一种青环海蛇抗菌肽Hc-CATH的改造体HC-15及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH改造体抗菌肽HC-15及其制备方法和应用。改造体抗菌肽为青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH的改造体HC-15，其是直链多肽，含有15个氨基酸残基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等电点12.61。本发明改造抗菌肽HC-15具有广谱高效的抗菌活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽及其制备方法和应用，具体涉及一种青环海蛇(Hydrophiscyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH改造体抗菌肽HC-15及其制备方法和应用。

背景技术

Cathelicidins是一个具有多功能的抗菌肽家族，目前在哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类动物中均有发现。Cathelicidins具有广谱高效的抗微生物活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。除此之外，cathelicidins还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。由于具有如此众多的活性，cathelicidins一直是国际上研究的热点。针对cathelicidins的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。

随着传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物耐药性问题变得日益严重，在临床上已经出现了大量能够广泛耐受传统抗生素的微生物，已有的抗生素对这些病原微生物无能为力。抗菌肽是一类天然的具有抗微生物活性的多肽，大多数抗菌肽分子量小于10KD，富含碱性氨基酸残基，能够形成两亲性的结构。大部分抗菌肽的杀菌机制是通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。由于作用方式的不同，抗菌肽介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易使细菌产生耐受性。

目前，国外有许多公司正在进行cathelicidins家族抗菌肽的研究开发，已有多种cathelicidins家族抗菌肽及其改造体进入临床试验阶段。如牛Indolicidin改造体MBI-226用于治疗中心导管导致的血液感染，已进入临床IIIb期。牛Indolicidin改造体MX-594AN用于治疗痤疮感染，已进入临床IIb期试验阶段。猪protegrin改造体Iseganan用于治疗肿瘤患者口腔感染，已进入临床I期试验阶段。

海蛇属于爬行纲蛇目眼镜蛇科，一般生活于大陆架和海岛周围的浅水区，是一类海岸带极具开发潜力的海洋经济爬行动物。世界上约有50多种海蛇，中国有扁尾海蛇亚科和海蛇亚科共9属15种。海蛇药用在中国历代医书均有记载，其作为祛风燥湿、通络活血、攻毒和滋补强壮等功效良药，常用于风湿痹症、四肢麻木、关节疼痛、疥癣恶疮等症。现代医学研究表明：海蛇干具有抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛、改善微循环、提高免疫力等功能；海蛇胆具有显著止咳，祛痰作用，用于咳嗽、哮喘等呼吸道疾病的治疗；海蛇毒具有镇痛、抗血栓、抗肿瘤等活性。海蛇所具有的广泛的药学活性，表明其具有极大的药用开发潜力。但是与陆地蛇相比，目前国内外对海蛇的研究十分滞后，只有为数不多关于海蛇分类、生态、毒液成分和传统药学应用的文章报道。然而对海蛇cathelicidins家族抗菌肽的研究目前国内外仍是一片空白。

青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)属于眼镜蛇科海蛇亚科海蛇属，在辽宁、山东、江苏、浙江、福建、台湾、广东、广西、海南等省区沿海均有分布。但是目前关于青环海蛇cathelicidins家族抗菌肽的研究还没有报道。

发明人将本发明的青环海蛇抗菌肽Hc-CATH改造体HC-15氨基酸全序列经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。

发明内容

本发明的目的在于一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH改造体抗菌肽HC-15及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH的改造体HC-15，其是直链多肽，含有15个氨基酸残基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等电点12.61。

所述改造体抗菌肽为：缬氨酸-精氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸，且C-末端酰胺化。

改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽HC-15用于制备抗微生物药物的用途

本发明的有益效果在于：本发明根据青环海蛇抗菌肽Hc-CATH的氨基酸序列，利用分子改造方法设计Hc-CATH的改造体HC-15，该改造体具有广谱高效的抗微生物活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1制备抗菌肽Hc-CATH的改造体HC-15

I、HC-15的制备方法：根据青环海蛇抗菌肽Hc-CATH的氨基酸序列，利用分子改造方法设计Hc-CATH的改造体HC-15。用自动多肽合成仪(433A，Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐。

II、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。

III、纯化的HC-15用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

测定结果为：

HC-15是青环海蛇抗菌肽Hc-CATH的一种变异体。HC-15是一种直链多肽，含有15个氨基酸残基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等电点12.61。HC-15全序列为：缬氨酸-精氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸，且C-末端酰胺化。

试验例1抗菌肽Hc-CATH的改造体HC-15的抗菌活性

1.HC-15抗菌活性检测

分别挑取保存于斜面上的试验菌株(标准菌株及临床分离菌株共25株)均匀涂布于MH固体培养基(青岛海博生物技术有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的HC-15样品溶液10μl，于37℃倒置培养18-20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。

2.HC-15最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定：

试验菌株分别接种到MH液体培养基中(青岛海博生物技术有限公司)，37℃振荡培养到对数生长期，而后将培养至对数生长期的培养液用新鲜MH液体培养基稀释到2×10⁵cfu/m1。

取1.9ml上述稀释的细菌培养液，加入经0.22μm孔径膜过滤的2mg/ml的HC-15样品溶液0.1ml作为第一管，第一管混匀后取出1ml加入第2管中，依次倍比稀释(参见表1)，自第9管吸出1ml弃去，第10管为对照管。

表1稀释方法

上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。

由表2可见，HC-15对试验菌株表现出广谱高效的抗微生物活性，对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均具有很强的活性，其中包括大量临床分离耐药菌株。

表2.HC-15抗菌活性

  菌株  MIC(μg/ml)  绿脓杆菌ATCC27853  9.4  绿脓杆菌1019(IS，DR)  18.7  绿脓杆菌1205(IS，DR)  37.5  绿脓杆菌1014(IS，DR)  9.4  大肠杆菌ATCC25922  2.3  大肠杆菌1852(IS，DR)  2.3  大肠杆菌1866(IS，DR)  9.4  大肠杆菌1017(IS，DR)  4.7  大肠杆菌2813(IS，DR)  9.4  大肠杆菌0726(IS，DR)  4.7  大肠杆菌0722(IS，DR)  4.7  金黄色葡萄球菌ATCC25923  1.2  金黄色葡萄球菌1865(IS，DR)  18.7  金黄色葡萄球菌1875(IS，DR)  75  金黄色葡萄球菌1002(IS，DR)  9.4  金黄色葡萄球菌1013(IS，DR)  37.5  金黄色葡萄球菌2706(IS，DR)  18.7  金黄色葡萄球菌2712(IS，DR)  9.4  金黄色葡萄球菌2810(IS，DR)  9.4  甲型副伤寒沙门氏菌1764(IS，DR)  4.7  肺炎克雷伯菌1123(IS，DR)  9.4  肺炎克雷伯菌1012(IS，DR)  18.7  肺炎克雷伯菌0202(IS，DR)  37.5  肺炎克雷伯菌0724(IS，DR)  18.7  屎肠球菌0712(IS，DR)  4.7

MIC：最小抑菌浓度，IS：临床分离株，DR：耐药菌株。以上结果为三次独立重复实验平均值。

3.HC-15溶血活性测定：

将采集的兔血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的HC-15样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝(A样品-A阴性对照)/A阳性对照×100％。结果表明样品浓度为100μg/ml，HC-15的溶血百分比为9.4％，说明HC-15具有较低的溶血活性，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在医药领域进一步的开发应用。