用于提高人乳头瘤病毒L1蛋白产量的方法

摘要

本发明是一种提高HPVL1蛋白产量的方法，其包括在含有高浓度碳源的培养基中培养表达HPVL1蛋白的细胞的阶段。根据使用本发明含有高浓度碳源的培养基的培养方法，不仅显著提高HPVL1蛋白的产量，而且显著提高生产的HPVL1蛋白的免疫原性。

说明书

技术领域

本发明涉及用于提高人乳头瘤病毒（HPV）L1蛋白产量的方法。更具 体的是，本发明涉及用于提高HPV L1蛋白产量的方法，其包括在含有高浓 度总碳源的培养基中培养HPV L1蛋白表达细胞的步骤。

背景技术

宫颈癌是由人乳头瘤病毒（HPV）感染导致的[1]。每年大有约50万女 性患宫颈癌，造成25万人死亡[2]。假定大多数女性在她们的生活中有时具 有无症状的HPV感染[3,4]。16型HPV（HPV16）被认为是最主要的类型， 因为50%以上宫颈癌病例和90%头颈癌都源于它[5]。L1蛋白占HPV病毒 壳体的80-90%，且具有自我装配成病毒样颗粒（VLPs）的性质，所述病毒 样颗粒的结构与天然存在的HPV病毒粒子的结构相似[6]。因此，已认为 HPV VLPs的免疫可以有效地中和抗体[7]。目前，市场上可购买到两种基于 VLP的预防疫苗。一种是Gardasil^TM(Merck)，其由酿酒酵母（Saccharomyces  cerevisiae）表达系统产生，另一种是Cervarix^TM(GlaxoSmithKline)，其由 昆虫细胞表达系统产生[8]。这些疫苗含有作为抗原的16型和18型HPV的 VLPs，采用三次剂量的免疫方案且被认为理论上具有保护70%宫颈癌的作 用，因为16型和18型HPV的感染是造成70%宫颈癌病例的主要原因[9]。 或Cervarix^TM的零售价为大约每剂量$120，全系列$360[10]。现 有HPV疫苗的高零售价限制了其广泛使用，并且由于其高零售价发展中国 家无法担负[11]。因此，在HPV疫苗领域，需要优先考虑用于提高疫苗抗 原L1蛋白产量的方法。

为了确保在生物制药生产过程的经济利益，在上游工艺生物反应器中产 量的提高必须导向总产物产量的提高[12]。然而，几乎没有人重视这个原则， 且几乎没有研究出通过优化重组HPV L1蛋白生产过程中的培养条件来提 高产率。此外，比较不同培养条件下L1蛋白生产率的研究实际上特别困难， 因为纯化HPV L1蛋白的方案耗时长、劳动强度大且成本高。最近，我们研 发出用于由酿酒酵母生产的HPV L1蛋白的一步层析纯化方法，其适合于大 规模生产HPV L1蛋白并可采用于多种样本[13]。

酿酒酵母的GAL10启动子是用于生产异构蛋白的最有力且最常用的启 动子[14,15]。如果同时存在葡萄糖和半乳糖时，酿酒酵母优选使用葡萄糖， 且葡萄糖系统被抑制时，半乳糖诱导GAL启动子[16]。因此，在GAL10启 动子系统下，碳源的组成是生产重组蛋白最重要的因素[17-19]。通常，在 酿酒酵母中生产L1蛋白需要48至72小时的培养时间和2%至4%的由葡萄 糖和半乳糖组成的碳源[20–22]。然而，很少有报告的结果是通过改变培养 基中碳源的浓度和组分提高HPV L1蛋白表达产率。

在本发明的说明书中，包括之前的报告和说明。之前报告和说明的内容 包括在当前内容中，且这些参考阐明本说明书的内容。

发明内容

技术问题

本发明人试图研究在用于表达HPV L1蛋白的细胞培养过程中提高 HPV L1蛋白产量的方法。因此，本发明人证实了当使用含有高浓度碳源的 培养基时，其碳源浓度高于常规使用的碳源浓度，HPV L1蛋白的产率显著 提高。此外，我们发现与在常规培养基中生产的LI蛋白相比，使用含有高 浓度碳源的培养基显著提高了L1蛋白的免疫原性。这些结果表明使用含有 高浓度碳源的培养基不仅提高了LI蛋白的产率，还提高了其免疫原性。

因此，本发明的目的在于提供通过使用含有高浓度碳源的培养基提高 L1蛋白产率的方法。

通过以下本发明的详细描述、权利要求、实施例、表格和附图以提供本 发明的有益效果和目的。

技术方案

根据本发明的一方面，本发明提供了提高HPV L1蛋白产量的方法，其 包括在含有总碳源浓度为6%至14%的培养基中培养表达HPV L1蛋白的细 胞的步骤。

根据本发明的另一方面，本发明提供了提高HPV L1蛋白产量的方法， 其包括以下步骤：(a)制备含有总碳源浓度为6%至14%的培养基；及(b)将 HPV L1蛋白表达细胞接种于培养基中并在培养基中培养HPV L1蛋白表 达细胞。

如本文所使用的，术语“碳源”是指被吸收入细胞且用作构成细胞的组 分的碳源或能源的碳水化合物。例如，本发明的碳源包括葡萄糖、半乳糖、 蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、木糖、丙酮酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、顺乌 头酸、α-酮戊二酸、延胡索酸盐、苹果酸和草酰乙酸盐，但并不限于此。优 选地，碳源为葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖或木糖，更优选 地，碳源为葡萄糖或半乳糖。

如本文所使用的，术语“总碳源”是指培养基中含有的所有碳源。例如， 当培养基中包括葡萄糖和半乳糖作为碳源时，总碳源是指葡萄糖和半乳糖的 量的总和。本发明中使用含有总碳源浓度为6%至14%的培养基。在本说明 书中碳源的百分比(%)是指培养基中含有的碳水化合物或总碳源的重量与培 养基的体积比(W/V)。

本发明中使用的碳源浓度的水平（范围是6%至14%）明显高于用于生 产异构蛋白的酵母培养的常规培养基中碳源浓度。本发明是建立在这样的事 实的基础上的，即，当HPV L1蛋白在含有高浓度碳源的培养基中表达时， 不仅L1蛋白产量显著提高，并且其生物活性诸如免疫原性也显著提高。

优选地，总碳源浓度高于6%且低于14%，更优选地，为6%至13%或 6%至12%。更优选地，为7%至14%，7%至13%或7%至12%，更优选地为 8%至14%，最优选浓度为8%至13%或8%至12%。

当总碳源由葡萄糖和半乳糖组成时，没有限定总碳源中葡萄糖与半乳糖 的比例，但优选为5:5至9:1，且更优选为4:4至7:1。

根据本发明的一个典型实施方式，本发明的方法进一步包括步骤（c）， 其是在步骤（b）后向培养基中添加碳源。

在步骤（c）中加入至培养基中的碳源为葡萄糖或半乳糖，且优选为半 乳糖。

如本文所使用的，术语“HPVL1蛋白”是指L1蛋白，其为组成HPV 病毒壳体的主要蛋白，且具有自我装配的性质，当其在宿主细胞中重组表达 时，其自身形成病毒样颗粒（VLPs）。因此，在本发明中，HPV L1的含义 与HPV VLP的含义相同。在本发明中，L1蛋白源自的HPV类型为，例如， 6a、6b、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58或68型HPV， 但不限于此。

优选地，HPV L1蛋白为HPV16、HPV18或HPV58的L1蛋白。

在本发明中，HPV L1蛋白，优选地，用作表达本领域已知的野生型L1 蛋白。

如本文所使用的，术语“HPV L1蛋白表达细胞”是指使用表达HPV L1 蛋白的载体转化的宿主细胞。表达HPV L1蛋白的载体可通过将编码L1蛋 白的多核苷酸序列克隆到载体中来制备。可通过多种本领域已知的克隆方案 制备这种表达载体，且详细的克隆方法在Sambrook等中公开[Molecular  Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)]。这 篇文献作为本说明书的参考文献。

在宿主细胞中编码HPV L1蛋白的多核苷酸可转录或连接到用于控制 L1蛋白有效表达的翻译的核苷酸序列上。例如，用于L1基因转录的启动子 或终止子序列可连接到编码HPV L1蛋白的多核苷酸上。根据优选的实施方 式，半乳糖启动子诸如酿酒酵母的GAL1启动子可用于本发明，且可使用 GAL1、GAL10、ADH1、TDH3或PGK启动子或源自其它真核生物的启动 子。可使用酿酒酵母ADH1的终止子序列，且其它真核生物的终止子序列 也可用于本发明。

哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母或细菌可用作宿主细胞，优选为动物细 胞或酵母，最优选为酵母。酵母适合于HPV L1蛋白的表达效率及使用生物 反应器大规模生产异构蛋白。

根据优选的实施方式，作为宿主的酵母为酵母属（Saccharomyces spp.）、 裂殖酵母属（Schizosaccharomyces spp.）、汉逊酵母属（Hansenula spp.）、 毕赤酵母属（Pichia spp.）、假丝酵母属（Candida spp.）、球拟酵母属（Torulopsis  spp.）、红酵母属（Rhodotorula spp.）、法夫酵母属（Paffia spp.）、克鲁维 酵母属（Kluyveromyces spp.）、蓝状菌属（Talaromyces spp.）、酒香酵母属 （Brettanomyces spp.）、管囊酵母属（Pachysolen spp.）和德巴利酵母属 （Debaryomyces spp.），但不限于此。

酵母优选为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕赤酵母（Pichia  pastoris）、汉逊酵母（Hansenula polymorpha）、脆壁克鲁维酵母 （Kluyveromyces fragilis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）或栗酒 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe），且最优选为酿酒酵母或毕赤酵母。

在本发明中，当宿主细胞是真核细胞时如酵母，可进行直接显微注射 [Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980)]，磷酸钙沉淀[Graham,F.L.等,Virology, 52:456(1973)]，电穿孔[Neumann,E.等,EMBO J.,1:841(1982)]，脂质体介 导的转染[Wong,T.K.等,Gene,10:87(1980)]，DEAE-葡聚糖处理[Gopal,Mol. Cell Biol.,5:1188-1190(1985)]和基因枪法[Yang等,Proc.Natl.Acad.Sci., 87:9568-9572(1990)]用于携带HPV L1基因的载体转化真核细胞。同时，当 宿主细胞是真核细胞时，可进行氯化钙法[Cohen,S.N.等,Proc.Natl.Acac. Sci.USA,9:2110-2114(1973)]，hanahan法[Cohen,S.N.等,Proc.Natl.Acac. Sci.USA,9:2110-2114(1973),Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983)] 及电穿孔法[Dower,W.J.et al.,Nucleic.Acids Res.,16:6127-6145(1988)]用 于携带HPV L1基因的载体转化原核细胞。

本发明中用于酵母培养的培养基是培养HPV L1蛋白的合适培养基，且 所述合适的培养基可根据宿主细胞类型进行选择。根据优选的实施方式，可 使用培养酵母的常规培养基，且培养基类型不限定为具体培养基。例如，可 使用含有酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖/右旋糖的YPD培养基或其改良培养 基，且作为YPD培养基的碳源，可使用除葡萄糖外还包括半乳糖的YPDG 培养基。

通常使用生物反应器在有氧条件下诸如肉汤培养或发酵进行细胞培养。 培养温度优选为15℃至40℃之间，培养时间通常为5至7小时，但培养时 间可根据培养条件及需求改变。优选地，培养基中的pH要维持在3.0至9.0 之间。可通过加入有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙及氨等调节培养基的 pH。在发酵过程中可加入诸如氨苄青霉素或四环素的抗生素。

本发明中从培养细胞中分离表达的HPV L1蛋白的方法可使用常规的分 离和纯化方法进行。例如，使用硫酸铵或PEG沉淀的L1蛋白的溶解性分馏、 超滤、色谱分馏（根据大小、电荷、疏水性或亲和性的分馏方法）、透析分 馏及其他方法，且上述方法的组合主要用于分馏和纯化。优选地，可通过[H.J. Kim等,Protein Expr.Purif.70(2010)68-74]中列举的方法进行从培养细胞中 分离表达的HPV L1蛋白的方法。

本发明的方法可应用到各种用于培养重组蛋白的细胞培养方法，例如， 分批培养、连续培养、补料分批培养，但不限于此。

有益效果

本发明涉及一种提高HPV L1蛋白产量的方法，其包括在含有高浓度总 碳源的培养基中培养表达HPV L1蛋白的细胞的步骤。根据使用本发明含有 高浓度碳源的培养基的培养方法，不仅HPV L1蛋白的产量显著提高，而且 最终回收的HPV L1VLPs的免疫原性也得到了提高。

附图说明

图1a示出了HPV16L1的纯化过程。

图1b示出了本发明中使用的碳源的组分。比较了根据碳源浓度的表达 的HPV16L1蛋白的量与纯化后最终回收的L1蛋白的量。黑色块中碳源 的组分是表示纯化后最终回收的L1蛋白的量的组分。

图2a是根据碳源组分的表达HPV16L1蛋白的细胞生长的测量结果。

图2b示出了根据碳源组分的每个细胞中HPV16L1蛋白表达水平的 测量结果。使用微管蛋白作为内对照（图2b），并进行如实施例1的方法 中所述的蛋白质印迹分析。

图3a是根据碳源组分的HPV16L1蛋白的体积产量（volumetric yield） 的测量结果。为了测量L1蛋白的体积产量，产生L1蛋白的酿酒酵母在50ml  YPDG培养基中培养。在培养时间为48小时，96小时及144小时时分别收 集每种碳源条件的培养液1ml，并使用0.2ml裂解缓冲液[20mM磷酸钠、 150mM NaCl、1.7mM EDTA pH7.2+0.01%吐温80]裂解细胞。使用蒸馏 水（DW）以1:50的比例稀释细胞裂解物，并且每种稀释液加样10μL进行 电泳，然后使用蛋白质印迹分析方法检测L1蛋白条带。

图3b是表示从在合适的总碳源条件下在稳定期培养144小时的细胞中 获得的HPV16L1蛋白的体积产量的图表。L1蛋白的体积产量表示为从培 养的HPV16L1蛋白的条带强度推断出的相对值，葡萄糖(%)与半乳糖 (%)的比例为6:6时设定为100%。从两个独立的实验中得到这个实验的结果， 且体积产量表示为平均值±标准偏差(SD)。

图4a是分别从由4%，4.5%，5%，5.5%和6%的总碳源组成的培养条件 下获得的HPV16L1蛋白的体积产量的测量结果。为了研究根据总碳源浓 度（范围为4%至6%）的表达的L1蛋白的量，将培养基中的总碳源浓度配 制为4%，4.5%，5%，5.5%或6%。将每种总碳源组分中的葡萄糖与半乳糖 的比例设定为1:1。因此，这些培养基中葡萄糖(%)与半乳糖(%)的比例分 别为2:2、2.25:2.25、2.5:2.5、2.75:2.75和3:3。当600nm下光密度达到30 （稳定期）时收集培养基中的细胞，并使用0.2ml裂解缓冲液[20mM磷酸 钠、150mM NaCl、1.7mM EDTA pH7.2+0.01%吐温80]裂解细胞。使用 蒸馏水（DW）以1:50的比例稀释细胞裂解物后，每种稀释液加样10μL进 行电泳，然后使用蛋白质印迹分析方法检测L1蛋白条带。

图4b示出了图4a的蛋白质印迹的HPV16L1蛋白强度图的结果。L1 条带强度表示为将6%总碳源条件下的L1条带强度设定为100%时推断出 的相对值。

图5a示出了根据碳源组分的HPV16L1蛋白的纯度。在稳定期（A600: 30-47）收集细胞，并纯化L1蛋白。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析最 终回收的L1。

图5b示出了从150ml YPDG培养基培养至稳定期（600nm:OD30– 47）的细胞中回收的HPV16L1蛋白的纯化的量。从两个独立实验中得到结 果，且L1蛋白的量表示为平均值±标准偏差。

图6a示出了在补料分批培养中通过补给半乳糖提高HPV16L1蛋白的 表达。生产HPV16L1蛋白的酿酒酵母在含有7%葡萄糖和1%半乳糖的 培养基中培养144h。然后向培养基中加入半乳糖以在144h，169h和192h 时半乳糖终含量达到1.4%，并继续培养细胞至216h。培养后，通过蛋白质 印迹检测HPV16L1蛋白。

图6b是示出了图6a的蛋白质印迹上HPV16L1蛋白的条带强度的图 表。HPV16L1蛋白的条带强度表示为将细胞培养216h的L1蛋白的条带 强度设定为100%时推断出的相对值。

图7示出了由细胞纯化的HPV16L1蛋白的纯化结果，所述细胞在总碳 源条件为葡萄糖与半乳糖的比例为1:1下，由2%，4%，6%或8%总碳源组 成的培养基中培养至稳定期（A600:OD=18-38）。证实了当细胞在含有超 过6%总碳源的培养基中培养时，生成的L1蛋白的量显著增加。

图8a示出了从含有2%，4%，6%和8%总碳源的培养基中最终回收的 HPV16L1蛋白的纯度和浓度的测量结果，以确定是否为小鼠免疫接种注射 了相同数量的HPV16L1蛋白。将通过Bradford蛋白分析定量的300ng, 150ng或75ng的HPV16L1蛋白加样至12%聚丙烯酰胺的每个孔中，通过 银染分离并可视。已确定从含有2%，4%，6%或8%总碳源的培养条件下获 得的L1蛋白的纯化的纯度是相同的，且定量蛋白的浓度是准确的。因此， 已确认等量的纯化的从含有2%，4%，6%和8%总碳源的培养基条件获得的 L1蛋白用于小鼠免疫接种。

图8b示出了抗-HPV16L1IgG抗体滴度和抗-HPV16中和抗体滴度， 其在每剂量10ng HPV16L1蛋白免疫小鼠三次后测量，且纯化的HPV16L1 蛋白分别从含有2%，4%，6%和8%总碳源的培养条件下获得。然而，由含 有2%和4%总碳源的培养基条件纯化的HPV16L1蛋白示出了低于3200 的抗-HPV16L1IgG抗体滴度值，由含有6%和8%总碳源的培养基条件 纯化的HPV16L1蛋白示出了51200和512000的滴度值。因此，6%和8% 碳源条件下的抗-HPV16L1IgG滴度分别为2%和4%碳源条件下的抗 -HPV16L1IgG滴度的16倍和160倍。同样地，在中和抗体滴度中也观察 到抗-HPV16L1IgG滴度的这些差异。据实验证实，当使用含有超过6%碳 源的培养条件时，HPV16L1蛋白的免疫原性显著提高。

图9示出了在对比方式下根据碳源组分的HPV18L1蛋白表达方式的 测量结果。细胞在含有2%，4%，6%或8%总碳源的培养基中培养至稳定期 （A600OD:22–40），其中葡萄糖与半乳糖的比例设定为1:1。通过蛋白质 印迹分析确定由培养的细胞表达的HPV18L1蛋白的量。已证实，相比于 2%或4%碳源的条件，超过6%碳源的条件下，HPV18L1蛋白的表达提高。

图10a示出了通过蛋白质印迹分析证实的超过6%碳源条件对L1蛋白 表达的影响的结果。测量从4%，4.5%，5%，5.5%和6%总碳源获得的HPV18 L1蛋白的体积产量。在每种培养条件下葡萄糖与半乳糖的比例为1:1。细胞 培养至稳定期并收集，使用0.2ml裂解缓冲液[20mM磷酸钠、150mM  NaCl、1.7mM EDTA pH7.2+0.01%吐温80]裂解细胞。使用蒸馏水（DW） 以1:50的比例稀释细胞裂解物，并且每种稀释液加样10μL进行电泳，然后 使用蛋白质印迹分析L1蛋白条带。

图10b是示出了图10a的蛋白质印迹的L1蛋白的相对强度的图表。将 含有6%碳源的培养条件的L1条带强度设定为100%，并表示为相对值。 这些结果表明培养基中总碳源浓度在4%至6%范围增加时L1蛋白表达成比 例提高。

图11a示出了在含有2%，4%，6%和8%总碳源的培养条件下表达后最 终纯化的HPV18L1蛋白数量的比较结果。在L1蛋白纯化后，通过Bradford 蛋白分析定量每种碳源条件下的总产物，并在每孔中加样500ng或250ng 蛋白并检测。未检测出从含有2%和4%总碳源条件下获得的L1蛋白条带， 而含有6%和8%总碳源的条件下获得的HPV18L1蛋白清晰地检测为55 kDa的L1蛋白条带。

图11b是示出了图11a的蛋白质印迹中加样500ng蛋白的L1蛋白条带 的相对值的图表。将8%总碳源培养基条件下的L1蛋白条带的强度设定为 100%，并推断出相对值。已证实，超过6%的高浓度碳源应包含在培养基中 以高产量地纯化HPV18L1蛋白。

图11c示出了从4%和8%总碳源的培养基获得的HPV18L1蛋白的纯 化结果，葡萄糖(%)与半乳糖(%)的比例设定为2:2或7:1以包含4%和 8%总碳源。将每种条件下的细胞培养144h，补充半乳糖以使144h时半乳糖 的终浓度为1.4%，并培养继续至168h。

图12a示出了随着培养基中总碳源浓度的增加，HPV58L1蛋白的体积 产量。培养细胞至稳定期（A600OD:27-38）。

图12b是当细胞在含有2%，4%，6%或8%总碳源的条件下培养时将表 达的L1蛋白的量表示为条带强度的图表。当将8%总碳源条件下的L1条带 强度设定为100%时，每种培养条件下L1条带强度表示为相对值。如结果 所示，当培养基中的碳源含量超过6%时，表达的HPV58L1蛋白的量显著 增加。

图13a示出了含有4%，4.5%，5%，5.5%或6%碳源的培养基产生的 HPV58L1蛋白的体积产量。每种培养条件下的葡萄糖与半乳糖的比例为 1:1。

图13b是示出了图13a的HPV58L1蛋白的条带强度的图表。将含有 6%碳源的培养基获得的L1蛋白的条带强度设定为100%。

图14a示出了通过纯化从含有2%，4%，6%或8%总碳源的培养条件回 收的L1蛋白的纯化比较结果。为了纯化HPV58L1蛋白，将细胞培养至稳 定期（A600OD:29-34）。在每种培养条件下纯化L1蛋白后，使用Bradford 蛋白分析定量L1蛋白，每孔加样300ng或150ng蛋白并进行SDS-PAGE。 分离的蛋白通过银染可视。

图14b示出了根据总碳源含量的HPV58L1蛋白的纯化产量。如结果 所示，证实了当HPV58L1蛋白从含有超过6%碳源的培养条件下获得时， 最终纯化产量显著提高。

具体实施方式

在下文中，将说明本发明的优选实施方式以更好地理解本发明。然而， 本文中提到的描述只是更好理解的实施例，不限定本发明的范围。

实施例

实施例1：HPV16L1蛋白的制备

实验方法

1.细胞的制备及培养

设计编码HPV16L1蛋白的多核苷酸序列，其表达野生型氨基酸序列， 同时缩小L1蛋白的mRNA的二级结构[23]。通过蓝鹭生物技术（Blue Heron  Biotechnology）（USA）合成多核苷酸，并且连接到质粒YEGα-MCS中。 使用由上述方法构建的YEGα-MCS-HPV16L1转化酿酒酵母Y2805。将转化 子涂抹到“SD-ura”平板上培养4或5天，SD-ura是不含尿嘧啶的完全合成 培养基。将单菌落接种到SD-ura普通肉汤培养基中并培养2天。为了由 GAL10启动子表达HPV16L1蛋白，上述培养的转化子进一步在含有1%酵 母提取物（Duchefa,荷兰）、2%蛋白胨（Duchefa）和不同比例的葡萄糖 （Duchefa）/半乳糖（Duchefa）的YPDG培养基中培养。当在600nm测量 光密度时，在SD-ura培养液中培养的细胞的光密度达到0.6。10倍稀释的 SD-ura肉汤培养物接种到含有50ml或150ml YPDG培养基的烧瓶中，并 在30℃下，以230rpm振荡培养一定时间。在光密度600nm测定细胞密度。

2.HPV16L1的纯化

如文献[13]所述纯化HPV16L1蛋白。如图1a所示，用玻璃珠（BioSpec  Products,OK,USA）使细胞破碎，并且去除细胞碎片。在40%饱和硫酸铵中 使HPV16L1蛋白沉淀，并且通过PBS（磷酸盐缓冲的生理盐水）+0.01%吐 温80透析沉淀的蛋白。使用缓冲液[10mM磷酸钠7.2,150mM NaCl+ 0.01%吐温80]将蛋白浓度调整到5mg/ml，悬浮液在室温下保持12小时。 去除沉淀的杂质蛋白后获得的样品通过用于阳离子交换色谱法的结合缓冲 液[PBS+0.37M NaCl+0.01%吐温80,NaCl终浓度，0.5M]透析。使用上 述结合缓冲液平衡填充有4ml的P-11磷酸纤维素树脂(P-11)的柱，并且将 透析的样品加载到柱上。柱用6倍柱体积的结合缓冲液洗涤，接着用含有 0.6、0.7、0.8、0.9和1M NaCl的缓冲液洗脱。收集洗脱的组分，并使用 Amicon Ultra-4（Millipore,USA）进行浓缩。

3.蛋白浓度的测定

用牛血清白蛋白（BSA;Pierce,USA）作为标准物，使用Bio-Rad Bradford 蛋白分析试剂盒（Bio-Rad实验室,USA）测定蛋白质浓度。

4.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹

根据Laemmli[24]的方法进行SDS-PAGE，并且根据文献[25]所描述的 进行蛋白质印迹。使用兔抗-HPV16L1血清作为一级抗体，并使用HRP-共 轭的羊抗兔IgG多克隆抗体（Pierce,USA）[13]作为二级抗体检测HPV16L1 蛋白。使用鼠抗-微管蛋白多克隆抗体和HRP-共轭的羊抗鼠IgG多克隆抗体 （Pierce,USA）检测微管蛋白。使用NIH开源软件图像J测定条带强度，并 且根据本领域已知的方法进行计算。

5.纯化的HPV16L1的免疫原性和免疫应答的评价

使用六周龄BALB/c小鼠（Orientbio,韩国）评价HPV16L1蛋白的免 疫原性。小鼠在适应环境一周后，用L1蛋白进行免疫。通过皮下注射对小 鼠进行免疫，并且每隔两周进行一次免疫，共免疫三次。对小鼠施用的剂量 为每剂量10ng的L1蛋白和200μg的氢氧化铝（Sigma,USA）。为了使 用相同数量的纯化的HPV16L1蛋白对小鼠进行免疫，根据本领域公开的 蛋白定量法和SDS-PAGE法检测L1蛋白的纯度和浓度。第三次免疫10天 后，通过尾静脉穿刺收集血液，并且测定小鼠血清的抗HPV16L1IgG滴度 和中和活性。使用ELISA（酶联免疫吸附测定）和基于假病毒的中和试验测 定小鼠血液中的抗HPV16L1IgG滴度和中和活性[Kim H.J.等,PLoS One. 2012;7(4):e35893.Epub2012April26;The choice of resin-bound ligand affects  the structure and immunogenicity of column-purified human papillomavirus type 16virus-like particles]。

6.统计分析

通过双尾Student's t检验确定不同组之间的统计学上的差异性显著性。 当P值小于0.05时认为是统计学上显著的。

实验结果

1.根据碳源浓度的细胞生长率和每个细胞中的HPV16L1蛋白的表达 水平的比较

为了研究总碳源浓度对HPV16L1蛋白表达和生产的影响，比较了根据 碳源浓度的酿酒酵母的生长与每个细胞中HPV16L1蛋白的表达水平。作为 碳源的培养基组合物的葡萄糖(%)与半乳糖(%)的比例为1:1至6:6，然后 纯化从上述培养条件下表达的L1蛋白（参见图1b）。结果，如图2a所示， 在144个小时的培养期间，细胞的终密度表现出随着葡萄糖和半乳糖的总和 的浓度增加而增加的趋势，葡萄糖和半乳糖是培养基中包含的总碳源。在每 种碳源条件下培养的细胞在第0小时到第120小时培养之间显示出对数期的 生长，120小时之后，细胞的生长率下降，并表现为稳定期（参见图2a）。

为了根据碳源浓度，研究每个细胞中HPV16L1蛋白表达量，加载了相 同量的细胞裂解物蛋白，并使用蛋白质印迹比较L1蛋白的量。据证实，在 葡萄糖(%)与半乳糖(%)的比例为3:3、4:4、5:5和6:6的情况下，L1蛋白 的表达水平维持在稳定期（直到第144小时），而当葡萄糖与半乳糖的比例 为1:1和2:2时，培养96小时之后，L1蛋白的表达水平显著下降（参见图 2b）。该结果表明当培养基中含有超过6%的总碳源时，每个细胞中表达的 L1蛋白的量稳定地维持在稳定期。

2.根据碳源浓度的HPV16L1蛋白的体积产量的比较

对体积产量进行比较，从而根据碳源浓度比较存在于培养基中的HPV16 L1蛋白的量。体积产量表明存在于固定培养体积中的L1蛋白的量。如图 3a所示，当葡萄糖(%)与半乳糖(%)比例为1:1时，随着细胞密度的增加， L1蛋白的体积产量下降，并且当上述比例为2:2时，随着细胞密度的增加， 产量有限制地增加。然而，据证当葡萄糖(%)与半乳糖(%)比例超过3:3 时，随着细胞密度的增加，体积产量也增加（参见图3a和3b）。如图2b 中所证实的，这似乎是因为在总碳源超过6%时，HPV16L1蛋白的表达水平 稳定地维持在稳定期。因此，在培养基中需要超过6%的总碳源以使HPV16 L1蛋白高效表达。

上述图3a和3b的结果表明，与总碳源浓度为4%比较，总碳源浓度超 过6%时显著增加表达的HPV16L1蛋白的量。随后，详细研究了总碳源浓 度范围在4%到6%之间变化时，表达的HPV16L1蛋白的量是如何改变的， 分别测定了在含有4%、4.5%、5%、5.5%和6%的总碳源的培养基中表达的 HPV16L1蛋白的量。如图4a和图4b中所示的结果，我们可以发现总碳 源浓度范围在4%到6%之间时，HPV16L1蛋白的表达量随着总碳源浓度 增加而增加。该结果证实了组合物中超过6%的碳源或更多的碳源使HPV16 L1蛋白的表达显著提高。

3.根据碳源浓度的HPV16L1蛋白纯度和产量的比较

比较从细胞中通过纯化回收的HPV16L1蛋白的纯度，所述细胞在葡 萄糖(%)与半乳糖(%)的比例分别为1:1、2:2和4:4的培养基中进行培养直 到达到稳定期。如图5a的结果所示，每种条件下的HPV16L1蛋白在完全 纯化后，显示出至少超过92%的纯度。此外，证实了当比较从150ml培养 基培养的细胞中纯化的HPV16L1蛋白的量时，HPV16L1蛋白的产量随 着总碳源浓度的增加而增加（参见图5b）。该结果表明培养基中的总碳源 浓度显著影响HPV16L1蛋白的总产量。总之，在总碳源超过6%的条件下， L1蛋白的表达和总产量均增加。

4.随着半乳糖的添加，HPV16L1蛋白表达水平提高

在培养基中培养表达HPV16L1蛋白的酿酒酵母144小时，所述培养基 中葡萄糖与半乳糖的比例为7:1，并且在第144小时、168小时和192小时 的培养点向细胞培养物中加入半乳糖。加入的半乳糖使培养基中的半乳糖的 终浓度达到1.4%，继续培养细胞到第216小时。如图6a和6b所示，证实 了HPV L1蛋白的表达量在补充半乳糖后显著增加。这个结果表明，当向碳 源超过6%的培养基中增加碳源时，L1蛋白的表达水平可以进一步提高。

5.随着半乳糖的添加，HPV16L1蛋白的纯化产量提高

产生HPV16L1蛋白的酿酒酵母在葡萄糖(%)与半乳糖(%)的比例 为7:1的培养基中培养96小时，然后加入半乳糖以使培养基中的半乳糖的 终浓度为1.4%，继续培养细胞到第144小时。作为纯化细胞内HPV16L1蛋 白的结果，获得了1.5mg的HPV16L1蛋白（参见下表1）。L1蛋白的量 大约是不添加半乳糖的培养基（葡萄糖(%)与半乳糖(%)的比例为7:1）中 获得的2倍。该结果表明，当细胞在总碳源浓度超过6%的条件下培养，然 后向培养基加入半乳糖时，L1蛋白表达水平的提高能够导致L1蛋白的终纯 化产量提高。

【表1】

6.根据碳源浓度的HPV16L1蛋白的免疫原性的比较

产生HPV16L1蛋白的酿酒酵母在含有2%、4%、6%或8%总碳源的培 养基中培养直到稳定期。为了纯化HPV16L1蛋白，细胞在150ml的上述 培养条件下分别培养。当在600nm测定培养的细胞时，每单位体积的细胞 密度范围为18～38（图7）。图7示出了在含有2%、4%、6%和8%总碳源 的培养基中分别培养的HPV16L1蛋白，通过纯化后最终回收的L1蛋白 的量。如上所述，同样地，证实了当细胞在含有超过6%碳源的培养基中进 行培养时，通过纯化最终回收的HPV16L1蛋白的量显著增加。该结果更 清楚的表明需要超过6%的碳源以高效纯化HPV16L1蛋白。

为了定量评估通过纯化从每种培养基中回收的HPV16L1蛋白，在 SDS-PAGE上加载并确定相同量的蛋白。如图8a的结果所示，证实了从含 有2%、4%、6%和8%碳源的培养基中获得的HPV16L1蛋白的纯度和量相 同。因此，证实了使用等量的HPV16L1蛋白对小鼠进行免疫，该等量的 蛋白来自含有2、4、6和8%碳源的培养基。

图8b是在使用每剂量10ng的HPV16L1蛋白免疫三次后，测定的抗 HPV16L1IgG抗体滴度和抗-HPV16中和抗体滴度的结果。如图8b所示， 通过免疫接种在含有2%和4%总碳源的培养基中获得的HPV16L1蛋白 诱导的抗HPV16L1IgG滴度低于3200，而在含有6%和8%总碳源的培养基 中获得的HPV16L1蛋白诱导的抗HPV16L1IgG滴度分别是51200和 512000。此外，通过从含有6%和8%总碳源的培养基中获得的L1蛋白免疫 的小鼠血清被证实发挥了超过60%的中和活性，而通过从含有2%和4%总 碳源的培养基中获得的L1蛋白免疫的小鼠血清显示出低的中和活性。因此， 证实了从含有超过6%总碳源的培养基中获得的L1蛋白的免疫原性显著高 于从含有低于6%总碳源的培养基中获得的L1蛋白的免疫原性。

实施例2：HPV18L1蛋白的制备

实验方法

通过蓝鹭生物技术（Blue Heron Biotechnology,Inc.,USA）合成为用于 酿酒酵母的密码子而优化的HPV18L1蛋白的DNA(MO)序列。如先前 [H.J.Kim,S.J.Lee,H.-J.Kim,J.Biotechnol.150(2010)31-36]所报道的进行 HPV18L1蛋白的细胞系培养和制备。如实施例1的HPV16L1蛋白的相 关操作方法，进行表达HPV18L1蛋白的细胞培养、HPV18L1蛋白的纯化、 蛋白浓度的测定、SDS-PAGE和蛋白质印迹。

实验结果

1.根据碳源浓度的HPV18L1蛋白的体积产量的比较

在含有2%、4%、6%或8%总碳源的培养基中培养产生HPV18L1蛋白 的酿酒酵母144小时稳定期，所述培养基中的葡萄糖与半乳糖的比例为1:1， 并比较细胞内表达的HPV18L1蛋白纯化后回收的L1蛋白的量。如图9所 示，当总碳源浓度超过6%时，HPV18L1蛋白的产生量显著增加。该结果 表明，当细胞在含有超过6%碳源的培养基中培养时，细胞高效产生HPV18 L1蛋白。

为了详细研究总碳源浓度范围在4%到6%之间变化时，表达的HPV18 L1蛋白的量是如何改变的，分别测定了在含有4%、4.5%、5%、5.5%和6% 的总碳源的培养基中表达的HPV18L1蛋白的水平。在每种碳源条件下，葡 萄糖与半乳糖的比例为1:1，并且将细胞培养到稳定期。

如图10a和图10b所示，证实了总碳源浓度范围在4%～6%时，随着总 碳源中碳源浓度的增加，HPV18L1蛋白的表达量按比例增加。这些结果进 一步证实了超过6%碳源的组合物使HPV18L1蛋白的表达提高。

2.根据碳源浓度的HPV18L1蛋白纯化产量的比较

图11a是从培养的细胞中纯化的HPV18L1蛋白的比较结果，所述细胞 是在含有2%、4%、6%和8%总碳源的培养基中培养，直到稳定期。为了纯 化HPV18L1蛋白，在每种条件培养基中培养细胞直到稳定期，每种培养基 的体积是150ml。为了确定最终纯化产物的HPV18L1蛋白，使用Bradford 蛋白分析测定蛋白浓度，然后将500ng或250ng的蛋白加载到SDS-PAGE 凝胶上并进行检测。证实了在含有2%、4%、6%和8%总碳源的培养基中 的定量的蛋白的总量分别为0.4mg、0.4mg、0.4mg和0.4mg，表明这些量 是相同的。但是仅在6%和8%总碳源的条件培养基中清楚地检测到55kDa 的HPV18L1蛋白条带。

根据总碳源含量的HPV18L1蛋白的条带强度具体如图11b所示。图 11b示出了每孔加载500ng蛋白时的L1蛋白的条带强度，并且条带强度表 示为将8%碳源条件下的L1蛋白条带的强度设定为100%时推断出的相对 值。根据结果，在含有超过6%总碳源的培养条件下纯化的HPV18L1蛋白 的量显著高于在含有2%和4%的总碳源的培养条件下纯化的HPV18L1蛋 白的量。

3.随着半乳糖的添加，HPV18L1蛋白的纯化产量提高

在培养基中培养产生HPV18L1蛋白的酿酒酵母144小时，所述培养基 中葡萄糖（%）与半乳糖（%）的比例为2:2或7:1。在第144小时的培养时 间点向培养物中加入半乳糖，以使培养基中半乳糖的终浓度达到1.4%，继 续培养细胞到第168小时。从分别在两种培养条件下培养的细胞中纯化 HPV18L1蛋白，并比较纯化的L1蛋白的量。结果，只有从葡萄糖（%） 与半乳糖（%）的比例为7:1的培养基中获得的HPV18L1蛋白是纯的，而 从葡萄糖（%）与半乳糖（%）的比例为2:2的培养基中获得的HPV18L1蛋 白几乎不是纯的（参见图11c和表2）。该结果表明以7:1的条件生产的HPV 18L1蛋白是易于纯化和收集的形式。总之，我们发现在总碳源超过6%的 培养条件下，示出了L1蛋白的高表达水平，并且将细胞在总碳源为高比例 葡糖糖和低比例半乳糖的培养基中培养到稳定期时的L1蛋白的纯化产量最 高。

【表2】

表2示出了随着半乳糖的添加，HPV18L1蛋白纯化的结果。产生HPV 18L1蛋白的酿酒酵母在150ml培养基中培养，其中葡萄糖(%)与半乳糖(%) 的比例分别为2:2和7:1。在两种条件下培养的细胞均培养144小时，然后 向培养物中加入半乳糖，使其终浓度达到1.4%，并将细胞继续培养到168 小时。

实施例3：HPV58L1蛋白的制备

实验方法

1.细胞株的制备

通过蓝鹭生物技术（Blue Heron Biotechnology,Inc.,USA）合成为用于 酿酒酵母的密码子而优化的HPV58L1蛋白的DNA(MO)序列。构建 HPV58L1MO基因的上游和下游，使其分别包含Hind Ⅲ和Sal I位点。将 合成的HPV58L1MO基因插入到YEGα-MCS的Hind Ⅲ和Sal I位点之间 的部分，获得命名为YEGα-MCS-HPV58L1MO的质粒。使用先前[H.J.Kim, S.J.Lee,H.-J.Kim,J.Biotechnol.150(2010)31-36]所述的醋酸锂方法转化酿 酒酵母Y2805。如实施例1的HPV16L1蛋白的相关操作方法，进行表达 HPV58L1蛋白的细胞培养、HPV58L1蛋白的纯化、蛋白浓度的测定、 SDS-PAGE和蛋白质印迹。

实验结果

1.根据碳源浓度的HPV58L1蛋白表达量的比较

图12a示出了产自培养物中的L1蛋白的体积产量的比较结果，其中表 达HPV58L1蛋白的酿酒酵母分别通过蛋白质印迹在含有2%、4%、6%和 8%总碳源的培养基中培养，直到稳定期。关于表达趋势，证实了在含有超 过6%碳源的培养基条件下的L1蛋白的表达显著增加，其类似于HPV16和 HPV18L1蛋白。图12b示出了图12a的HPV58L1蛋白的相对条带强度。 为了比较HPV58L1蛋白的相对表达量，将8%碳源条件下的HPV58L1蛋 白的条带强度设定为100%，并推算出相对值。

为了详细研究总碳源浓度在4%到6%的范围之间变化时，HPV58L1蛋 白的表达量是如何改变的，分别将碳源含量配制为4%、4.5%、5%、5.5%或 6%。在每种碳源条件下，葡萄糖与半乳糖的比例为1:1。图13a示出了当培 养基中的碳源含量分别为4%、4.5%、5%、5.5%和6%时，使用蛋白质印迹 得出的HPV58L1蛋白的体积产量的分析结果。图13b示出了图13a的HPV 58L1蛋白的条带强度。为了比较条带强度之间的差异，将6%总碳源条件 的L1蛋白的条带强度设定为100%（图13b）。研究结果表明总碳源浓度为 4～6%范围时，随着碳源浓度的增加，L1蛋白的体积产量按比例增加。总之， 这些结果表明当在含有超过6%的碳源的培养基中培养细胞时，HPV58L1 蛋白的表达量显著增加。

2.根据碳源浓度的HPV58L1蛋白纯化产量的比较

为了比较根据碳源浓度的HPV58L1蛋白的纯化产量，纯化HPV58L1 蛋白，并在细胞在培养基中培养至稳定期后进行比较，所述培养基中含有 2%、4%、6%和8%总碳源。在每种培养条件下，葡萄糖与半乳糖的比例是 1:1。当细胞在150ml的培养基中培养至稳定期后纯化HPV58L1蛋白（OD （A600）：29-30），并通过SDS-PAGE确定蛋白量（图14a）。如上所述从 培养的细胞中纯化HPV58L1蛋白，并通过Bradford蛋白分析确定蛋白浓 度。基于定量的蛋白浓度，每孔加载300ng或150ng的蛋白。结果，除了 2%碳源条件下的HPV58L1蛋白的纯化示出弱条带强度之外，其余培养条 件下的HPV58L1蛋白的纯化均示出高纯度。

图14b示出了最终纯化的HPV58L1蛋白的量。从蛋白和SDS-PAGE 定量分析的结果推断出，每种条件下L1蛋白的量。如图14b所示，当培养 基中的总碳源浓度超过6%时，最终回收的HPV58L1蛋白的量显著增加。

虽然本发明已经参照某些典型的实施方式示出并进行了说明，但是本领 域技术人员应当理解在不脱离如所附的权利要求所限定的本发明的范围的 情况下，可以进行各种形式和细节上的改变。

说明书中引用的非专利文献

[1]C.B.Woodman,S.I.Collins,L.S.Young,The natural history of cervical  HPV infection:unresolved issues,Nat.Rev.Cancer7(2007)11-22.

[2]National Cancer Institutue,Women's Health Report,Fiscal Years 2005-2006,NCI Women's Health Report FY2005-2006(2007).

[3]T.Nyari,I.Cseh,M.Woodward,J.Szollosi,M.Bak,J.Deak,Hum. Reprod.16(2001)2235-2237.

[4]T.A.Nyari,L.Kalmar,J.Deak,J.Szollosi,I.Farkas,L.Kovacs,Eur.J. Obstet.Gynecol.Reprod.Biol.115(2004)99-100.

[5]M.J.Conway,C.Meyers,J.Dent.Res.88(2009)307-317.

[6]B.Bishop,J.Dasgupta,M.Klein,R.L.Garcea,N.D.Christensen,R. Zhao,X.S.14Chen,J.Biol.Chem.282(2007)31803-31811.

[7]I.H.Frazer,Gynecol.Oncol.118(2010)S8-11.

[8]V.Madrid-Marina,K.Torres-Poveda,G.Lopez-Toledo,A. Garcia-Carranca,Arch.Med.Res.40(2009)471-477.

[9]M.Deschuyteneer,A.Elouahabi,D.Plainchamp,M.Plisnier,D.Soete, Y.Corazza,L.Lockman,S.Giannini,M.Deschamps,Hum.Vaccine6(2010) 407-419.

[10]National Cancer Institute,Human Papillomavirus(HPV)Vaccines,

[11]L.Schadlich,T.Senger,C.J.Kirschning,M.Muller,L.Gissmann, Vaccine27(2009)1511-1522.

[12]G.Walsh,Biopharmaceutical benchmarks2010,Nat Biotechnol28 (2010)917-924.

[13]H.J.Kim,S.Y.Kim,S.J.Lim,J.Y.Kim,S.J.Lee,H.-J.Kim,Protein  Expr.Purif.70(2010)68-74.

[14]M.Rubio-Texeira,FEMS Yeast Res.5(2005)1115-1128.

[15]M.D.Kim,K.C.Han,H.A.Kang,S.K.Rhee,J.H.Seo,J.Biotechnol. 101(2003)81-87.

[16]J.van den Brink,M.Akeroyd,R.van der Hoeven,J.T.Pronk,J.H.de  Winde,P.Daran-Lapujade,Microbiology155(2009)1340-1350.

[17]E.S.Choi,J.H.Sohn,S.K.Rhee,Appl.Microbiol.Biot.42(1994) 587-594.

[18]J.Whang,J.Ahn,C.S.Chun,Y.J.Son,H.Lee,E.S.Choi,Process  Biochem.44(2009)1190-1192.

[19]N.Hadiji-Abbes,I.Borchani-Chabchoub,H.Triki,R.Ellouz,A. Gargouri,R.Mokdad-Gargouri,Protein Expr.Purif.66(2009)131-137.

[20]J.C.Cook,J.G.Joyce,H.A.George,L.D.Schultz,W.M.Hurni,K.U. Jansen,R.W.Hepler,C.Ip,R.S.Lowe,P.M.Keller,E.D.Lehman,Protein Expr. Purif.17(1999)477-484.

[21]S.N.Kim,H.S.Jeong,S.N.Park,H.-J.Kim,J.Virol.Methods139 (2007)24-30.

[22]D.T.Buonamassa,C.E.Greer,S.Capo,T.S.Yen,C.L.Galeotti,G. Bensi,Virology293(2002)335-344.

[23]H.J.Kim,S.J.Lee,H.-J.Kim,J.Biotechnol.150(2010)31-36.

[24]U.K.Laemmli,Nature227(1970)680-685.

[25]M.A.Park,H.J.Kim,H.-J.Kim,Protein Expr.Purif.59(2008) 175-181.

[26]S.Y.Kim,H.J.Kim,H.-J.Kim,Protein Expr.Purif.76(2011)103-108.

[27]R.Z.Rizk,N.D.Christensen,K.M.Michael,M.Muller,P.Sehr,T. Waterboer,M.Pawlita,J.Gen.Virol.89(2008)117-129.

[28]L.Shi,G.Sanyal,A.Ni,Z.Luo,S.Doshna,B.Wang,T.L.Graham,N. Wang,D.B.Volkin,J.Pharm.Sci.94(2005)1538-1551.

[29]J.J.Carter,G.C.Wipf,S.F.Benki,N.D.Christensen,D.A.Galloway,J. Virol.77(2003)11625-11632.

[30]B.Balasundaram,S.Harrison,D.G.Bracewell,Trends Biotechnol.27 (2009)477-485.

[31]C.B.Buck,C.D.Thompson,Y.Y.Pang,D.R.Lowy,J.T.Schiller,J. Virol.79(2005)2839-2846.

[32]M.J.Conway,S.Alam,E.J.Ryndock,L.Cruz,N.D.Christensen,R.B. Roden,C.Meyers,J.Virol.83(2009)10515-10526.

[33]S.Y.Li,R.Srivastava,S.L.Suib,Y.Li,R.S.Parnas,Bioresour. Technol.102(2011)4241-4250.

[34]C.A.Cardona,O.J.Sanchez,Bioresour.Technol.98(2007)2415-2457.

[35]C.Meyers,M.G.Frattini,J.B.Hudson,L.A.Laimins,Science257 (1992)971-973.

[36]M.A.Ozbun,C.Meyers,J.Virol.71(1997)5161-5172.

[37]H.C.Selinka,T.Giroglou,T.Nowak,N.D.Christensen,M.Sapp,J. Virol.77(2003)12961-12967.

[38]L.de Witte,Y.Zoughlami,B.Aengeneyndt,G.David,Y.van Kooyk, L.Gissmann,T.B.Geijtenbeek,Immunobiology212(2007)679-691.

[39]D.Opalka,K.Matys,P.Bojczuk,T.Green,R.Gesser,A.Saah,R. Haupt,F.Dutko,M.T.Esser,Clin.Vaccine Immunol.17(2010)818-827.

[40]C.Schellenbacher,R.Roden,R.Kirnbauer,J.Virol.83(2009) 10085-10095.

[41]J.Y.Park,H.M.Pyo,S.W.Yoon,S.Y.Baek,S.N.Parz,C.J.Kim,H. Poo,J.Microbiol.40(2002)313-318.

虽然本发明已经参照某些典型的实施方式示出并进行了说明，但是本领 域技术人员应当理解在不脱离如所附的权利要求所限定的本发明的范围的 情况下，可以进行各种形式和细节上的改变。