丹顶鹤α干扰素、其编码基因和在抗病毒中的应用

摘要

本发明公开了一种丹顶鹤α干扰素、其编码基因和在抗病毒中的应用。本发明的一种丹顶鹤α干扰素（IFN-α），其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或SEQ ID NO.5所示。本发明一方面公开了丹顶鹤IFN-α的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列，另一方面也验证了克隆得到的丹顶鹤IFN-α在抗病毒，特别是抗水泡性口炎病毒和抗H9N2禽流感病毒中的应用。本发明的提出为丹顶鹤干扰素对其他病毒性疾病的深入研究奠定了基础，同时也为丹顶鹤干扰素产品的问世提供了理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种干扰素及其应用，特别涉及一种丹顶鹤α干扰素及在抗病毒中 的应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

我国是世界上丹顶鹤栖息的主要国家，国家林业局已经把丹顶鹤作为唯一的国 鸟候选鸟上报国务院，是国家一级保护动物。近年来，丹顶鹤禽流感、新城疫、疱 疹、马立克病等危害丹顶鹤生存的传染病时常发生，造成严重的损失，因此对这些 疾病的防疫与治疗是不可忽视的。

干扰素（interferon，IFN）是在特定诱生剂的作用下由细胞基因组控制产生的 一（或多）种蛋白质，具有抗病毒繁殖及免疫调节等生物学功能。干扰素可分为I 型、II型和III型。I型干扰素又称病毒干扰素或白细胞干扰素,包括IFN-α、β、ω、κ、 τ、δ、和ζ等，主要功能是抑制病毒增殖。II型干扰素又称免疫干扰素，只有IFN-γ 一个成员，主要起免疫调节的作用。III型干扰素包括IFN-λ（IL-28/29）。

迄今为止，哺乳动物的IFN-α的研究（尤其是人和鼠的研究）已取得很多成果， 但是禽类的IFN-α的研究起步较晚，只在鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鹧鸪等物种中有些进 展。尚未出现丹顶鹤IFN-α基因的核苷酸序列与它相对应的氨基酸序列的报道。由 于还没有丹顶鹤干扰素的产品问世，大多是使用鸡干扰素来代替丹顶鹤干扰素。然 而鸡和丹顶鹤之间存在种属差异，其干扰素对丹顶鹤的病毒性疾病的治疗效果并不 是很好，因而研究丹顶鹤干扰素是有必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供丹顶鹤α干扰素（IFN-α）基因的核苷 酸和相应的氨基酸序列；

本发明所要解决的技术问题之二是通过将丹顶鹤α干扰素（IFN-α）基因在原 核细胞中进行重组表达，从而验证该蛋白对病毒生长的抑制作用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

克隆丹顶鹤IFN-α全序列的实施方案：

（1）丹顶鹤基因组DNA的提取；

（2）利用两对简并引物AIF-TY1a和AIF-TY2b，POAU和AIF-TY2b进行PCR 扩增，将PCR产物连接到合适的克隆载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，测序 获得丹顶鹤IFN-α基因的部分序列，其中引物AIF-TY1a的核苷酸序列为： 5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’，引物POAU的核苷酸序列为： 5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，其共同的下游简并引物AIF-TY2b的核苷酸序 列为:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C， K=G/T，S=C/G，B=C/G/T，N=A/C/G/T；

（3）利用染色体步移技术，获取侧翼的未知序列；

（4）通过对扩增序列的拼接获得丹顶鹤IFN-α的全序列。

丹顶鹤IFN-α基因功能验证的实施方案：

（1）PCR扩增丹顶鹤IFN-α的成熟肽基因；

（2）构建重组的原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导表达干扰素蛋白；

（3）若为包涵体表达，将包涵体蛋白纯化，复性；

（4）在细胞上测定复性后的IFN-α对病毒复制的抑制情况来验证该蛋白的功 能。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种丹顶鹤α干扰素（IFN-α），其氨基酸 序列如SEQ ID NO.3所示（前肽，含有信号肽）或SEQ ID NO.5所示（成熟肽）。

进一步的，本发明还提出了编码所述的丹顶鹤α干扰素的核苷酸序列。

优选的，所述的核苷酸序列为丹顶鹤α干扰素的全基因序列或其编码区序列， 其中，所述的丹顶鹤α干扰素的全基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述的编码区序 列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所示。

含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述的表达载体的宿主细胞也在 本发明的保护范围之内。

更进一步的，本发明还提出了所述的丹顶鹤α干扰素在制备抗病毒药物中的应 用。其中，优选的，所述的病毒为水泡性口炎病毒或禽流感H9N2病毒。

再进一步的，本发明提出了一种抗水泡性口炎病毒的药物组合物，其特征在于 有效成分为本发明的丹顶鹤α干扰素（IFN-α）。及

一种抗H9N2禽流感病毒的药物组合物，其特征在于有效成分为权利要求1所 述的丹顶鹤α干扰素。

综上，本发明一方面公开了丹顶鹤IFN-α的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列， 同时验证了该丹顶鹤IFN-α的抗水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV） 和抗H9N2禽流感病毒的功能，为丹顶鹤干扰素对其他病毒性疾病的深入研究奠定 了基础，为丹顶鹤干扰素产品的问世提供了可能。

附图说明

图1为使用简并引物AIF-TY1a和AIF-TY2b PCR扩增IFN-α部分基因的电泳 结果图；

1道：目的带；2道：阴性对照；

图2为使用简并引物POAU和AIF-TY2b PCR扩增IFN-α部分基因的电泳结果 图；

1道：阴性对照；2道：目的带；

图3为IFN-α5’和3’侧翼序列的扩增电泳结果图；

1道：3’端第一次扩增产物；2道：3’端第二次扩增产物；3道：3’端第三次扩 增产物；4道：5’端第三次扩增产物；5道：5’端第二次扩增产物；6道：5’端第一 次扩增产物；

图4为IFN-α成熟肽序列的扩增电泳结果图；

1道：目的带；2道：阴性对照；

图5为蛋白的SDS-PAGE结果；

1道：pET32a空载诱导后；2道：重组菌诱导前；3道：重组菌全菌体；4道： 超声后沉淀；5道：超声后上清；

图6为重组IFN-α对VSV病毒的抑制试验的显微镜观察图；

A：病毒对照组；B：实验组；C：阴性对照-细胞对照组；

图7为不同浓度的IFN-α对VSV的抑制情况的统计图；

横轴：IFN的不同浓度纵轴：IFN对VSV的抑制率；

图8为重组IFN-α对H9N2病毒的抑制试验的显微镜观察图；

A：病毒对照组；B：实验组；C：阴性对照-细胞对照组；

图9为不同浓度的IFN-α对H9N2的抑制情况的统计图。

横轴：IFN的不同浓度纵轴：IFN对H9N2的抑制率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限 制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明 技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范 围内。

实施例1丹顶鹤IFN-α基因的部分序列的扩增

1、按照禽类血液基因组DNA的简单快速提取方法，从丹顶鹤的血液中提取基 因组DNA；

2、以丹顶鹤基因组DNA为模板，简并引物AIF-TY1a和AIF-TY2b为引物， PCR扩增IFN-α基因，其中引物AIF-TY1a的核苷酸序列为： 5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’，引物AIF-TY2b的核苷酸序列 为:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C， K=G/T，S=C/G，B=C/G/T；反应体系和反应条件如下所示：

PCR反应体系：

反应条件：94℃预变性8min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30 个循环；72℃终延伸10min，4℃终止反应。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳的结 果如图1所示。

回收目的片段，将胶回收产物连入pMD19-T载体，16℃连接5h后，转化到大 肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃培养12h。

挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定（AIF-TY1a和AIF-TY2b为引物）阳性后 送北京六合华大基因科技股份有限公司测序获得部分（167bp）丹顶鹤IFN-α基因。

实施例2丹顶鹤IFN-α基因的部分序列的扩增

1、以丹顶鹤基因组DNA为模板，简并引物POAU和AIF-TY2b为引物，PCR 扩增IFN-α基因，其中引物POAU的核苷酸序列为： 5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，引物AIF-TY2b的核苷酸序列 为:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C， K=G/T，S=C/G，B=C/G/T，N=A/C/G/T；

反应体系和反应条件如下所示：

PCR反应体系：

反应条件：94℃预变性8min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min， 30个循环；72℃终延伸10min，4℃终止反应。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳的 结果如图2所示。

2、回收目的片段，将胶回收产物连入pMD19-T载体，16℃连接5h后，转化 到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃培养12h。

3、挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定（AIF-TY1a和AIF-TY2b为引物，POAU 和AIF-TY2b为引物）均为阳性后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序获得 部分（480bp）丹顶鹤IFN-α基因。

经序列比对发现，获得的480bp序列中含有与实施例1扩增得到的167bp序列 完全一致的序列。

实施例3丹顶鹤IFN-α基因的5’端侧翼未知序列的扩增

在实施例2获取的480bp干扰素基因的基础上，按照Genome Walking Kit试剂 盒的说明，设计3条退火温度相对较高的特异性引物SP1，SP2，SP3，其核苷酸序 列分别为：

SP1：5’-TTGCCTTTTGAAGCGCGTCCCGT-3’；

SP2：5’-CCTTGGTTCGTGTGGTTGTCGTG-3’；

SP3：5’-GAGGTTGAGGCTGTCCCAGGTGA-3’。

按说明进行三次巢式PCR，第一次PCR反应体系如下：

第一次PCR反应条件如下：

第二次PCR反应的PCR反应体系及反应条件如第一次所示，需进行改动的部 分：以第一次PCR产物稀释100倍后为第二次模板，SP2为第二次反应的特异性 引物。

第三次PCR反应部分：以第二次PCR产物稀释100倍后为第三次模板，SP3 为第三次反应的特异性引物。其反应体系和反应条件如第一次所示。

第一次PCR、第二次PCR、第三次PCR三次巢式PCR的PCR产物在1%的 琼脂糖凝胶电泳的结果如图3所示。

2、回收第三次PCR产物，将回收产物连入pMD19-T载体，转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，37°培养12h。

3、挑取单克隆菌落，经限制性内切酶切鉴定（EcoR I、Hind III）为阳性后送 北京六合华大基因科技股份有限公司测序，获得5’端侧翼序列。

实施例4丹顶鹤IFN-α基因的3’端侧翼未知序列的扩增

3’端侧翼未知序列的扩增方法如实施例3所示，反应体系及反应条件均相同， 所需要的特异性引物的核苷酸序列为：

P1：5’-ACCCTCACCTGGGACAGCCTCAACC-3’；

P2：5’-CGCCACCTACTCCT CAACAACCTC-3’；

P3：5’-CACCACCACATCCAGCA GCTCCAGC-3’。

第一次PCR、第二次PCR、第三次PCR三次巢式PCR的PCR产物在1%的 琼脂糖凝胶电泳的结果如图3所示。经测序获得3’端侧翼序列。

通过对实施例1-4扩增序列的拼接获得丹顶鹤IFN-α的全序列，序列如SEQ ID  NO.1所示，其中487-1227位核苷酸为IFN-α编码区序列（开放阅读框，ORF）， 序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的IFN-α的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其 中包括信号肽和成熟肽序列，信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，成熟肽的 氨基酸酸序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例5丹顶鹤IFN-α基因的原核表达

原核表达的过程中，丹顶鹤IFN-α的信号肽部分要去除，因此首先要设计丹顶 鹤IFN-α表达成熟肽的引物MORF1a和MORF2b，核苷酸序列为： MORF1a:5’-GAATTCTGCCACCACCTGCGGCCACGC-3’(下划线：EcoR I酶切位 点)，MORF2b：5’-AAGCTTCATGCACGTTTCCCCATCGGTT-3’(下划线：Hind III 酶切位点)。

PCR扩增编码丹顶鹤IFN-α成熟肽的核苷酸序列，反应体系如下：

反应条件：94℃预变性8min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min， 30个循环；72℃终延伸10min，4℃终止反应。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳的 结果如图4所示。

3、目的片段回收后，连入平端载体pEASY-Blunt-Simple，得到pEASY-IFN-α， 转化大肠杆菌DH5α，37℃培养12h，经菌液PCR鉴定，EcoR I、Hind III单双酶切 鉴定为阳性的菌液送华大测序，测序结果显示克隆得到的编码丹顶鹤IFN-α成熟肽 的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，与预期一致。

4、重组表达载体pET32a-IFN-α的构建：pEASY-IFN-α和pET32a经EcoR I、 Hind III双切后，将IFN-α和线性表达载体pET32a，在T4DNA连接酶的作用下连 接成pET32a-IFN-α。

5、将重组表达载体pET32a-IFN-α转化的BL21大肠杆菌中，待OD值在0.5 左右加IPTG诱导表达。表达后的重组蛋白的SDS-PAGE结果如图7所示，氨基酸 序列如SEQ ID NO.5所示。

6、蛋白的镍柱纯化：将重组蛋白溶解在6M的盐酸胍溶液，按纯化说明操作， 10mM咪唑，100mM咪唑分别上柱洗涤杂带白，250mM洗脱干扰素蛋白。

7、包涵体的透析复性：本发明尝试用2M盐酸胍透析纯化后的重组干扰素给包 涵体复性，最后用PBS透析以备研究其生物学功能。

实施例6重组丹顶鹤IFN-α的抗VSV病毒活性功能验证

1、制备鸡胚成纤维细胞，37℃、5%CO₂培养24h；

2、换细胞培养液，同时向鸡胚成纤维细胞中接入100μL不同稀释倍数的重组 丹顶鹤IFN-α蛋白（实施例5制备），培养24h；

3、换细胞培养液，同时加入100μL水泡性口炎病毒（VSV），100pfu\孔，培 养24h，在显微镜下观察，并对病毒受到的抑制情况（抑制率）进行统计，结果如 图6以及图7所示。

结果表明，本发明制备得到的丹顶鹤IFN-α蛋白具有抑制水泡性口炎病毒 （VSV）增殖的作用，且抑制程度在一定范围内随着丹顶鹤IFN-α蛋白浓度的增加 而升高。

实施例7重组丹顶鹤IFN-α的抗H9N2病毒活性功能验证

1、制备鸡胚成纤维细胞，37℃、5%CO₂培养24h；

2、换细胞培养液，同时向鸡胚成纤维细胞中接入100μL不同稀释倍数的重组 丹顶鹤IFN-α蛋白（实施例5制备），培养24h；

3、换细胞培养液，同时加入100μL禽流感病毒H9N2，100pfu\孔，培养24h， 在显微镜下观察，并对病毒受到的抑制情况（抑制率）进行统计，结果如图8以及 图9所示。

结果表明，本发明制备得到的丹顶鹤IFN-α蛋白具有抑制禽流感病毒H9N2增 殖的作用，且抑制程度在一定范围内随着丹顶鹤IFN-α蛋白浓度的增加而升高。