一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法。该方法选择毒性敏感的单细胞斜生栅藻作为受试生物，对待测水样实验组和空白对照组进行24h适应性培养，测量两组样品藻类的快相叶绿素荧光，分析获得主导光合作用能量传递过程的荧光参数，计算出实验组的待测水体对藻类光合作用的抑制率，根据物质毒性强度与光合作用抑制率间的剂量-效应关系，计算得到待测水体的综合毒性强度。该方法具有毒性响应灵敏、测试简单快速等特点，是生态风险快速评价和突发性污染事故应急监测的新手段。

说明书

技术领域

本发明属于环境科学领域，具体涉及一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法。 

背景技术

随着我国经济的迅速发展，工农业废水和生活污水日益增多，严重超出了自然界自身的净化能力，给水生生态系统和人类生存环境构成了很大的冲击。由于污染物化学组成、结构和来源的复杂性，及各种化学物质之间的拮抗、抑制和协同作用，使得传统的理化分析无法直接、全面地反映出多种污染物质对生态环境的综合影响。生物毒性检测方法能够综合多种污染物质的相互作用，判定污染物质浓度和生物效应之间的直接关系，直观地反映污染水体对生物种群的综合毒性，弥补理化方法的不足，因而在水体综合毒性评价方面极具优势。 

水体综合毒性的生物检测方法目前主要有：鱼类毒性实验、蚤类毒性实验、藻类毒性实验、微生物毒性实验等。其中，藻类毒性实验采用个体小、繁殖快的藻类细胞作为受试生物，具有毒物敏感、可直接观察细胞水平上的中毒症状等特点，在水体综合毒性分析与检测中具有广泛的应用前景。目前，藻类毒性实验主要通过分析有毒物质对藻类对呼吸作用、酶的活性、蛋白含量和细胞生长的抑制作用来检测水体的综合毒性强度。其中，基于藻类细胞生长速率的藻类生长抑制试验已经成为化学品毒性检测的国际标准方法，该方法检测结果准确可靠，但实验周期较长，需要重复实验，操作比较繁琐。基于藻类细胞呼吸作用、酶的活性、蛋白含量的毒性实验也存在实验工作量大，实验周期较长等问题。 

综上所述，藻类是一种理想的水体综合毒性的受试生物，然而，多数藻类毒性实验存在实验周期较长，需要重复实验，操作比较繁琐等缺陷。鉴于此，本文发明了一种藻类快相叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法，不仅对水体综合毒性具有较快的反应速度，而且能够实现毒性强度的定量检测。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法。该方法利用单细胞藻类光合系统对毒性响应的敏感性，以不易受干扰的快 相叶绿素荧光作为光合作用探针，分析有毒物质对藻类细胞光合作用的抑制程度，定量检测水体综合毒性强度。该方法具有毒性响应灵敏、测试快速、操作简单等特点，能够实现水体综合毒性强度快速定量检测，适用于水生生态风险的快速评价与突发性水污染事故的应急监测。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法，包括以下步骤： 

(1)受试藻类培养 

以斜生栅藻作为受试生物，并配制SE培养基，高温高压灭菌，将藻种转接到培养基中，放入光照培养箱中进行的扩大、驯化培养和藻种转接，使藻种达到纯化和同步生长，培养条件设置如下：光照2000-3000lux、光暗比14h∶10h、pH值8±1、温度25±2℃，每日摇动1次，在藻类培养过程中，定期利用显微细胞计数法测量藻类细胞生物量，绘制藻类生长曲线，最终得到处于对数生长期，细胞浓度在10⁴Cell/mL量级的受试藻液； 

实验在250mL的锥形瓶中进行，将受试藻液分成实验组和对照组，每组100mL，在实验组藻液中按体积比1∶1加入待测水样，在对照组藻液中按体积比1∶1加入空白水样，即蒸馏水)实验组和对照组设定3个平行样，培养过程中，每天摇动锥形瓶1次，通过改变培养瓶在光照培养箱中的位置，尽量保持实验组与对照组的培养环境一致； 

(2)多荧光参数的毒性测试反应终点建立 

①快相叶绿素荧光测量 

快相叶绿素荧光的测量采用英国Chelsea公司高速重复脉冲式荧光仪FASTflow，测量过程中，高速脉冲光激发光合系统II的反应中心产生大量电子，阻塞电子传递链，关闭光化学反应，产生快相叶绿素荧光；由于光合过程电子传递过程中电子受体Q_A和PQ的氧化还原周期不同，可以通过调节FASTflow激发光时序控制传递链电子阻塞位置，实现单周转和多周转两种模式激发； 

②快相叶绿素荧光分析 

单周转激发模式ST：使用高强度和高频率激发脉冲光在Q_A单个光化学周转120-160μs内将其全部还原，在Q_A处形成电子堆积，打断光合作用的电子传递链，产生ST快相叶绿素荧光，利用(1-3)式可拟合和推算出PSII的有效吸收截面σ_PSII、电荷分离效率Φ_q和最大光量子效率Δφ_sat等荧光参数； 

$F_n=F_o+(F_m-F_o)·[1-\exp (-E_n·{\sigma }_{\mathrm{PSII}})]·\underset{j=0}{\overset{n-1}{\Sigma }}\exp [-j(E_n·{\sigma }_{\mathrm{PSII}}+\mathrm{\Delta \tau }/{\tau }_{\mathrm{dec}})]---\left(1\right)$

Φ_q＝(F_m-F_a)/(F_m-F_o)                  (2) 

Δφ_sat＝(F_m-F_o)/F_m＝k·η_PSII                  (3) 

其中，F_n为第n个脉冲激发的荧光强度，E_n为第n个激发脉冲的强度，Δt为激发脉冲间隔；τ_dec为可变荧光衰减时间常数，F_o为本底荧光，F_a为环境光照下的荧光产率，F_m为反应中心完全关闭是的最大荧光，n_PSII为有效反应中心数量，k为常数； 

多周转激发模式MT：使用低频脉冲光在60-500ms时间内提供激发能量，使Q_A发生更多氧化还原反应，将电子传递到PQ池，在PQ重新氧化前形成电子累积，阻塞光化学反应的能量传递，产生MT快相叶绿素荧光，利用(4)式可推算出PSII到PSI的电子转移效率Φ_e； 

${\Phi }_e=F_v^{\mathrm{ST}}/F_v^{\mathrm{MT}}=(F_m^{\mathrm{ST}}-F_o^{\mathrm{ST}})/(F_m^{\mathrm{MT}}-F_o^{\mathrm{MT}})---\left(4\right)$

式中和分别为单周转和多周期模式下的本底荧光和最大荧光。 

③毒性测试的反应终点建立 

依据生物能流理论，捕光色素LHCII吸收光能后，通过色素间能量传递将能量转移至有效光合反应中心RCII，激发反应中心叶绿素a分子，激发态叶绿素a分子共有三种去活化途径，参与光化学反应P、热能的形式散失H和向外辐射荧光F，光化学反应过程是利用激发能进行原初电荷分离，产生电子，电子经电子传递链Q_A、Q_B和PQ传递给光合系统I，最终转化为固定二氧化碳的同化力，即ATP和NADPH，参与暗反应，从能流角度分析，参与光化学反应能量P与有效光合反应中心数量n_PSII，吸收截面σ_PSII、电荷分离效率为Φ_q、电子转移效率为Φ_e线性相关，因此，在强度为I的光辐射下，P大小可按(5)式推算； 

P＝I·η_PSII·σ_PSII·Φ_q·Φ_e＝I·k·σ_PSII·Φ_q·Φ_e·Δφ_sat        (5) 

藻类光合作用速率Ψ是细胞吸收利用外界光能的效率，具体计算如(6)式所示；Ψ是光合系统对光能的吸收、传递和转化效率的线性叠加，全面反映了光合作用的能量传递过程，能够响应对光合系统作用位点和作用方式不同的物质毒性。因此，以Ψ作为毒性测试的反应终点，能够有效测试重金属、农药和有机污 染等物质毒性； 

Ψ＝P/I＝k·σ_PSII·Φ_q·Φ_e·Δφ_sat                  (6) 

(3)毒性强度与藻类光合作用抑制率间的剂量-效应关系建立 

①配制标准毒性参比物 

采用国际经合组织和美国环保局制定的化学品毒性检测标准方法藻类生长抑制试验作为物质毒性评价的标准方法，以毒性稳定的HgCl₂溶液作为毒性参比物，进行藻类生长抑制实验，按(7-8)式计算藻类的生长抑制率；以96小时50％的生长抑制率，即半数有效浓度EC_50-96作为1个综合毒性当量，获得HgCl₂溶液单位浓度的毒性强度； 

μ_i-j＝(lnX_j-lnX_i)/(t_j-t_i)                  (7) 

式中μ_i-j为从i时间到j时间的比生长率；X_i和X_j分别为i和j时间的生物量； 

I_r＝(μ_C-μ_T)/μ_C×100                  (8) 

式中I_r为以比生长率为基础的抑制率，％；μ_C为对照组各平行样藻类比生长率的平均值；μ_I为实验组各平行样藻类比生长率的平均值； 

②建立藻类光合作用抑制率和综合毒性强度间的剂量-效应关系 

将HgCl₂毒性参比物分别配制成多个浓度梯度的被试物质溶液，并以相应溶剂做空白对照，等剂量加入到受试藻液，形成多个毒性强度梯度的实验组和对照组，培养24小时后，测量快相叶绿素荧光曲线，计算出实验组的Ψ和对照组的Ψ，利用(9)式计算出藻类光合作用抑制率I_g； 

$I_g:[\%](1-\frac{\Psi \left(\mathrm{referenec}\right)}{\Psi \left(\mathrm{sample}\right)})\times 100---\left(9\right)$

采用对数阻滞增长模型拟合毒性强度T与藻类光合作用抑制率I_g之间的剂量-效应关系如(10)式所示； 

$I_g=I_{g\min }+\frac{I_{g\max }-I_{g\min }}{1+\exp (m\times (\mathrm{Log}{\mathrm{EC}}_{50}-T))}---\left(10\right)$

式中：I_g为光合性抑制率； 

I_gmin为完全抑制毒性强度对应的光合性抑制率； 

I_gmax为空白对照组对应的光合性抑制率； 

T为综合毒性强度； 

EC₅₀为I_r对应的半数效应毒性强度，通过模型参数率定方式获得； 

m为T等于EC₅₀时拟合曲线斜率； 

(4)水体综合毒性强度定量检测 

按(11)式即可计算出样品毒性强度T，待测水样检测结果取三个平行样综合毒性强的平均值。 

$T=\mathrm{Log}{\mathrm{EC}}_{50}-I_{g\min }+\frac{1}{m}\times \ln \left(\frac{I_{g\max }-I_g}{I_g-I_{g\min }}\right)---\left(11\right)$

本发明的有益效果： 

(1)本发明以快相叶绿素荧光作为藻类光合作用过程探针，通过分析毒性物质对藻类光合系统的抑制效应，来反演水体的综合毒性强度。该方法的主要优点：①藻类光合系统对物质毒性响应快速和灵敏，可将藻类毒性抑制实验周期缩短至24h；②快相叶绿素荧光过程持续时间短(一般0.3-1秒)，不受测试条件和外界环境事件干扰，利用藻类快相叶绿素荧光进行毒性检测，其测量结果稳定可靠； 

(2)本发明在生理能流理论基础上，利用快相叶绿素荧光曲线分析得到主导光合作用能量传递过程的荧光参数，建立了多荧光参数的藻类光合作用速率的计算方法。以此为毒性测试的反应终点，能够反映重金属、农药和有机污染等不同毒性物质(对光合系统的作用位点和作用方式不同)对藻类光合作用的抑制效应，从而实现未知水体的综合毒性检测； 

(3)本发明以毒性稳定的HgCl₂作为毒性参比物，以国际标准的化学品毒性检测方法(藻类生长抑制试验)作为综合毒性评价标准，采用对数阻滞增长模型拟合毒性强度与藻类光合作用抑制率之间的剂量-效应关系，建立了综合毒性强度定量分析方法，实现水体综合毒性强度定量检测。 

附图说明

图1为本发明检测方法原理框架图。 

图2为光合系统能量传递模型图。 

图3为Hg^-、Cd²⁺、阿特拉津和苯酚的毒性检测结果图。 

具体实施方式

一种基于藻类叶绿素荧光的水体综合毒性快速检测方法，包括以下步骤： 

(1)受试藻类培养 

以斜生栅藻作为受试生物，并配制SE培养基，高温高压灭菌，将藻种转接到培养基中，放入光照培养箱中进行的扩大、驯化培养和藻种转接，使藻种达到纯化和同步生长，培养条件设置如下：光照2000-3000lux、光暗比14h∶10h、pH值8±1、温度25±2℃，每日摇动1次，在藻类培养过程中，定期利用显微细胞计数法测量藻类细胞生物量，绘制藻类生长曲线，最终得到处于对数生长期，细胞浓度在10⁴Cell/mL量级的受试藻液； 

实验在250mL的锥形瓶中进行，将受试藻液分成实验组和对照组，每组100mL，在实验组藻液中按体积比1∶1加入待测水样，在对照组藻液中按体积比1∶1加入空白水样，即蒸馏水)实验组和对照组设定3个平行样，培养过程中，每天摇动锥形瓶1次，通过改变培养瓶在光照培养箱中的位置，尽量保持实验组与对照组的培养环境一致； 

(2)多荧光参数的毒性测试反应终点建立 

①快相叶绿素荧光测量 

快相叶绿素荧光的测量采用英国Chelsea公司高速重复脉冲式荧光仪FASTflow，测量过程中，高速脉冲光激发光合系统II的反应中心产生大量电子，阻塞电子传递链，关闭光化学反应，产生快相叶绿素荧光；由于光合过程电子传递过程中电子受体Q_A和PQ的氧化还原周期不同，可以通过调节FASTflow激发光时序控制传递链电子阻塞位置，实现单周转和多周转两种模式激发； 

②快相叶绿素荧光分析 

单周转激发模式ST：使用高强度和高频率激发脉冲光在Q_A单个光化学周转120-160μs内将其全部还原，在Q_A处形成电子堆积，打断光合作用的电子传递链，产生ST快相叶绿素荧光，利用(1-3)式可拟合和推算出PSII的有效吸收截面σ_PSII、电荷分离效率Φ_q和最大光量子效率Δφ_sat等荧光参数； 

$F_n=F_o+(F_m-F_o)·[1-\exp (-E_n·{\sigma }_{\mathrm{PSII}})]·\underset{j=0}{\overset{n-1}{\Sigma }}\exp [-j(E_n·{\sigma }_{\mathrm{PSII}}+\mathrm{\Delta \tau }/{\tau }_{\mathrm{dec}})]---\left(1\right)$

Φ_q＝(F_m-F_a)/(F_m-F_o)                  (2) 

Δφ_sat＝(F_m-F_o)/F_m＝k·n_PSII                  (3) 

其中，F_n为第n个脉冲激发的荧光强度，E_n为第n个激发脉冲的强度，Δt为激发脉冲间隔；τ_dec为可变荧光衰减时间常数，F_o为本底荧光，F_a为环境光照 下的荧光产率，F_m为反应中心完全关闭是的最大荧光，n_PSII为有效反应中心数量，k为常数； 

多周转激发模式MT：使用低频脉冲光在60-500ms时间内提供激发能量，使Q_A发生更多氧化还原反应，将电子传递到PQ池，在PQ重新氧化前形成电子累积，阻塞光化学反应的能量传递，产生MT快相叶绿素荧光，利用公式(4)可推算出PSII到PSI的电子转移效率Φ_e； 

${\Phi }_e=F_v^{\mathrm{ST}}/F_v^{\mathrm{MT}}=(F_m^{\mathrm{ST}}-F_o^{\mathrm{ST}})/(F_m^{\mathrm{MT}}-F_o^{\mathrm{MT}})---\left(4\right)$

式中和分别为单周转和多周期模式下的本底荧光和最大荧光； 

③毒性测试的反应终点建立 

藻类光合作用的能量传递过程如图2所示，依据生物能流理论，捕光色素LHCII吸收光能后，通过色素间能量传递将能量转移至有效光合反应中心RCII，激发反应中心叶绿素a分子，激发态叶绿素a分子共有三种去活化途径，参与光化学反应P、热能的形式散失H和向外辐射荧光F，光化学反应过程是利用激发能进行原初电荷分离，产生电子，电子经电子传递链Q_A、Q_B和PQ传递给光合系统I，最终转化为固定二氧化碳的同化力，即ATP和NADPH，参与暗反应，从能流角度分析，参与光化学反应能量P与有效光合反应中心数量n_PSII，吸收截面σ _PSII、电荷分离效率为Φ_q、电子转移效率为Φ_e线性相关，因此，在强度为I的光辐射下，P大小可按(5)式推算； 

P＝I·η_PSII·σ_PSII·Φ_q·Φ_e＝I·k·σ_PSII·Φ_q·Φ_e·Δφ_sat       (5) 

藻类光合作用速率Ψ是细胞吸收利用外界光能的效率，具体计算如(6)式所示；Ψ是光合系统对光能的吸收、传递和转化效率的线性叠加，全面反映了光合作用的能量传递过程，能够响应对光合系统作用位点和作用方式不同的物质毒性。因此，以Ψ作为毒性测试的反应终点，能够有效测试重金属、农药和有机污染等物质毒性； 

Ψ＝P/I＝k·σ_PSII·Φ_q·Φ_e·Δφ_sat                  (6) 

(3)毒性强度与藻类光合作用抑制率间的剂量-效应关系建立 

①配制标准毒性参比物 

采用国际经合组织和美国环保局制定的化学品毒性检测标准方法藻类生长抑制试验作为物质毒性评价的标准方法，以毒性稳定的HgCl₂溶液作为毒性参比 物，进行藻类生长抑制实验，按(7-8)式计算藻类的生长抑制率；以96小时50％的生长抑制率，即半数有效浓度EC_50-96作为1个综合毒性当量，获得HgCl₂溶液单位浓度的毒性强度； 

μ_i-j＝(lnX_j-lnX_i)/(t_j-t_i)                  (7) 

式中μ_i-j为从i时间到j时间的比生长率；X_i和X_j分别为i和j时间的生物量； 

I_r＝(μ_C-μ_T)/μ_C×100                  (8) 

式中I_r为以比生长率为基础的抑制率，％；μ_C为对照组各平行样藻类比生长率的平均值；μ_T为实验组各平行样藻类比生长率的平均值； 

②建立藻类光合作用抑制率和综合毒性强度间的剂量-效应关系 

将HgCl₂毒性参比物分别配制成多个浓度梯度的被试物质溶液，并以相应溶剂做空白对照，等剂量加入到受试藻液，形成多个毒性强度梯度的实验组和对照组，培养24小时后，测量快相叶绿素荧光曲线，计算出实验组的Ψ和对照组的Ψ，利用(9)式计算出藻类光合作用抑制率I_g； 

$I_g:[\%](1-\frac{\Psi \left(\mathrm{referenec}\right)}{\Psi \left(\mathrm{sample}\right)})\times 100---\left(9\right)$

采用对数阻滞增长模型拟合毒性强度T与藻类光合作用抑制率I_g之间的剂量-效应关系如(10)式所示； 

$I_g=I_{g\min }+\frac{I_{g\max }-I_{g\min }}{1+\exp (m\times (\mathrm{Log}{\mathrm{EC}}_{50}-T))}---\left(10\right)$

式中：I_g为光合性抑制率； 

I_gmin为完全抑制毒性强度对应的光合性抑制率； 

I_gmax为空白对照组对应的光合性抑制率； 

T为综合毒性强度； 

EC₅₀为I_r对应的半数效应毒性强度，通过模型参数率定方式获得； 

m为T等于EC₅₀时拟合曲线斜率； 

(4)水体综合毒性强度定量检测 

按(11)式即可计算出样品毒性强度T，待测水样检测结果取三个平行样综合毒性强的平均值。 

$T=\mathrm{Log}{\mathrm{EC}}_{50}-I_{g\min }+\frac{1}{m}\times \ln \left(\frac{I_{g\max }-I_g}{I_g-I_{g\min }}\right)---\left(11\right)$

利用本发明中提出的基于藻类快相叶绿素荧光的水体综合毒性检测方法，对Hg^-、Cd²⁺、阿特拉津和苯酚等毒性物质进行了检测。首先通过96h生长抑制实验确定1个毒性单量对应Hg^-、Cd²⁺、阿特拉津和苯酚物质的浓度分别为0.643mg/L、1.437mg/L、150.5ug/L和165.86mg/L。然后，在1-12TU范围内分别配制四种物质9个毒性梯度的待测溶液，利用本发明中提出的水体综合毒性检测方法对待测溶液进行测试，测试结果图3所示。从测试结果上看，毒性的检测结果与待测溶液的标准毒性强度之间具有较高的一致性，另外，基于藻类快相叶绿素荧光的水体综合毒性检测方法，将藻类毒性抑制实验周期缩短至24h，可用于重金属、农药和有机污染物等毒性物质快速有效测量。