环孢素A的晶型、制备方法及其使用方法

摘要

本发明整体涉及环孢素A的晶型以及特别地涉及环孢素A的最新鉴定形式。本发明进一步涉及用于其制备的方法和涉及用于治疗某些眼部病症的方法。

说明书

相关申请

本申请要求2011年5月27日提交的美国临时专利申请No. 61／490,887的优先权，所述专利申请的全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明整体涉及环孢素A的新晶型以及特别是环孢素A的最新 鉴定形式的药物用途。本发明进一步涉及用于其制备的方法和涉及用 于治疗某些眼部病症的方法。

发明背景

正常眼睛的裸露部分被薄的泪膜覆盖。连续泪膜的存在对于角膜 上皮和结膜上皮的健康为重要的并且为角膜提供光学上的高质量表 面。另外，泪膜的含水部分在眼睑眨动期间对眼睑起到润滑剂的作用。 此外，已知包含在泪液中的某些酶(例如，免疫球蛋白A、溶菌酶和 3溶解酶)具有抑菌性质。

健全的泪系统具有形成且保持合理结构化的、连续泪膜的功能。 泪器由分泌系统(源)、分布系统和排泄系统(槽)组成。在分泌系统中， 含水眼泪由主泪腺和副泪腺供应。

大部分泪膜由此类含水眼泪组成。含水眼泪的连续生成和排出对 于以下为重要的：将角膜和结膜上皮保持在润湿状态中、为上皮呼吸 提供营养、供应抗菌剂和通过眼泪移动的冲洗作用来清洁眼部表面。

已建议将外科手术用于处理干眼状态。在有显著结膜破坏的地方 ，已提倡粘膜移植。还建议可以将腮腺(唾液)管移植用于处理干眼。 然而，战胜干眼病患的外科手术的改变构成引人注目的补救且得自这 些改变的任何有益效果为可疑的。

眼睛的其它疾病包括晶状体过敏性眼内炎、葡萄膜炎和干燥性角 膜结膜炎(KCS)。这些疾病可位于眼睛、眼后房和眼前房两者以及玻 璃体中。

在美国约10％的视觉障碍与葡萄膜炎(葡萄膜的炎症)有关。晶状 体过敏性眼内炎为人类自身免疫疾病。

全葡萄膜炎是指整个眼色素(血管的)层的炎症。较后的葡萄膜炎 一般是指脉络膜视网膜炎(chorioentinitis)，而较前的葡萄膜炎是指虹 膜睫状体炎。如果眼睛，即眼前房、眼后房和玻璃体腔以及浸润组织 密切地包含于炎性反应中，那么这些炎症的炎性产物(即，细胞、纤 维蛋白、过量蛋白)通常见于流体间隙。葡萄膜炎可作为以下病症产 生于对眼睛进行外科手术或眼睛外伤之后；作为自身免疫病症(即， 类风湿性关节炎、贝切特氏病(Behcet's disease)、强直性脊柱炎、结节 病)的组成；作为与已知病原学无关的单独免疫介导的眼部病症，即 睫状体扁平部炎、虹膜睫状体炎等；和引起待沉积于眼色素层组织中 的抗体-抗原复合物的某些全身性疾病之后。这些病症一起表示非传 染性葡萄膜炎。

晶体过敏症为葡萄膜炎的严重形式，其中晶状体为致病抗原。晶 状体蛋白在出生之前通常被晶状体囊隔绝。当这些蛋白质通过损伤或 外科手术或偶尔在白内障形成期间释放至眼睛中，它们可成为强烈的 抗原并刺激自身免疫应答。如果响应适度，那么可以将其视为慢性葡 萄膜炎。如果进展非常迅速，那么眼睛在各段将会严重发炎。后者响 应被称为晶体过敏症。

环孢素为一组具有已知免疫抑制剂活性的非极性环状寡肽。已鉴 定出环孢素A，连同若干其它微量代谢物以及环孢素B、C、D、E、 F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、 X、Y和Z。使用环孢素A和环孢素A衍生物来治疗示于上文的眼科 病患已成为多个专利的主题，例如Ding等人美国专利No.5,474,979； Garst美国专利No.6,254,860；和Garst美国专利No.6,350,442，各个 专利的公开内容通过引用整体并入本文。相对于其固态化学，已知环 孢素A(CsA)以无定型、液晶型、四方晶型(型1)和正交晶型(型3)存 在。

发明内容

本发明提供CsA的新晶型，其具有适用于药物开发的独特和新 型性质。

在本发明的另一个实施方案中，提供药物组合物，其包括治疗有 效量的在眼部可接受载体中呈新晶型的环孢素A。

在另一个实施方案中，提供治疗眼中水缺乏干眼状态、葡萄膜炎 或晶状体过敏性眼内炎的方法。此类方法可以，例如，通过向需要其 的受试者施用在眼部可接受载体中呈晶型2的环孢素A来进行。

附图简述

图1描述呈新晶型(本文中称为型2)、四方晶型(本文中称为型1) 和正交晶型(本文中称为型3)的CsA的特征性X-射线粉末衍射(XRPD) 谱图。

图2描述CsA晶型2的XRPD衍射图。

图3描述CsA型2的水吸附／解吸图。

图4描述回收自具有1％PS80的0.04％制剂的CsA型2的MDSC 分析。

图5描述收集自含有1％w／v聚山梨醇酯80和过量CsA型2的 水性悬液的样品在储存24个月之后的XRPD衍射图。

图6描述收集自含有5％w／v透明质酸和过量CsA型2的水性悬 液的样品在储存6个月之后的XRPD衍射图。

图7描述环孢素A型的模拟的XRPD谱图。

发明详述

应理解上面的一般描述和下面的详细描述都只是示例和说明 性的且并不限制请求保护的本发明。如本文所用，除另有明确指示外， 否则使用的单数包括复数。如本文所用，“或”意指“和／或”，除非 另有说明。此外，使用术语“包括(including)”以及其它形式，诸如 “包括(includes)”和“包括(included)”为非限定性的。本文所用的章 节标题仅为了组织的目的，而不应解释为限制所述的主题。

另外，应理解“晶型”和“假晶型”可在整个说明书中互换使用。 “晶型1”或“晶型2”也可被称为“假晶1”或“假晶2”。

除非提供了具体的定义，否则所利用的有关命名法和本文描述的 分析化学、合成有机和无机化学的实验室程序和技术是本领域已知 的。使用的标准化学符号可与用该符号表示的全名互换。因此，例如， 术语“氢”和“H”应理解为具有完全相同的含义。标准技术可被用 于化学合成、化学分析和配制。

本发明提供一种CsA的新晶型，称为环孢素A型2。该新型2 的XRPD谱图显著不同于四方晶型和正交晶型(图1)。当由X-射线源 如Cu Ko辐射，的X射线衍射仪扫描时，CsA型2的主晶 峰出现在(2θ)，在30kV／15mA下：7.5、8.8、10.2、11.3、12.7、13.8、 14.5、15.6和17.5(晶格的d-间距分别在约11.8、10.0、8.7、7.8、7.0、 6.4、6.1、5.6和图2)。相对于正交晶型或四方晶型，这些主 峰被定义为对于型2独特的那些；以及该峰的强度比背景大5倍。

在一个实施方案中，CsA的新晶型(型2)为环孢素A的非化学计 量水合物。

在另一个实施方案中，晶型2由下式表示：

XH₂O

其中X为水分子数目且在0-3之间变化。在一个实施方案中，在 上式中的X为2。

型2似乎是水性悬液中CsA的动力学稳定形式。含有型2的悬 液在储存时未示出向其它已知多晶或假晶型的转化。已发现型1和无 定型在存在水的情况下转化为型2。

确定最近发现的环孢素A的水合型(型2)的单晶结构并将晶体结 构参数列于表2。这些结果表明与环孢素A的其它已知晶型相比，型 2为独特的。

表1：CsA型2的晶体结构溶液的晶体数据和数据收集参数。

发现该CsA型2的不对称单元含有一个环孢素A分子和两个水 分子。可以将氢键合于水的任何小分子可能起着空间填充物的作用， 这将产生一系列的从正交晶二水合物至变形的单斜晶二水合物的潜 在结构。由单晶结构计算的XRPD谱图示于图7且该图与示于图2 的实验谱图相匹配。这些相配的谱图进一步证实型2为独特的且纯的 环孢素A的晶型。

不希望受到理论的束缚，热重量分析结合KF滴定和蒸汽吸附和 解吸分析(VSA)表明CsA型2为CsA的非化学计量水合物。环孢素 型2的蒸汽吸附分析表明新晶型中的水含量随着相对湿度可逆地变 化，如图3所示。与四方晶型相似，根据调制差量热(MDSC)分析(图 4)表明在融化之前新CsA型在124.4℃下经历相变至液晶或无定型。

在含有1％PS80的眼科制剂媒介物中，CsA的新物理型具有比 正交晶型(100μg／mL)高的溶解度(130μg／mL)。这对于开发溶液或悬 液制剂为可取的。所述新型在水溶液中似乎比四方晶型更稳定。在替 代制剂(诸如眼部植入物、片剂、囊剂和半固体制剂、液体凝胶囊剂、 悬液和微乳液)中，型2提供一些超过四方晶型和正交晶型的优点。

另外，已发现型2比型1或3更易于铣削。铣削非常重要因为在 环孢素A持续释放悬液中，已观察到大颗粒(即，≥40μm)在2％透 明质酸(水凝胶)制剂中沉淀且难于重悬。CsA型2易于铣削至10μm 或更小。在2.5％透明质酸中在高达10％的浓度下已制备这些晶体的 物理上稳定的悬液。

除了物理稳定性，可以预见较小粒度由于增加的表面积将向组织 递送更多的药物。为此减小粒度可能为关键的因为型2似乎具有比无 定型更低的溶解特性且因此可能将具有较低的递送于组织，尽管较小 粒度可以缓解该问题。实际上，已发现用型2制备纳米粒子比型1或 3更容易。因此，如果需要将晶体纳米化以便改善向组织的药物递送 和／或改善悬液的物理稳定性，那么型2提供比其它型明显的优点。

可以通过将治疗有效量的本发明的CsA型2或其药学上可接受 的盐作为活性成分与常规的眼科上可接受的药物赋形剂组合，并且通 过制备适合于眼局部应用的单位剂型来制备药物组合物。液体制剂中 的治疗有效量通常为约0.0001至约5％(w／v)，优选约0.001至约1.0％ (w／v)

对于眼科应用，优选使用生理盐水作为主要媒介物来制备溶液。 这种眼用溶液的pH应优选用适当的缓冲体系保持在4.5与8.0之间， 优选中性pH，但并非必需。制剂还可以包含常规的、药学上可接受 的防腐剂、稳定剂和表面活性剂。

用于本发明药物组合物的优选防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯 丁醇、硫柳汞、醋酸苯汞和硝酸苯汞。优选的表面活性剂为，例如， 吐温80。同样地，各种优选媒介物可用于本发明的眼科制剂。这些 媒介物包括但不限于聚乙烯醇、聚维酮、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙 姆、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、环糊精和纯化水。

在需要或方便时可以加入张力调节剂。张力调节剂包括但不限于 盐，特别是氯化钠、氯化钾、甘露醇和甘油或任何其它合适的眼部可 接受的张力调节剂。

可使用调节pH的各种缓冲液和方式，只要所得制剂是眼部可接 受的。因此，缓冲液包括醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓 冲液和硼酸盐缓冲液。在需要时，可以用酸或碱调节这些制剂的pH。

同样，可用于本发明的眼部可接受的抗氧化剂包括但不限于焦亚 硫酸钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基化羟基茴香醚和丁基化羟 基甲苯。

可以包括在眼科制剂中的其它赋形剂组分为螯合剂。优选的螯合 剂为乙二胺四乙酸二钠，但也可以用其它螯合剂替代或与其共用。

这些成分通常按以下用量使用：

成分量(％w／w)活性成分约0.001-5防腐剂0-0.10媒介物0-40 张力调节剂0-10缓冲液0.01-10pH调节剂适量pH4.5-7.5抗氧化剂 根据需要表面活性剂根据需要纯化水根据需要以制备100％

本发明的活性化合物的实际剂量取决于具体化合物和要治疗的 病患；适当的剂量的选择为熟练技术人员所熟知的。

含有CsA型2的药物组合物用于治疗多种眼部病症。因此，在 本发明的另一个实施方案中，提供用于治疗眼中含水缺乏干眼状态、 葡萄膜炎、晶状体过敏性眼内炎或干燥性角膜结膜炎(KCS)的方法， 其包括向需要其的受试者施用在眼部可接受载体中呈晶型2的环孢 素A。

本发明一方面涉及药物组合物用于缓解干眼相关的症状，例如， 具有免疫介导的干燥性角膜结膜炎(KCS)或干眼疾病或泪腺的其它自 身免疫功能障碍的患者以及隐形镜片佩戴者的干眼症状。

干眼一般是指任何泪膜异常，通常为上皮异常。泪膜水组分的具 体缺乏被称为干燥性角膜结膜炎(KCS)，该干燥性角膜结膜炎影响全 世界3千万人。它经常包括于Siogren综合征的一部分。照字面意义， 术语表示次于干燥的角膜和结膜炎症。

当泪膜未能发挥其润滑、氧化和移除碎屑的功能时，就会产生异 物感(沙粒感、刺痒、沙质感)、疲劳和干燥。患者可能经历重度痛， 特别是在存在丝状角膜病理学变化的情况下。泪膜平滑折射表面的损 耗引起视力模糊，其可以在眨眼之间变化，这解释了整天多变的显性 折射和多变视力的抱怨。表面干燥可产生反射撕开和过量眼泪的误导 性抱怨。典型地，眼泪缺乏的症状在长期用眼(如当患者阅读或看电 视)以及在热、风和低湿度(如在沙滩上或滑雪场)的条件下于当天晚些 时候更糟糕。在早上糟糕的症状表明相关的慢性睑类、复发的角膜上 皮糜烂或暴露的角膜病理学变化。此外，症状包括表面点状糜烂、角 膜丝、粗粘液斑块和上皮缺损。

如上文指出，这些症状的大部分由不稳定的泪膜和减弱眼部表面 响应于环境挑战能力的异常的眼部表面所引起。如果不经治疗，干眼 综合征可引起结膜和角膜上皮的逐渐病理学变化。

干眼的病因学为不同的。通常被称为“干眼”的疾病可能为对泪 腺的全身雄性激素支持的年龄相关的减少或全身自身免疫疾病(诸如 Sjogrens综合征)的结果。生长身体的研究表明干眼为潜在的细胞因子 和受体介导的炎性过程的结果。

姑息治疗剂，诸如眼泪替换、眼泪保存和自发的眼泪刺激，可提 供症状的完全或部分缓解。然而，用于潜在炎性过程的治疗学的治疗 可能有利于纠正潜在的病症。

正常眼睛中的泪膜由薄(厚度约6-45um)膜组成，所述薄膜由位 于角膜上皮上方的粘液层和覆盖所述粘液层和上皮的水层构成，泪膜 随后由脂质分子的极薄(0.01-0.22um)层覆盖。

连续泪膜的存在对角膜和结膜上皮的健康很重要且为角膜提供 光学上高质量的表面。另外，泪膜的含水部分在眼睑眨动期间对眼睑 起到润滑剂的作用。此外，已知含于眼泪流体的某些酶，例如，免疫 球蛋白A、溶菌酶和3溶解酶，具有抑菌性质。

据信脂质层为来自眼中水延迟蒸发的原因。如果泪膜的脂质层 被(例如，创伤、疾病、眼睛的刺激或隐形眼镜佩戴)扰乱，那么可能 发生眼中水的过度蒸发，使眼睛表面“干燥”(参见如，Cedarstaff和 Tomlinson，Am.J.Optometry&Physiol.Optics，60：167-174，1983[tear  film disruption in patients with keratoconjunctivitis sicca，or″dry eye″])。

正常的泪系统具有形成且保持合理结构化的、连续的泪膜的功 能。泪器由分泌系统(源)、分布系统和排泄系统(槽)组成。在分泌系 统中，含水眼泪由主泪腺和副泪腺提供。

来自泪膜水的过度蒸发导致眼部不适(人们经常经历的干眼或 疲劳眼或其它报道较少的不适症状)并可能最终导致眼部组织(特别是 角膜)的生理学和病理学变化。对于隐形眼镜佩戴者，此类不适特别 地敏感因为来自泪膜的水的损耗发生在泪膜和晶状体之间的界面处。 此外，如果晶状体为水凝胶“软”晶状体，那么来自泪膜的水的过度 蒸发也可导致晶状体中水的过度蒸发。

因此，考虑到这种蒸发，含水眼泪的连续生成和排出对于以下为 重要的：将角膜和结膜上皮保持在润湿状态中、为上皮呼吸提供营养、 供应抗菌剂和通过眼泪移动的冲洗作用来清洁眼部表面。

在相对轻症中，KCS的主要症状为异物感或轻微“刺痒”。这 可发展成经常的、强烈的灼烧刺激感，该灼烧刺激感可使患者虚弱。 KCS的更严重形式发展成细丝角膜炎，疼痛病患，特征为出现许多 附着于角膜表面的丝条或细丝。最近证据表明这些细丝表示正常的角 膜上皮细胞的连续性中断。由眼睑运动产生的剪切力拉动这些细丝引 起疼痛。这一阶段的KCS的处理非常困难。

KCS的频繁并发症为继发感染。好像在眼睛的正常防卫机制中 进行若干破坏，推测是由于患有KCS的患者的含水眼泪中抗菌溶菌 酶浓度的降低而引起。

正常地，缺乏水的干眼状态，诸如，例如，KCS，通过用人工眼 泪替代物补充眼泪来治疗。然而，减轻受限于施用于眼睛中的人工眼 泪溶液的保留时间。典型地，施用于眼睛的人工眼泪溶液的作用在 约三十至四十五分钟内消散。尽管起初减轻痛苦，但是此类产品的作 用不能持续足够长的时间。患者不便根据需要将人工眼泪溶液重复施 用于眼睛的需要来补充正常的眼泪。

以下实施例仅意图阐释本发明，决不应解释为限制本发明。

实施例

实施例1

制备含有1％w／v吐温80的0.05wt％CsA含水溶液并将其储存 在65℃下。在储存24小时之后通过沉淀形成环孢素的新晶型。

实施例2

在室温下将环孢素A(30.19g)悬浮在900mL于水中的1％w／v 吐温80中。将悬液加热至65℃并在52℃下用0.2g环孢素A型2接 种。将悬液在65-61℃下搅拌22-23小时。通过真空过滤回收沉淀的 固体，用水洗涤并首先在40℃下于真空中干燥，然后在室温下干燥。 产量为30.3g。

实施例3

制备含有1w／v％聚山梨醇酯80(PS80)和过量CsA型2的水性悬 液并储存在25℃和40℃下。将固体残渣样品在24个月期间进行收集 并通过X-射线粉末衍射进行分析。图5示出在24个月之后收集样 品的XRPD衍射图。与型2的参考衍射图相比，无变化指示型2在测 定条件下为物理稳定的。

实施例4

制备环孢素型2在5％w／v透明质酸凝胶于水中的悬液并储存在 25℃下。将样品在6个月期间进行收集并通过X-射线粉末衍射进行 分析。图6示出在6个月之后收集样品的XRPD衍射图。与型2的 参考衍射图相比，无变化指示型2在测定条件下为物理稳定的。

尽管已就这些具体实施例对本发明进行了描述，但应理解，可 在不违背本发明精神的情况下进行其它修改和变更。