靶向转染肽核酸的超声微泡及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及基因超声靶向转染领域，具体涉及一种用于C-myc肽核酸超声靶向转染的超声微泡及其制备方法，所述超声微泡装载有肽核酸，所述肽核酸为C-myc原癌基因的反义核酸制备的肽核酸，所述反义核酸的核酸序列如下：5’-AGCGAGGATATCTGG AAGAAATTCGAG-3’。所述靶向转染肽核酸的超声微泡的制备方法，包括如下步骤：在制备超声微泡时加入C-myc原癌基因的反义核酸制备的肽核酸。本发明在制备超声微泡时在白蛋白溶液中加入定量PNA，使其包被于微泡壁白蛋白基质中并形成微泡壁结构的一部分，在超声场作用下靶向转染，转染效率高，转染率可达30%以上。

说明书

技术领域

本发明涉及基因超声靶向转染领域，具体涉及一种靶向转染肽核酸的超声微泡及其制备方法和应用。

背景技术

C-myc原癌基因是myc基因家族的重要成员之一，是多种生长因子刺激后诱导的即刻早期基因。它既是一种可易位基因，又是一种多种物质调节的可调节基因。C-Myc在胞浆内合成后，与其它蛋白形成寡聚体，再转移到核内，并结合到特异性的DNA序列上，从而激活和抑制许多靶基因的转录，引起细胞生长和分化的改变，发挥其生理调节功能及恶性转化作用。是一种可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进细胞分裂的基因。myc基因参予细胞凋零、多种肿瘤发生发展、血管损伤后内膜平滑肌细胞早期诱导、分化、增殖和迁移以及内膜细胞间基质的合成与堆积调节。

反义寡核苷酸靶向抑制肿瘤、平滑肌细胞增生相关癌基因的体外研究已取得极大的进展，作为基因药物应用于体内受限主要是它极易被核酸酶降解使其半衰期极短；进入特定的靶细胞较难且较少。因此，许多学者希望通过对其进行化学修饰增加其抵抗核酸酶的能力；用病毒携带增加其转染特异性等。但丹麦哥本哈根大学的Nielsen等设计合成的肽核酸（PNA）是已知DNA或RNA最成功的类似物。

PNA是一类人工合成的DNA或RNA类似分子，与核酸分子不同之处是将DNA或RNA分子中的磷酸脱氧核糖核酸或磷酸核糖骨架由重复排列的有酰胺键连接的N-2-乙基甘氨酸单位（肽链）取代。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞，其细胞毒性较低。这些都是其他寡核苷酸所不具备的优点。可作为基因探针，并能以反义序列的形式用于基因功能、基因表达调控等研究。

在药用研究方面，目前，它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂。根据PNA的代谢稳定性，主要将其用于抑制基因表达的反义药物研究领域，国外几家制药及生物技术公司，ISIS、PE等公司均投入大量精力从事开发研究；根据其与DNA优良的杂交稳定性，PNA又被广泛用于DNA分子识别和操纵。

尽管反义PNA具有特异性强、稳定性好等特点，并可能在基因的复制、转录和翻译等环节上抑制或下调靶基因的表达，达到治疗疾病的目的，但目前存在的问题是作为药用PNA不易进入细胞，进一步提高组织和细胞对反义PNA的摄人量及反义PNA进入细胞核一直是影响其广泛应用于临床的关键问题。

超声造影技术的不断发展和可携带基因的微泡声学造影剂的研制，使得超声已经从一种临床诊断工具，进入到治疗领域。将二者结合起来用于肿瘤或心血管疾病等的治疗，为这些患者提供一条安全、高效的治疗途径。微泡造影剂联合诊断超声介导基因靶向传输，是一种新型、无创、高效、简便易普及的技术。超声触发破坏微泡方法被认为可作为特定器官的靶基因治疗手段。其基本原理为：(1)超声造影剂是基因的良好载体，与病毒载体相比，造影剂微泡有更大的容量，可携带反义寡核苷酸，任意片断DNA，乃至整个染色体。(2)造影剂降低了超声的空化域值，超声照射可在特定空间(聚焦区)和特定时间破坏造影剂微泡，产生空化效应和声化学效应，使周围靶细胞(包括血管内皮细胞和组织细胞)细胞间隙增宽，膜通透性增大，细胞表面一过性小孔形成(声孔效应)，同时微泡破裂时产生的冲击波，微声流作为一种驱动力量，促使从微泡上释放出来的基因通过破裂的微血管和内皮细胞间隙进入靶细胞。

由于PNA是水溶性，进入细胞较难，以往人们采用脂质体末段标记方法将其带入细胞，但细胞摄入量有限，在体较难发挥作用；应用高效脂质体如阳离子脂质体等可能产生细胞毒性。

超声微泡尤其是以白蛋白为原料制备的超声微泡具低毒性、低免疫原性、低侵袭力、器官特异性、可重复应用以及广泛的适用性，作为携带治疗基因的载体，并用超声触发破坏微泡技术以对肿瘤、心肌、血管、骨骼肌等靶组织进行了一定的研究。这些微泡携带DNA的量从10g到2mg不等；单用超声照射可使裸DNA对血管内皮细胞的转染率提高10倍，如联合使用微泡造影剂，则可使基因的转染率提高3000倍。以往在制备超声微泡基因载体时大多是先制备微泡然后再将其与基因或质粒连接，结合稳定性和承载量较难估计，靶向转染基因的量和效果较难控制。

发明内容

为了解决上述现有技术中PNA和超声微泡存在的缺陷，本发明的目的是提供一种用于C-myc肽核酸超声靶向转染的超声微泡，即在制备超声微泡时在白蛋白溶液中加入定量PNA，使其包被于微泡壁白蛋白基质中并形成微泡壁结构的一部分，在超声场作用下靶向转染进入细胞核。

本发明的技术方案为提供一种靶向转染肽核酸的超声微泡，所述超声微泡装载有肽核酸，所述肽核酸为C-myc原癌基因的反义核酸制备的肽核酸，所述反义核酸的核酸序列如下：5’-AGCGAGGATATCTGG AAGAAATTCGAG-3’。

本发明的另一技术方案为提供一种靶向转染肽核酸的超声微泡的制备方法，包括如下步骤：在制备超声微泡时在白蛋白溶液中加入权利要求1所述的C-myc原癌基因的反义核酸制备的肽核酸。

优选的，上述的靶向转染肽核酸的超声微泡的制备方法，具体包括如下步骤：

a、取包含蔗糖的5%牛血清白蛋白液体10ml，加入2mg合成的如权利要求1所述的C-myc原癌基因的反义核酸制备的肽核酸，混匀得液体A，所述蔗糖在牛血清白蛋白液体中的质量体积百分数为10%；

b、依次用氧气和氟碳气体饱和液体A，超声波发生器处理后即得超声微泡。

优选的，上述的靶向转染肽核酸的超声微泡的制备方法中，所述超声微泡的浓度0.8-1.8×10⁹个/ml。

优选的，上述的靶向转染肽核酸的超声微泡的制备方法中，所述氧气和氟碳气体的流量为6ml.min^-1。

优选的，上述的靶向转染肽核酸的超声微泡的制备方法中，所述超声波发生器处理具体为：超声波发生器输出功率180W，频率为20kHz条件下处理1min。

本发明的又一技术方案为提供一种上述靶向转染肽核酸的超声微泡在制备治疗C-myc原癌基因相关疾病的药物中的应用。

本发明有益效果：本发明考虑到PNA从结构上属肽类，其物理性状与白蛋白相似且不荷电，与白蛋白间不产生理化作用，同溶于水，因此，在制备超声微泡时在白蛋白溶液中加入定量PNA，使其包被于微泡壁白蛋白基质中并形成微泡壁结构的一部分，在超声场作用下靶向转染，转染效率高。在本发明的一个实施例里，制备兔髂动脉内膜增生模型，设计合成针对兔C-myc mRNA原癌基因的肽核酸，用白蛋白作为原料制备超声微泡，在超声场作用下靶向转染血管内膜，转染效果较高，转染率可达30%以上。

附图说明

图1：HRP-Streptavindin和trueblueTM染色显示血管内膜反义寡c-myc PNA转染阳性SMC，100×；

图2：HRP-Streptavindin和trueblueTM染色显示血管内膜反义寡c-myc PNA转染阳性细胞，400×；

图3：血管损伤后1周血管壁经弹力纤维染色显示内膜明显增厚，管腔内可见血栓形成，200×；

图4：免疫组化染色显示增生的血管内膜可见较多PCNA反应阳性细胞，200×。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

实施例

1.本发明用于C-myc肽核酸超声靶向转染的超声微泡的制备及其转染

1.1 C-myc mRNA原癌基因的肽核酸设计：

对比分析原核及真核动物包括病毒（v-myc）、小鼠、大鼠、兔、羊、猫、狗、猪和人c-myc原癌基因的cDNA序列，发现其自转录起始密码开始下游133位至177位共45个碱基序列完全相同。根据核酸探针设计原则设计针对c-mycmRNA的肽核酸（PNA）序列如下（共27个碱基）：136位到162位，5，-AGC GAGGAT ATC TGG AAG AAA TTC GAG-3，由北京奥科生物技术有限公司合成，其5’氨基端以生物素分子标记。

1.2 载上述PNA的超声微泡的制备

无菌制备含10%(g.ml^-1)蔗糖的5%(g.ml^-1)牛血清白蛋白液体10ml，置于有盖50ml塑料离心管中；加入2mg上述步骤合成的PNA并充分混匀；依次用氧气和氟碳气体饱和上述混匀的液体（流量：6ml.min^-1），约10min，超声波发生器处理1min（条件：180W，固定频率20kHz）；调整微泡浓度0.8-1.8×10⁹个/ml，PNA含量为0.2mg/ml，将制备的微泡4℃下密闭保存备用。取部分显微镜观察微泡形态并计数；Zetasizer3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。

1.3 血管造模和超声靶向转染

纯种新西兰兔22只（雄性，2.3-2.5kg），随机分为分组：

（1）实验组（n=12）：经股动脉插管，球囊剥脱一侧髂动脉内膜造成内膜损伤和增生模型。选择肝脏为超声显影对照器官。

术后二维超声经腹壁观察肝脏显影后经耳缘静脉注入载PNA白蛋白微泡剂5ml(含PNA1mg)并观察到肝脏显影明显增强，立即经皮行局部受损血管治疗性超声照射（超声频率1MHz，强度1.5W/cm²，6min）并观察到肝脏显影逐步恢复至正常。

（2）对照组（n=10）：球囊剥脱内膜后经静脉输入等量生理盐水及同等条件超声的治疗。

1.4 取材和病理检查

术后1周气体栓塞处死动物，取实验髂动脉血管大体观察后石蜡包埋，常规病理活检，石蜡包埋切片做HE、马氏三色、弹力纤维染色；真彩色病理图像分析仪（Leica）直接进行血管内膜形态测量；免疫组织化学染色。

1.5 原位转基因效果检测

石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS及SSC洗并加入稀释的HRP-Streptavindin(晶美生物工程公司)37℃孵育，1×biotin wash solusion洗后加入trueblueTM染色和Orcein对比染色，二甲苯透明并封片。阳性产物为在胞浆或细胞核内蓝绿色颗粒状沉淀物。计数各段动脉横切面血管壁200个细胞所占的阳性细胞数，计算阳性细胞百分率作为转染率。

1.6 免疫组化染色

采用标记抗生蛋白链菌素生物素法（LSAB法）并按试剂盒说明操作。I抗体为小鼠抗SMC^α-actin单克隆抗体（DACO，1:200稀释）和小鼠抗PCNA单克隆抗体（DACO，1:100稀释）由福建迈新公司提供。计数各段动脉横切面内膜中200个细胞所占的PCNA阳性细胞数，求其平均值作为实际计数。

2 结果分析：

实验数据均用SPSS for Window11.0处理，数据采用χ±s表示，组间差异采用方差分析。P＜0.05为统计学上有显著性。

2.1 超声微泡的物理表征

制备的超声微泡园球形囊泡状，大小较一致，分散良好，直径2-5μm。经4℃保存2周后未发生微泡融合、破裂，形态学上未发生改变，计数与新制备的微泡溶液差别不显著，对热稳定性良好（40℃，30min）。

2.2 靶向转PNA效果

对照组血管壁未见PNA转染阳性细胞。实验组在血管中层可见少量阳性细胞，阳性细胞主要分布在增生的内膜（请参阅图1和图2），计数平均为（67.25±25.10个），转染率为33.63%。

2.3 血管壁病理及免疫组化改变

球囊损伤兔髂动脉后1周见内皮缺失，内膜增厚，内膜细胞明显增多，管腔变窄，可见血栓形成（请参阅图3）。免疫组化显示大多数细胞抗α-actin抗体反应阳性，反映这些增生细胞是SMC；部分细胞显示PCNA阳性，表明这些细胞增生较为活跃（请参阅图4）。病理形态测量及免疫组化阳性计数以及反义PNA对这些指标影响见下表1。可见反义PNA明显抑制内膜增厚和内膜细胞表达PCNA。表1为反义PNA对血管损伤后1周内膜厚度、面积和PCNA表达的影响（χ±s），其中*P＜0.05；**P＜0.01。

表1

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。