一株高效处理含氮污水的施氏假单胞菌及其应用

摘要

本发明公开了一株高效处理含氮污水的施氏假单胞菌及其应用。本发明所提供的施氏假单胞菌是施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8521。本发明的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19对初始NO3--N浓度为32mg/L的模拟污水，NO3--N去除率24h能达到98%，32h NO3--N去除率达100%，且无亚硝酸盐积累。32小时反硝化完全时消耗碳氮比为4.4:1。

说明书

技术领域

本发明涉及一株高效处理含氮污水的施氏假单胞菌及其应用。

背景技术

污水再生利用是缓解水资源短缺、防治水环境污染、改善水环境质量的有效途径。 但由于城市污水二级出水中，含有一定量的氮磷等营养物质，直接补给城市景观水体、 河流和湖泊，存在造成水体富营养化的风险。目前的脱氮技术仍以生物脱氮技术最为 高效且应用广泛。

传统生物脱氮中氮素的转化过程包括氨化、硝化和反硝化。其中反硝化过程是将 氮素转化为气态氮从水体最终去除的过程。反硝化作用通过反硝化菌的生命活动实现 的，因此高效反硝化菌的发现对生物脱氮意义重大。

反硝化细菌的种类很多，大约有50多个属，130多个种，自然界最普遍的反硝化 细菌有假单胞菌属（Pseudomonaceae），产碱杆菌属（Alcaligenes），还有科奈瑟菌科 （Ne isseriaceae），硝化细菌科（Nitro bacteraceae），红螺菌科（Rhodospirillaceae），芽 孢杆菌科（Bacillaceae），纤维粘菌科（Cytophagaceae），螺菌科Spirillaceaee），根瘤 菌科（Rhizobi aceae），盐杆菌科（Halobacteri aceae）等。其中假单胞菌属是微生物的 重要类群,也是分布最广的微生物之一。多样的生境造就了假单胞菌拥有较广的生长温 度、pH值范围,较多的营养代谢类型，因此可以在更为复杂的环境中进行反硝化作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株高效处理含氮污水的反硝化细菌，该反硝 化细菌投入模拟污水中（SBR反应器出水添加少量碳源）能在短时间内实现完全反硝 化。

本发明所提供的反硝化细菌是施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19， 该菌株已于2013年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC  No.8521。

施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521的16s rDNA 序列如序列表中序列1，施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC  No.8521的形态特征如下：菌落圆形、皱折状、黄色；菌体短杆状、长度10μm；革兰 氏染色阴性。施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521的生 理生化特征如表2。

本发明的另一个目的是提供一种反硝化菌剂，该反硝化菌剂的活性成分为所述的 施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521。

所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿 物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、 白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的 至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为植物油、矿 物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培 养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。 所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分 散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、 稳定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。

含有所述施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521的反 硝化生物膜或反硝化生物膜反应器也属于本发明的保护范围。

该反硝化生物膜具体是由人工填料或天然材料作为载体，所述施氏假单胞菌 （Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521附着絮凝其表面形成的膜状物。

上述施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521、上述反 硝化菌剂、上述反硝化生物膜或反硝化生物膜反应器在去除硝酸盐氮（NO₃^--N）和/ 或亚硝酸盐氮（NO₂^--N）中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，去除硝酸盐氮（NO₃^--N）和/或亚硝酸盐氮（NO₂^--N）可为去除液体 中的硝酸盐氮（NO₃^--N）和/或亚硝酸盐氮（NO₂^--N）。所述液体可为含硝酸盐氮（NO₃^--N） 和/或亚硝酸盐氮（NO₂^--N）的任何液体，如含硝酸盐氮（NO₃^--N）和/或亚硝酸盐氮 （NO₂^--N）的水体。

所述施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521可在用于 培养假单胞菌的培养基中培养。其适宜培养条件为：pH7.5，温度30-35℃。

本发明的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19从缺氧反硝化生物滤 池中分离得到。本发明的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19在缺氧条 件下对初始NO₃^--N浓度为32mg/L的模拟污水，NO₃^--N去除率24h能达到98%，32h NO₃^--N去除率达100%，且无亚硝酸盐积累。32小时反硝化完全时消耗碳氮比为4.4:1。 说明该菌株能有效脱除水体中的氮元素，在模拟污水中短时间内可实现完全反硝化作 用，处理效果高效稳定，应用广泛。

保藏说明

菌种名称：施氏假单胞菌

拉丁名：（Pseudomonas stutzeri）

菌株编号：DN-LWX19

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2013年11月29日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8521

附图说明

图1为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19扫描电镜照片

图2为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19投入模拟污水中硝酸盐 去除效果

图3为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19投入模拟污水中亚硝酸 盐浓度变化

图4为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19投入模拟污水中COD 浓度变化

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中的COD采用连华科技COD快速测定法，具体方法如下：仪器型号： 连华科技COD快速测定仪5B-1型；试剂：连华科技COD水质监测专用耗材LH-DE-500 型；测定步骤：取2.5mL待测水样于试管中，加入0.7mLD试剂、4.8mLE试剂，混匀， COD快速测定仪165℃消解10min，取出后冷却2min，加入2.5mL高纯水，充分混匀， 冷却后于610nm波长下测定吸光度。COD浓度（mg/L）=Abs₆₁₀×1505×3。

下述实施例中的NO₃^--N浓度采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法，具体将待测菌 悬液离心后取上清液用0.22μm滤膜过滤，将过滤得到的液体稀释100倍进行测定。

下述实施例中的NO₂^--N浓度采用1-（萘基）-乙二胺分光光度法。

本发明中脱氮指水体中无机氮NO₃^--N、NO₂^--N的去除。

下述实施例中的NO₃^--N去除率=（处理前NO₃^--N浓度—处理后NO₃^--N浓度）/ 处理前NO₃^--N浓度。

本发明中消耗碳氮比为处理前后消耗COD浓度（mg/L）与处理前后去除的硝酸 盐氮浓度（mg/L）之比。

下述实施例中的COD去除率=（处理前COD值—处理后COD值）/处理前COD 值。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19的分离鉴定

一、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19的分离

将反硝化滤池（取样当天水质见表1）出水口滤料10颗置于装有40mL富集培养 基（用牛肉膏5g、蛋白胨10g、硝酸钾1g和水配制成1升的液体，pH为7.0-7.2）的 100mL三角瓶中30℃过夜培养，让滤料上微生物分散富集生长，吸取1mL菌悬液至 装有9mL无菌水的离心管中，得到稀释度10^-1的菌悬液，依此方法将菌悬液用无菌水 稀释至10^-15，得到一系列稀释梯度的菌悬液。分别吸取0.1mL稀释度10^-8-10^-15的菌悬 液至反硝化菌分离培养基（用牛肉膏5g、蛋白胨10g、硝酸钾1g、琼脂18g和水配 制成1升的液体。pH为7.0-7.2），用玻璃棒涂布均匀，封口膜密封后倒置于30℃培养， 至长出明显菌落。

挑取形态不同的单菌落至富集培养基中过夜培养后，在平板上多次纯化，直至显 微镜下观察显示无杂菌为止,得到纯化的菌株。对纯化后的菌株进行硝酸盐还原产气实 验，挑选出反硝化彻底，产气多，产气快的菌株接种至斜面培养基（用牛肉膏5g、蛋 白胨10g、硝酸钾1g、琼脂18g和水配制成1升的液体，pH为7.0-7.2）保存备用。 对筛选到的一株编号为DN-LWX19的反硝化彻底，产气多，产气快的菌株进行下述硝 酸盐还原产气实验：于大试管中加入25mL反硝化培养基（每升反硝化培养基： CH₃COONa 2g；KH₂PO₄ 0.4g；;MgSO₄.7H₂O 0.6g；CaC1₂.2H₂O 0.07g；KNO₃ 1g； Tris缓冲液12mL;微量元素1mL（溶剂为高纯水，溶质及其浓度如下：H₃BO₃ 2.86g/L； ZnSO₄.7H₂O 0.22g/L；CuSO₄.5H₂O 0.08g/L；MnSO₄.4H₂O 2.03g/L； Na₂MoO₄.2H₂O 1.26g/L；pH7.0);用高纯水定容至1L；pH控制在7.0-7.2）121℃条 件下灭菌20分钟，每个试管中接种1mL菌液，加1mL石蜡液封，硅胶塞密封后置于 30℃恒温培养箱静置培养，72h后测定NO₃^--N、NO₂^--N浓度（离心后0.22μm滤膜过 滤），NO₃^--N去除率95%，试管中有气泡产生。

表1取样当天进出水水质

二、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19的鉴定

1、16s rDNA序列同源性分析

（1）DNA提取

取2mL菌株DN-LWX19的菌悬液于离心管中，室温下12000r/min，离心5min, 弃上清液。菌体沉淀中加入567μLTE buffer，反复吹打使之重新悬浮，加30μL10%SDS 和10μL蛋白酶K，混匀后，37℃温育1h。加入100μL5moL/L NaCl溶液，充分混匀， 再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混匀后65℃下温育10min。加入等体积的酚/氯仿/异戊 醇（25:24:1）,混合均匀，12000r/min，离心10min。转移上清液至一新的2mLED管 中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合均匀至DNA沉淀下来，12000r/min离心 5min。弃上清液，沉淀用1mL70%乙醇洗涤，12000r/min离心10min,弃乙醇。于洁净 的超净台上自然干燥后，加95μLTE buffer，放入-20℃冰箱保存。

（2）PCR扩增

取1μL基因组DNA作为模板进行PCR扩增,引物为:细菌27F：

5‘-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’[M=C,A],1492R:5’-CGGYTACCTTGTTACGACT T-3’[Y=T,C]（《现代微生物学实验技术》）。PCR反应体系为25μL：10×Taq buffer2.5μL、 dNTPs(各2.5mmol/l)2.5μL、Taq0.25U、MgCl₂(25mM)2μL、上下游引物各0.2μmol/l、 DNA模板1μL、ddH₂O补至25μL。扩增条件:94℃5min;94℃30s,55℃60s,72℃50s,30 个循环;72℃5min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性,并用DNA纯 化试剂盒纯化。

纯化后的PCR产物外送测序。

（3）16SrDNA序列分析：

菌株DN-LWX19的16s rDNA序列详见序列表中序列1。菌株DN-LWX19与模式 菌株Pseudomonas stutzeri（NCBI登录号：AF094748.1）的进化距离最为接近，为98%， 初步认定其为施氏假单胞菌。

2、形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的菌株 DN-LWX19的进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、 菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、 放射状等）。

对于处于对数生长期的菌株DN-LWX19，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体 的形态，并采用扫描电镜观察菌体形态。

结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的菌株DN-LWX19的菌落圆形、皱折状、 黄色；菌体短杆状、长度10μm（图1）；革兰氏染色阴性。

3、生理生化特征分析

使用VITEK2Systems中的VITEK2革兰氏阴性菌鉴定卡（GN）及梅里埃VITEK2 全自动细菌鉴定仪，按照产品说明测定上述菌株DN-LWX19的生理生化特征。菌株 DN-LWX19的生理生化特征测定结果如表2所示。

表2、菌株DN-LWX19的生理生化特征（Pseudomonas stutzeri概率：97%）

注：+表示阳性；-表示阴性

根据上述16s rDNA序列同源性分析、形态特征和生理生化特征结果，将步骤一 分离纯化得到的菌株DN-LWX19鉴定为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）。该施 氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19已于2013年11月29日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.8521。

实施例2、反硝化菌剂的制备

将斜面培养基（每升斜面培养基是用牛肉膏5g、蛋白胨10g、硝酸钾1g、琼脂18g 和水配制成1升的液体；pH为7.0-7.2；121℃条件下灭菌20分钟）上保存的施氏假单 胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521用灭菌的接种环挑取一环接 种至装有40mL富集培养基（每升富集培养基是用牛肉膏5g、蛋白胨10g、硝酸钾1g、 磷酸二氢钾0.4g和水配制成1升的液体，pH为7.0-7.2；121℃条件下灭菌20分钟） 的100mL锥形瓶中，30℃摇床震荡培养12h，获得的菌液即为反硝化菌剂，该反硝化 菌剂中的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521的含量为 2×10¹⁰cfu/mL。

实施例3、模拟污水中施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC  No.8521脱氮效果

污水取自SBR反应器出水（NO₃^--N32mg/L，NO₂^--N4.5mg/L，COD50mg/L）， 其碳氮比约为1.56：1。为满足反硝化所需碳氮比，向该污水中加入乙酸钠至COD的 浓度为275mg/L，得到模拟污水。该模拟污水的NO₃^--N浓度为32mg/L，NO₂^--N浓度 为4.5mg/L，COD浓度为275mg/L。

实验设三次重复，每次重复取3个500mL锥形瓶，分别同时进行如下处理：于 500mL锥形瓶中加入450mL模拟污水并121℃条件下灭菌20分钟，分别取20mL实 施例2的反硝化菌剂（施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC  No.8521的含量为2×10¹⁰cfu/mL）离心(5000rpm,20min)并用生理盐水清洗之后将沉淀 的菌体加入到模拟污水中，模拟污水中施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri） DN-LWX19CGMCC No.8521的含量为0.89×10⁹cfu/mL，封口膜封口后加保鲜膜隔绝 外界空气，置于30℃恒温培养箱静置培养，每隔8h测定菌悬液的COD浓度（菌悬液 不离心、不过滤）、NO₃^--N及NO₂^--N浓度（菌悬液离心后取上清液0.22μm滤膜过滤 后测定NO₃^--N浓度和NO^2--N浓度）绘制各水质指标随时间的变化曲线，确定菌株脱 氮能力。结果表明，施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521 在模拟污水中表现出了高效的脱氮性能，8小时硝酸盐去除率便达到89%，24小时去 除率达到98%，32h去除率达到100%（图2），32小时实现亚硝酸盐积累浓度降为0mg/L （图3），实现完全反硝化。反硝化完全时消耗碳氮比（消耗碳氮比是指培养前后COD 的去除量与培养前后硝酸盐氮去除量之比）为4.4:1（图4）。其中，加入施氏假单胞菌 （Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19CGMCC No.8521 0小时模拟污水的COD浓度 为275mg/L，NO₃^--N浓度为32mg/L，加入施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri） DN-LWX19CGMCC No.8521 32小时（NO₃^--N浓度和NO₂^—N浓度均为0mg/L）时， 菌悬液的COD浓度为135mg/L，NO₃^--N浓度为0mg/L，消耗碳氮比为（275-135）/32=4.4。

另外，具体应用时，使用方法为：

（1）使用前用富集培养基活化菌株：将斜面培养基上保存的施氏假单胞菌 （Pseudomonas stutzeri）DN-LWX19用灭菌的接种环挑取一环接种至装有40mL富集 培养基（牛肉膏5g/L；蛋白胨10g/L；硝酸钾1g/L；磷酸二氢钾0.4g/L；溶剂为水， pH为7.0-7.2）的100mL锥形瓶中，30℃摇床震荡培养12h，即可获得菌液。

（2）将菌液接种于待处理的含氮废水中，投加量为受处理废水体积的5%，pH 调至7.0，加入磷酸盐缓冲液缓冲pH，室温静置培养，定时取样检测水样中硝酸盐氮 去除情况及亚硝酸盐氮积累情况。