菌的一个重要指标。但是, 近年来, 从某些致病菌的基因组序列中已经发现A CC 脱氨酶基因, 从某些致病菌中也检测到了A CC 脱氨酶活性, 还发现具有A CC 脱氨酶的假单胞菌(Pseudomonas bicacearum ) 能够让番茄茎和果实产生病症。 

发明内容

本发明的目的是为克服人参种子发芽率低、生长缓慢、抗逆性差等缺点，而提供一株产生ACC脱氨酶人参促生细菌。 

人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株，保藏编号为CGMCC No.8239。 

人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株在促进人参生长方面的应用。 

本发明提供了人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株，保藏编号为CGMCC No.8239，它是在大量人参内生细菌中，经初选得到了几株可产生ACC脱氨酶的菌株，再反复筛选得到的，经大量的实验证明，菌株JJ8-3不仅可产生ACC脱氨酶，同时也具有很强的促进人参生长作用，无致病性，经鉴定，菌株JJ8-3为荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens），解决了我国最为重要的中药材之一，人参的种子发芽率低、生长缓慢、抗逆性差等缺点，该菌株的发现为人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。 

附图说明

    图1 为JJ8-3菌株ACC脱氨酶活性测定，其中，1：JJ8-3菌株反应后变为棕色；2：对照； 

图2 为JJ8-3菌株其他促生功能分析，其中， 1：解磷特性，2：固氮潜能，3：产体载体能力；

图3 为JJ8-3菌株在NA培养基上的菌落形态；

图4为JJ8-3菌株在紫外下的产生荧光；

图5为 JJ8-3菌株电镜下观察的菌体形态；

图6为 JJ8-3 菌株的分子鉴定聚类图谱；

图7 为JJ8-3菌株对人参种子发芽的促生作用；

图8 为JJ8-3菌株对人参种子发芽的促生作用；

图9为 JJ8-3菌株对人参根的促生作用；

图10为 JJ8-3菌株对人参根鲜重的促生作用； 

图11 为JJ8-3菌株对人参根干重的促生作用。

具体实施方式

实施例1产生ACC脱氨酶人参活性内生细菌（荧光假单孢菌）的获得。 

采用平板稀释法分离获得了120株来源于吉林省的人参内生细菌，并对其进行了ACC脱氨酶活性菌株的筛选。 

筛选分为初筛和复筛，初筛采用液体培养法对120株细菌进行筛选，将待测菌株分别接种到液体LB培养基中，28℃，160 r/min 过夜培养。取0.2 mL 培养基转接到8mL DF盐培养基中，相同培养条件下培养12 h。然后再取0.2mL 培养基再次转接8mL ADF液体培养基。并以不含ACC的ADF培养基作为对照。培养24~48h 测其600 nm处吸光值，三次重复，比对照吸光值显著增加的为阳性菌株。结果筛选得到筛选到8株阳性菌株。（DF盐培养基：KH₂PO₄ 4.0 g，Na₂HPO₄ 6.0 g ，MgSO₄ ·7H₂O 0. 2 g，葡萄糖2.0 g，葡萄糖酸 2.0 g，柠檬酸2. 0 g，(NH₄)₂SO₄ 2. 0 g，去离子水1000mL，pH 7.2；ADF培养基：ACC溶于灭菌的超纯水后，经0.22 μm一次性无菌过滤器过滤除菌，加到不含有(NH₄)₂SO₄的DF盐培养基中，终浓度为3.0 mmol/L。） 

复筛采用α-酮丁酸法对初筛得到的菌株进行筛选：①菌株接种到LB液体培养基中，28℃，160 r/min过夜培养，培养液经8000 r/min离心5min后将菌体重新悬浮于7.5 mL ADF液体培养基，28℃，160 r/min继续培养16 h。取出培养液8000 r/min离心，弃上清，收集菌体。菌体再悬浮于0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液后超声破碎，得粗酶液保存；② α-酮丁酸标准曲线的绘制，分别吸取α-酮丁酸标准样品200 μL加入无菌试管中，另加入1.6 mL HCl（0.56 mol/L）和300 μL 2, 4-二硝基苯肼（0.2%），30℃水浴30 min。取出后加入2 mL NaOH（2mol/L）溶液混匀，540nm测定吸光值。③取两试管，分别加入200μL粗酶液。其中一支试管中加入0.5mmol ACC 20μL 混匀，30℃水浴15min后加入1mL 0.56 mol/L HCl 终止反应，12000r/min离心5min，取上清液1mL，加入800μL 0.56 mol/L和300μL 0.2%的2,4-二硝基苯肼，30℃水浴30min，取出后加入2mL 2mol/L NaOH溶液混匀。另一只试管未加入0.5mmol ACC为对照管，在540nm处测定吸光值。复筛实验结果显示，JJ8-3菌株具有ACC脱氨酶活性（图1），其酶活性为α-酮丁酸 6.702 μmol/mg·h。

实施例2：活性菌株JJ8-3其他促生指标的测定

1、解无机磷能力的筛选：初筛采用PKO固体培养法，将JJ8-3菌株在NA培养基上培养12h后，打菌碟接种于PKO固体培养基，28℃恒温培养3d后观察解磷圈大小。复筛采用钼锑钪比色法，将JJ8-3打孔接种于50mL LB液体培养基，160 r/min培养12h。取1 mL接种于装有50 mLPKO液体培养基的150 mL三角瓶中，3 d后取培养液5mL，8000 r/min离心5min后取上清，钼锑钪比色法测量可溶性磷含量。结果显示，在PKO平板上，JJ8-3菌株具有明显的解磷圈（图2）；定量测定其解磷含量，可达到380 μg/mL。

2、固氮能力的测定：将菌株划线接种于Ashby固体培养基上，30℃恒温培养2d，观察菌株长势，结果发现菌株JJ8-3无氮条件下长势良好（图2）。 

3、产铁载体能力的测定：初筛采用固体培养法，将JJ8-3菌株在NA培养基上培养12h后，打菌碟接种于刃天青固体培养基，28℃恒温培养2d后观察菌落周围颜色变化。复筛方法为比色法，用接种环挑取一环新鲜菌苔于MKB培养液内，28℃、160r/min摇床培养2d后取菌液10000r/min离心10min，取上清3ml于试管中，加入3ml CAS检测液混匀后20℃反应1h，在630nm处测定吸光值As；另取3ml CAS检测液与3ml未接菌的MKB液体培养基上清液混匀，同样测吸光值Ar。根据公式（(Ar－As) /Ar)× 100）计算铁载体产生量。结果显示，JJ8-3菌株具有产生铁载体活性（图2），其活性高达91.8%。 

实施例3：菌株JJ8-3的鉴定

将JJ8-3菌株划线接种在NA培养基上，28℃培养12~24h后，观察记录单菌落形态。JJ8-3在NA培养基上呈浅绿色不透明圆形菌落，边缘完整微透明（图3），革兰氏染色阴性，无运动性，紫外下观察产生荧光（图4）。

取在LB液体培养基中培养24h的JJ8-3菌株菌液，离心用无菌水反复冲洗后，悬浮于适量无菌水中进行负染色制备样品，用镊子夹住带膜的铜网蘸取微量菌液，静置2 min，从边缘用滤纸吸干剩余液；然后再用镊子夹住带菌的铜网浸入盛有双蒸水的烧杯内漂洗，再用滤纸吸干液体，接着用2%磷钨酸负染色5 min，干燥后用透射电镜观察发现菌体呈杆状，生有极端生长鞭毛（图5）。 

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基（表1）和方法测定JJ8-3菌株的生理生化特性发现， JJ8-3菌株接触酶、氧化酶反应为阳性，V-P反应为阴性；能利用柠檬酸、不能使硝酸盐还原、淀粉水解，但能使油脂水解、明胶液化，石蕊牛奶还原但不胨化，对NaCl 的耐受性为7%；可以利用葡萄糖、甘露醇和半乳糖。 

获得菌株16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，获得的登录号为KF727589，构建系统进化树见图6。JJ8-3菌株与Pseudomonas fluorescens聚于同一分支中，其相似性达到99.46%。通过形态特征、培养特征、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，JJ8-3菌株为荧光假单孢菌（Pseudomonas  fluorescens）。 

荧光假单孢菌JJ8-3菌株，已于2013年9月24日，送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8239。 

实施例4：菌株JJ8-3对人参的促生效果

1. 种子发芽试验

菌株JJ8-3接种LB培养液摇床过夜培养后，8000 rpm离心5min收集菌体。用无菌水洗涤2次后重悬浮于无菌水中，血球计数板测定浓度并将其稀释成浓度为10⁹ cfu/mL的细菌悬浮液。选择将已后熟的人参种子浸泡在菌悬液中3h，取出晾干表面液体后，置于装有无菌湿润沙子的培养皿中，每皿15粒种子，即为1次重复，6次重复，于暗处18~23℃放置催芽10~15d，以无菌水处理的种子为对照。结果显示（表2，图7，图8），JJ8-3菌株处理的人参种子芽长平均值为20.5 mm，大于清水对照处理（12.2 mm），芽长增加68.03%，表明JJ8-3菌株对人参种子发芽生长具有促进作用。

2. 种子出苗试验 

将经菌株JJ8-3菌悬液处理过的人参种子植入沙土培养钵内，种植深度2 cm，打足底水，每钵10粒种子，3次重复，以无菌水处理的种子做对照，18℃~23℃生长，7天后观察记录出苗时间。试验结果显示， JJ8-3处理的种子出苗率达到70% 时需要10天，与对照相比提前5天。

3. 对人参根的促生效果 

    试验于2012年10月20日将大小均匀的2年生人参苗种植于土壤肥力一致的人参床中，种植深度5cm。2013年6月5日，人参出苗完全展叶后用10⁸ cfu/mL的JJ8-3菌悬液进行灌根处理，每重复10株人参苗，浇灌200mL菌悬液，对照浇灌相同体积的水，4次重复，每10天浇灌一次，共3次。2013年10月25日人参地上部茎叶脱落后，起出人参根，10株为单位测定根鲜重和干重。

    

 检测结果表明，JJ8-3菌株对人参根生长具有明显的促进作用，经JJ8-3菌株处理的人参与对照相比，鲜重增加31.72%，干重增加37.94%，期统计结果见表2，图9，图10，图11。