一种利用超滤纳滤技术精制生物发酵液中聚谷氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用超滤纳滤技术精制生物发酵液中聚谷氨酸的方法，属于生物法合成及提纯技术领域。针对发酵液中目标提取物与杂质分子量的分布特性，结合现代膜分离技术，对不同分子量的γ-PGA进行有效分离，主要步骤为：降低粘度后硅藻土过滤除菌，加热结合超滤除杂蛋白及大分子活性有机物，阳离子交换树脂除金属离子及一些带正电荷杂质，脱色后纳滤除小分子氨基酸、离子杂质，超滤分级提取，得到不同分子量的精制γ-PGA。提取收率稳定在92%以上，高于文献报道最高收率90.6%，超滤纳滤结合技术精制不同分子量的γ-PGA，市场针对性更强，可以做到按需生产，以专业化提高了经济效益。

说明书

技术领域:

本发明属于生物法合成及提纯技术领域，特别涉及一种分离提纯生物发酵液中不同分子 量生物可降解高分子材料——聚谷氨酸的方法。

背景技术:

在环境日益恶劣、资源日益匮乏的今天，寻找一种用途广泛且可以降解的生物高分子材 料就显得尤为重要。γ-聚谷酸(γ-Polyglutamicacid)简写γ-PGA是某些芽孢杆菌 （Bacillus）合成的一种细胞外高分子聚合化合物，它以谷氨酸为唯一单体，是由L一谷氨 酸(L—Glu)、D一谷氨酸(D—Glu)通过酰胺键结合形成的一种多肽分子,γ-PGA在体内被酶分 解为谷氨酸,进入三羧酸循环,无毒副作用,在自然环境中,γ-PGA彻底分解或燃烧后,生成二 氧化碳和水，对环境没有任何污染。因此，γ-PGA是一种极具潜力的高分子材料，利用γ-PGA 制成的水凝胶不仅保留了普通水凝胶材料的基本特性，还具有结构可控性、高吸水性、较高 机械强度、生物可降解性等特性。特别是通过芽孢杆菌发酵生产获得的γ-PGA，其分子链上 有大量活性较高的侧链羧基，具有良好的高吸水性（1：3500，m/v）、生物相容性、生物降 解性、无毒无害等优点，可作为化妆品添加剂、保水剂、高吸水树脂、重金属吸附剂、食品 添加剂、医药载体、组织工程材料等广泛应用于化妆品、食品、农业、医药、合成纤维和涂 膜等领域。

20世纪90年代以来，日本、美国等一些发达国家对γ-PGA的制备和应用的研究十分活 跃，微生物发酵法生产γ-PGA的技术也处在世界的前列，以味之素株式会社、明治制果公司 和广崎大学为代表的国外单位对γ-PGA的性能，合成和应用做了较深入地研究，γ-PGA已有 商业产品，我国在这方面研究的相对较少，中国台湾在γ-PGA发酵生产研究也有很大进展， 中国大陆对γ-PGA大量投产生产的研究还欠缺，尤其是在黏稠的发酵液中，对分子量在一定 范围内的γ-PGA来说，提取γ-PGA的效率只有40～50%，造成大量γ-PGA浪费和损失。

γ-PGA作为一种全天然、多功能性、生物可分解性的生物高分子产品，相对分子质量(Mw) 在10⁴-l0⁶的范围内，可以制成不同相对分子质量的产品应用于各种不同领域。如化妆品级、 食品级的γ-PGA分子量为70万；药品级的分子量是100万；污水处理级的分子量是100万； 土壤、植物调节剂级的分子量20万以下等。

采用酸碱滴定法测定游离型γ-PGA的pKa值，得到γ-PGA的pKa=2.23，该值与谷氨酸 的α-羧基的pKa值大体一致。利用TGA和DSC进行热性质的分析，得出其热分解温度为235.9 ℃，熔点为223.5℃。γ-PGA酸水解后用GITC做衍生化试剂，HPLC测得γ-PGA中D-谷氨酸 和L-谷氨酸的比值稳定在D:L=3:2。一般而言，由芽孢杆菌产生的γ-PGA的平均分子量(Mw) 在10⁴-l0⁶之间，本专利中，用实验室生物发酵法产出γ-PGA的分子量(Mw)分布在5×10⁴-10⁶之间。

膜分离技术利用膜对混合物中各组分的选择透过性来分离、提取、和浓缩目的产物，膜 分离过程在常温下进行，无相变，能耗低，设备简单，操作控制方便，已在化工、医药、轻 工、食品、纺织、电子、冶金等多个领域得到应用。适用于发酵液处理的膜分离技术有微滤、 超滤、纳滤和反渗透。微滤截留0.01～10um以上的粒子，如菌体、细胞、不溶物等，常用超 滤预处理过程；超滤膜截留分子量5000～500000，膜孔径1～20nm，可以截留病毒、蛋白质、 酶、多糖等大分子物质；反渗透只允许溶剂分子通过，盐、氨基酸等小分子物质也被截留； 纳滤膜平均孔径2nm，截留组分可小到抗生素、合成药、染料、二糖等，允许水、无机盐、 有机物等小分子物质通过，截留性能介于超滤和反渗透之间。膜材料可分为高分子膜、无机 膜和液体膜，常用的是高分子膜，其次是无机膜。膜结构可分为对称膜和非对称膜，超滤通 常为非对称膜，非对称膜中起截留作用的是致密的表面皮层，其厚度仅0.1～15um，在皮下 有多孔网状结构和支撑层，支撑层厚度在50～250um，这样既保证对大分子物质的有效截留， 又降低分离操作时膜对阻力。提高了膜通量，也具有了一定的机械强度。

γ-PGA是一种胞外产物，其发酵液很黏，用一般的离心法去除菌体很难，且不适用于工 业大规模应用。为了降低去除菌体的能量消耗和节省用于沉淀的有机溶剂用量，DO.J.H等对 原工艺进行优化，提出了一种高效分离γ-PGA的方法。该方法由两步组成：首先调PH至3.0 使粘度降低，再离心除菌体，这样使得离心能量降为原来的17%；然后对去菌液回调至PH5.0， 用中空纤维膜进行过滤，使得发酵液上清由原来的20g/L，浓缩至60g/L，提取所需的乙醇用 量减少为原来的1/4，降低了提取γ-PGA的成本。但是这种方法，因为没有除去其他杂质， 所以截留过程对纤维膜的要求较高，而且离心除菌难以放大工业生产。专利《从发酵液中分 离提取γ-聚谷氨酸的方法》，申请号201010188232.6中提到，用超滤膜除去小分子色素和杂 质，但提取工艺中多次调节PH，会引入大量离子，用蛋白酶酶解少量蛋白质方法也同样引入 杂质，没有综合利用膜进行提取，不适合放大生产。专利《γ-聚谷氨酸的一种分离纯化方法》， 申请号201210396366.6中提到，活性炭和硅藻土抽滤后，直接用来超滤浓缩，这种处理方式 在工业上放大很容易造成堵膜现象，而洗膜程序使提取步骤繁琐，该工艺不宜放大工业生产。 专利《一种γ-聚谷氨酸的提取方法》，申请号201010177020.8中提到，酶解蛋白后用2～3 倍乙醇进行醇沉，在用超滤浓缩法进行除杂，最后冻干，此工艺中，用到大量乙醇，增加工 业应用的危险性，也并没有提到根据γ-PGA分子量不同而进行有效提取。文献报道，提取不 同分子量的γ-PGA大多是改变发酵条件来尽量生产分子量接近的γ-PGA，但实际生产工艺中， γ-PGA分子量较大，很难在生产中精确控制γ-PGA分子量，往往产出γ-PGA是在一定的分 子量范围内分布，而传统提取工艺中，未有涉及在同一批发酵液中根据分子量不同而精确提 取γ-PGA，因此，在提取工艺中，发酵液粘度的降低，同时后续分离中如何根据分子量不同 而高效提取γ-PGA、降低成本一直是困扰地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）发酵制备γ-PGA 的主要问题，需高度重视。

发明内容

本发明的目的是提供一种从γ-PGA发酵液中高效提取γ-PGA的方法，所用菌种为地衣芽 孢杆菌，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC3336。具体 见天津北洋百川生物技术有限公司申请号为200910228297的发明专利《惰性载体固态发酵法 生产γ-聚谷氨酸的方法》，采用的发酵方法为该公司发明的一种高效低耗的发酵方法，具体 见申请号201110216717.6的发明专利《一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法》。发酵液中主要杂 质是大分子蛋白（且多属热变性蛋白）、多糖、色素以及一些小分子氨基酸、盐类和其他小分 子有机杂质等,产生γ-聚谷氨酸的分子量(Mw)分布在5×10⁴-5×10⁵之间。本发明针对发酵液 中目标提取物与杂质分子量的分布特性，结合现代膜分离技术，提供一种高效提取γ-PGA的 方法，使γ-PGA总收率大于92%，高于目前文献公布最高水平90.6%，并且对不同分子量的 γ-PGA进行有效分离，根据分子量不同应用在不同领域。传统提取方法中，醇沉步骤乙醇的 使用量一般为物料的4～6倍，本发明降低为2～3倍，，大大减少了有机溶剂的使用，使成本 降低了30%以上，同时也降低了危险度。

一种利用超滤纳滤技术精制生物发酵液中聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：

一、发酵液制备：将编号CGMCC3336的地衣芽孢杆菌发酵培养，得发酵液；

二、发酵液提取

（1）除菌体

将发酵液PH调至3.0，粘度降低至原来的1/6，加入2%-3%(m：v)硅藻土，800目滤布， 板框过滤除菌体，0.22MPa压力，流速30～50ml/min。

（2）除杂蛋白及大分子活性有机物

去除菌体的发酵液调PH6～7，加热升温至90℃保温20min，使蛋白变性，除去热变性 蛋白，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。

（3）阳离子交换树脂除金属离子及一些带正电荷杂质

按发酵液体积30%（v：v）的添加量加入阳离子交换树脂，室温下搅拌，进行静态吸附 杂质30min，经检测，能去除大部分金属离子和带正电荷杂质，离子交换结束后，回调PH至 7，引入少量离子后续纳滤会进行去除。

（4）脱色

加入1%～2%活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色90～120min，抽滤，液体基本澄清无色， 脱色效果显著。

（5）除小分子氨基酸、离子杂质

发酵液稀释2～3倍后过纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸、多肽、寡糖、盐离子等 小分子杂质。

（6）超滤分级提取

采用5万～50万超滤膜对上述处理过的清液进行加压循环超滤浓缩，0.1um中空纤维膜 分离分子量15万上下的γ-PGA，500kDa超滤膜分离分子量35万上下的γ-PGA。分别得到分 子量不同的清液：分子量<15万的γ-PGA清液；分子量在15万～35万的γ-PGA清液，分子 量大于35万的γ-PGA清液。分子量小于15万的γ-PGA进行5kDa超滤浓缩进一步除去小分 子杂质；分子量大于15万的γ-PGA清液进行2～3体积倍醇沉，沉淀物溶解于原体积1～2 倍的水中。将上述溶液分别喷雾干燥，得到精制γ-PGA。

作为上述技术方案的优选方案，本发明利用超滤纳滤技术精制生物发酵液中聚谷氨酸的 方法，包括如下步骤：

一、菌种活化：

将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面 种子。

二、种子培养：

将活化后的斜面种子接入一环装有50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，37℃， 220rpm，培养16个小时到对数生长期。

三、发酵培养：

将种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，220rpm下培养72h，发酵罐为10L， 装液量为60%，当残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时，流加速度为1ml/min。 下罐γ-PGA产量为30g/L～45g/L。

四、发酵液提取

（1）除菌体

将发酵液PH调至3.0，粘度降低至原来的1/6，加入2%-3%(m：v)硅藻土，800目滤布， 板框过滤除菌体，0.22MPa压力，流速30～50ml/min。

(2)除杂蛋白及大分子活性有机物

去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH6～7，加热升温至90℃保温20min，使蛋白变性， 除去热变性蛋白，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。

（3）阳离子交换树脂除金属离子及一些带正电荷杂质

按发酵液体积30%（v：v）的添加量加入阳离子交换树脂，室温下搅拌，进行静态吸附 杂质30min，经检测，能去除大部分金属离子和带正电荷杂质，离子交换结束后，用6M氢氧 化钠回调PH至7，引入少量离子后续纳滤会进行去除。

（4）脱色

加入1%～2%活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色90～120min，抽滤，液体基本澄清无色， 脱色效果显著。

（5）除小分子氨基酸、离子杂质

发酵液稀释2～3倍后过纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸、多肽、寡糖、盐离子等 小分子杂质。

（6）超滤分级提取

采用5万～50万超滤膜对上述处理过的清液进行加压循环超滤浓缩，0.1um中空纤维膜 分离分子量15万上下的γ-PGA，500kDa超滤膜分离分子量35万上下的γ-PGA。分别得到分 子量不同的清液：分子量<15万的γ-PGA清液；分子量在15万～35万的γ-PGA清液，分子 量大于35万的γ-PGA清液。分子量小于15万的γ-PGA进行5kDa超滤浓缩进一步除去小分 子杂质；分子量大于15万的γ-PGA清液进行2～3体积倍醇沉，沉淀物溶解于原体积1～2 倍的水中。将上述溶液分别喷雾干燥，得到精制γ-PGA。

培养基配制方法如下：

（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20，上述组分单位为g/L， pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K₂HPO₄·H₂O0.5，MgSO₄·6H₂O0.5， 上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH₄NO₃4.1、NaCl10、MgSO₄·6H₂O 0.5、CaCl₂·6H₂O1.0、FeCl₃·6H₂O0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭 菌20min。

流加培养基成分：葡萄糖900、NH₄NO₃60、CaCl₂·6H₂O20、FeCl₃·7H₂O0.15，上述组 分单位为g/L，PH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

有益效果：

本发明与现有技术相比：第一，采用板框过滤方法除菌，克服了传统离心法去除菌体困 难的问题，有效降低了发酵法生产γ-PGA过程中，在除菌方面的成本，大大提高了除菌效果， 可有效应用于工业化大生产中；第二，在提取过程中，根据发酵液物质分子不同的特性，进 行离子交换除杂和膜过滤除杂，大大提高提取效果，节能降耗，利于工业化大生产的实现； 第三，超滤纳滤结合技术精制不同分子量的γ-PGA，市场针对性更强，可以做到按需生产， 以专业化提高了经济效益；第四，大大减少了有机溶剂的使用，使成本降低了30%以上，同 时也降低了危险度；第五，采用喷雾干燥技术，得到的γ-PGA为白色粉末，比冻干容易实现， 节省能源，且更高效，外观形态也更好；第六，提取收率稳定在92%以上，高于文献报道最 高收率90.6%。

具体实施方式

实施例1

一、培养基配制：

（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20，上述组分单位为g/L， pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K₂HPO₄·H₂O0.5，MgSO₄·6H₂O0.5， 上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH₄NO₃4.1、NaCl10、MgSO₄·6H₂O 0.5、CaCl₂·6H₂O1.0、FeCl₃·6H₂O0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭 菌20min。

流加培养基成分：葡萄糖900、NH₄NO₃60、CaCl₂·6H₂O20、FeCl₃·7H₂O0.15，上述组 分单位为g/L，PH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

二、菌种活化：

将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面 种子。

三、种子培养：

将活化后的斜面种子接入一环至50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，共接14瓶， 37℃，220rpm，培养16个小时到对数生长期。

四、发酵培养：

将长好的种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，转速220rpm，培养72h，发酵 罐为10L，装液量为6L，当发酵过程中残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时， 流加速度为1ml/min。下罐体积为5.9L，γ-PGA产量为45g/L。

五、发酵液提取

（1）除菌体：将发酵液PH调至3.2，粘度由83.4mPa·s降低至16.9mPa·s，加入2%质 量体积百分比的硅藻土，800目滤布，0.22MP压力，板框过滤除菌体，流速36ml/min。

（2）除杂蛋白及大分子活性有机物

去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH6.7，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过 0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。

（3）阳离子交换树脂除金属离子及一些带正电荷杂质

按发酵液体积30%（v：v）的添加量加入阳离子交换树脂，室温下搅拌，进行静态吸附 杂质30min，经检测，金属离子降低至9%，同时去除部分带正电荷杂质，离子交换结束后， 用6M氢氧化钠回调PH至7，引入少量离子后续纳滤会进行去除。

（4）脱色

加入1%活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色90min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效果 显著，得发酵液4.5L。

（5）除小分子氨基酸、离子杂质

稀释至10L过0.01um孔径纳滤膜，经检测，离子浓度降低至1/8，Glu含量降低至1/7， 得清液9L。

（6）超滤分级提取

上述9L清液，采用孔径0.1um中空纤维膜对其进行超滤，流速15ml/min，得到44.4% 透过液和50%一级截留液。将透过液经50kDa超滤膜，0.1MP压力过滤，对透过液进行浓缩并 同时再次去除离子和分子量较小的有机物，弃去二级截留液，得到浓缩透过液1.8L，经检测， γ-PGA含量为40g/L，平均分子量在12万左右，喷雾干燥得到γ-PGA白色粉末62.1g。

大分子量的γ-PGA被截留在中空纤维膜的一级截留液中，将一级截留液经500kDa超滤 膜进行超滤，流速4ml/min，收集50%透过液和44%未透过液，检测γ-PGA含量分别为45g/L 和43g/L，平均分子量约为28万和45万，分别加入2.5倍体积乙醇进行醇沉，将絮凝部分 分别复溶至2.5L，分别进行喷雾干燥，得到平均分子量分别为28万和45万的γ-PGA白色粉 末，分别是99.2g和90.4g。总收率为92.4%。

实施例2

一、培养基配制：

（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20，上述组分单位为g/L， pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K₂HPO₄·H₂O0.5，MgSO₄·6H₂O0.5， 上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH₄NO₃4.1、NaCl10、MgSO₄·6H₂O 0.5、CaCl₂·6H₂O1.0、FeCl₃·6H₂O0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭 菌20min。

流加培养基成分：葡萄糖900、NH₄NO₃60、CaCl₂·6H₂O20、FeCl₃·7H₂O0.15，上述组 分单位为g/L，PH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

二、菌种活化：

将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面 种子。

三、种子培养：

将活化后的斜面种子接入一环至50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，共接14瓶， 37℃，转速220rpm，培养16个小时到对数生长期。

四、发酵培养：

将长好的种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，转速220rpm，培养72h，发酵 罐为10L，装液量为6L，当发酵过程中残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时， 流加速度为1ml/min。下罐体积6L，γ-PGA产量为42g/L。

五、发酵液提取

（1）除菌体：将发酵液PH调至3.0，粘度由76.4mPa·s降低至14.3mPa·s，加入2.5% 质量体积百分比的硅藻土，800目滤布，0.22MP压力，板框过滤除菌体，流速34ml/min。

（2）除杂蛋白及大分子活性有机物

去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH6.7，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过 0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。

（3）阳离子交换树脂除金属离子及一些带正电荷杂质

按发酵液体积30%（v：v）的添加量加入阳离子交换树脂，室温下搅拌，进行静态吸附 杂质30min，经检测，金属离子降低至14%，同时去除部分带正电荷杂质，离子交换结束后， 用6M氢氧化钠回调PH至7，引入少量离子后续纳滤会进行去除。

（4）脱色

加入1.5%活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色120min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效 果显著，得发酵液4L。

（5）除小分子氨基酸、离子杂质

稀释至10L过0.01um孔径纳滤膜，经检测，离子浓度降低至1/7，Glu含量降低至1/7， 得清液9L。

（6）超滤分级提取

上述9L清液，采用孔径0.1um中空纤维膜对其进行超滤，流速18ml/min，得到49%透 过液和44%一级截留液。将透过液过超滤膜（50kDa），0.1MP压力，对透过液进行浓缩并同时 再次去除离子和分子量较小的有机物，弃去二级截留液，得到浓缩透过液2.7L，经检测，γ -PGA含量为42g/L，平均分子量在11万左右，喷雾干燥得到γ-PGA白色粉末102.4g。

大分子量的γ-PGA被截留在中空纤维膜的一级截留液中，将一级截留液过500kDa超滤 膜进行超滤，流速5ml/min，收集44%透过液和42%未透过液，检测γ-PGA含量分别为45g/L 和40g/L，平均分子量约为28万和40万，分别加入3倍体积乙醇进行醇沉，将絮凝部分分 别复溶至原体积，分别进行喷雾干燥，得到γ-PGA白色粉末，质量分别为80.3g和57.8g。 总收率为92.7%。

实施例3

一、培养基配制：

（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20，上述组分单位为g/L， pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K₂HPO₄·H₂O0.5，MgSO₄·6H₂O0.5， 上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH₄NO₃4.1、NaCl10、MgSO₄·6H₂O 0.5、CaCl₂·6H₂O1.0、FeCl₃·6H₂O0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭 菌20min。

流加培养基成分：葡萄糖900、NH₄NO₃60、CaCl₂·6H₂O20、FeCl₃·7H₂O0.15，上述组 分单位为g/L，PH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

二、菌种活化：

将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面 种子。

三、种子培养：

将活化后的斜面种子接入一环至50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，共接14瓶， 37℃，转速220rpm，培养16个小时到对数生长期。

四、发酵培养：

将长好的种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，转速220rpm，培养72h，发酵 罐为10L，装液量为6L，当发酵过程中残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时， 流加速度为1ml/min。下罐体积为5.9L，γ-PGA产量为38g/L。

五、发酵液提取

（1）除菌体：将发酵液PH调至3.0，粘度由77.2mPa·s降低至15.2mPa·s，加入质量 体积百分比为2.5%的硅藻土，800目滤布，0.22MP压力，板框过滤除菌体，流速36ml/min。

（2）除杂蛋白及大分子活性有机物

去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH7.0，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过 0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。

（3）阳离子交换树脂除金属离子及一些带正电荷杂质

按发酵液体积30%（v：v）的添加量加入阳离子交换树脂，室温下搅拌，进行静态吸附 杂质30min，经检测，金属离子降低至12%，同时去除部分带正电荷杂质，离子交换结束后， 用6M氢氧化钠回调PH至7，引入少量离子后续纳滤会进行去除。

（4）脱色

加入1.2%活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色120min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效 果显著，得发酵液4L。

（5）除小分子氨基酸、离子杂质

稀释至10L过0.01um孔径纳滤膜，经检测，离子浓度降低至1/7，Glu含量降低至1/7， 得清液9.2L。

（6）超滤分级提取

上述9.2L清液，采用孔径0.1um中空纤维膜对其进行超滤，流速20ml/min，得到58% 透过液和41%一级截留液。将透过液过超滤膜（50kDa），0.1MP压力，对透过液进行浓缩并同 时再次去除离子和分子量较小的有机物，弃去二级截留液，得到浓缩透过液2.9L，经检测， γ-PGA含量为40g/L，平均分子量在12万左右，喷雾干燥得到γ-PGA白色粉末108.2g。

大分子量的γ-PGA被截留在中空纤维膜的一级截留液中，将一级截留液过500kDa超滤 膜进行超滤，流速5ml/min，收集42%透过液和55%未透过液，检测γ-PGA含量分别为36g/L 和35.5g/L，平均分子量约为25万和45万，分别加入3倍体积乙醇进行醇沉，透过液中絮 凝部分复溶至原体积，未透过液醇沉絮凝部分复溶至原体积1.5倍，分别进行喷雾干燥，得 到γ-PGA白色粉末。质量分别为70.9g和35.0g。总收率为92.1%。

实施例4

一、培养基配制：

（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20，上述组分单位为g/L， pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K₂HPO₄·H₂O0.5，MgSO₄·6H₂O0.5， 上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。

（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精80、酵母膏20、NH₄NO₃4.1、NaCl10、MgSO₄·6H₂O 0.5、CaCl₂·6H₂O1.0、FeCl₃·6H₂O0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭 菌20min。

流加培养基成分：葡萄糖900、NH₄NO₃60、CaCl₂·6H₂O20、FeCl₃·7H₂O0.15，上述组 分单位为g/L，PH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

二、菌种活化：

将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面 种子。

三、种子培养：

将活化后的斜面种子接入一环至50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，共接14瓶， 37℃，转速220rpm，培养16个小时到对数生长期。

四、发酵培养：

将长好的种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，转速220rpm，培养72h，发酵 罐为10L，装液量为6L，当发酵过程中残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时， 流加速度为1ml/min。下罐体积为5.9L，γ-PGA产量为35g/L。

五、发酵液提取

（1）除菌体：将发酵液PH调至3.2，粘度由78.3mPa·s降低至18.1mPa·s，加入质量 体积百分比为3%的硅藻土，800目滤布，0.22MP压力，板框过滤除菌体，流速32ml/min。

（2）除杂蛋白及大分子活性有机物

去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH7.2，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过 0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。

（3）阳离子交换树脂除金属离子及一些带正电荷杂质

按发酵液体积30%（v：v）的添加量加入阳离子交换树脂，室温下搅拌，进行静态吸附 杂质30min，经检测，金属离子降低至7%，同时去除部分带正电荷杂质，离子交换结束后， 用6M氢氧化钠回调PH至7，引入少量离子后续纳滤会进行去除。

（4）脱色

加入1.2%活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色120min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效 果显著，得发酵液4.7L。

（5）除小分子氨基酸、离子杂质

稀释至10L过0.01um孔径纳滤膜，经检测，离子浓度降低至1/7，Glu含量降低至1/7， 得清液9.5L。

（6）超滤分级提取

将上述9.5L清液，采用孔径0.1um中空纤维膜对其进行超滤，流速21ml/min，得到61% 透过液和35%一级截留液。将透过液过超滤膜（50kDa），0.1MP压力，对透过液进行浓缩并同 时再次去除离子和分子量较小的有机物，弃去二级截留液，得到浓缩透过液3.2L，经检测， 浓缩透过液中γ-PGA含量为32g/L，平均分子量在10万左右，喷雾干燥得到γ-PGA白色粉 末94.1g。

大分子量的γ-PGA被截留在中空纤维膜的一级截留液中，将一级截留液过500kDa超滤 膜进行超滤，流速6ml/min，收集67%透过液和28%未透过液，检测γ-PGA含量分别为38g/L 和40g/L，平均分子量分别为23万和38万，分别加入3倍体积乙醇进行醇沉，将絮凝部分 分别复溶至原体积，分别进行喷雾干燥，得到γ-PGA白色粉末，质量分别为75.3g和35.8g。 总收率为94.3%。