一种杰兔越橘组织培养的增殖培养基

摘要

本发明公开了一种杰兔越橘组织培养的增殖培养基：改良WPM培养基+玉米素2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为4.8-5.0；每升改良WPM培养基中含大量元素：1071.6mg硝酸钾、370mg硫酸镁、96mg氯化钙、170mg磷酸二氢钾；铁盐：37.3mg乙二胺四乙酸二钠、27.8mg硫酸亚铁；微量元素：22.3mg硫酸锰、8.6mg硫酸锌、0.025mg硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2mg硼酸；有机物：0.5mg烟酸、0.5mg盐酸硫胺素、0.5mg盐酸毗哆醇、l00mg肌醇、2mg甘氨酸，采用该培养基30d增殖倍数达到9.8倍。

说明书

技术领域

本发明涉及一种改良的越橘增殖培养基。

背景技术

越橘是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)灌木类小浆果果树。其果实为蓝色或红色，酸甜适中，具有极高的营养价值和医疗保健作用，特别是抗氧化能力为所有果品蔬菜之首，对防止人体细胞衰老,预防老年性疾病(心脏病、白内障、癌症、记忆力衰退等)具有特殊功效，但常规繁殖方法不能满足快速发展的需要。采用组织培养离体快繁越桔的研究已有报道，但由于木本植物组培生长速度慢，仍然影响了越橘的快速发展，优化越橘培养基配方显得极其重要。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种既能提高杰兔越橘的增殖倍数，又能缩短增殖周期，且增殖苗生长健壮的杰兔越橘增殖的培养基及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种杰兔越橘组织培养的增殖培养基，包括如下组分：改良WPM培养基+玉米素0.5-0.8mg·L^-1+蔗糖30 g·L^-1+琼脂8-9 g·L^-1，pH为4.8-5.0

上述改良WPM基本培养基包括如下组分：

大量元素：1071.6 mg·L^-1硝酸钾、 370 mg·L^-1硫酸镁、96 mg·L^-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；

微量元素：22.3 mg·L^-1硫酸锰、8.6 mg·L^-1硫酸锌、0.025 mg·L^-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L^-1硼酸；

铁盐：37.3 mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L^-1硫酸亚铁；

有机物：0.5 mg·L^-1烟酸、0.5 mg·L^-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L^-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L^-1肌醇、2 mg·L^-1甘氨酸；

蔗糖30 g·L^-1，琼脂8-9 g·L^-1；

玉米素0.5-0.8 mg·L^-1 ；

其余为蒸馏水，pH为4.8-5.0。

上述越橘组织培养的增殖培养基的制备方法，该方法包括如下步骤： 

（1）配制改良WPM培养基：

(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO₃，53.58g；MgSO₄，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；

称取CaCl₂·2H₂O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ

称取KH₂PO₄，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；

使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；

(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO₄·H₂O，4.46g；ZnSO₄·7H₂O，1.72

g；H₃BO₃ 1.24g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g；CuSO₄·5H₂O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO₄·7H₂O和7.46gNa₂-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；

(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01gV_bl，0.01gV_b6，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(15)激素母液的配制：称取0.05gZR先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；

(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂8g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L^-1盐酸调pH至4.8-5.0，灭菌；待培养基温度降至60-70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1-1.6ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。

本发明的改良WPM培养基增殖方法为：

将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，光照时间为16小时。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

1.      组成培养基较传统培养基成分减少。

2.      采用该培养基进行增殖，增殖周期短，增殖倍数高。

3.      增殖苗健壮。

具体实施方式：

以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

实施例1：

将杰兔越橘接种于改良的WPM的增殖培养基中，其培养基成分和含量包括：

大量元素：1071.6 mg·L^-1硝酸钾、 370 mg·L^-1硫酸镁、96 mg·L^-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；

微量元素：22.3 mg·L^-1硫酸锰、8.6 mg·L^-1硫酸锌、0.025 mg·L^-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L^-1硼酸；

铁盐：37.3 mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L^-1硫酸亚铁；

有机物：0.5 mg·L^-1烟酸、0.5 mg·L^-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L^-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L^-1肌醇、2 mg·L^-1甘氨酸；

蔗糖30 g·L^-1，琼脂8 g·L^-1；

玉米素0.5 mg·L^-1 ；

其余为蒸馏水，pH为5.0；

制备方法如下：

（1）配制改良WPM培养基：

(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO₃，53.58g；MgSO₄，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；

称取CaCl₂·2H₂O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ

称取KH₂PO₄，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；

使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；

(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO₄·H₂O，4.46g；ZnSO₄·7H₂O，1.72

g；H₃BO₃ 1.24g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g；CuSO₄·5H₂O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO₄·7H₂O和7.46gNa₂-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；

(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(15)激素母液的配制：称取0.05gZR先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；

(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂8g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L^-1盐酸调pH至5.0，灭菌；待培养基温度降至60℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。

将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，每日光照时间为16小时。

30天后统计发现植株生长健壮，叶片呈绿色，植株增殖倍数达9.8。

 

实施例2：

将杰兔越橘接种于改良的WPM的增殖培养基中，其培养基成分和含量包括：

大量元素：1071.6 mg·L^-1硝酸钾、 370 mg·L^-1硫酸镁、96 mg·L^-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；

微量元素：22.3 mg·L^-1硫酸锰、8.6 mg·L^-1硫酸锌、0.025 mg·L^-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L^-1硼酸；

铁盐：37.3 mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L^-1硫酸亚铁；

有机物：0.5 mg·L^-1烟酸、0.5 mg·L^-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L^-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L^-1肌醇、2 mg·L^-1甘氨酸；

蔗糖30 g·L^-1，琼脂9 g·L^-1；

玉米素0.6 mg·L^-1 ；

其余为蒸馏水，pH为4.8；

制备方法如下：

（1）配制改良WPM培养基：

(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO₃，53.58g；MgSO₄，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；

称取CaCl₂·2H₂O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ

称取KH₂PO₄，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；

使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；

(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO₄·H₂O，4.46g；ZnSO₄·7H₂O，1.72

g；H₃BO₃ 1.24g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g；CuSO₄·5H₂O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO₄·7H₂O和7.46gNa₂-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；

(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(15)激素母液的配制：称取0.05gZR先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；

(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂9g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L^-1盐酸调pH至4.8，灭菌；待培养基温度降至70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1.2ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。

使用方法：将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，每日光照时间为16小时。

30天后统计发现植株生长健壮，叶片呈绿色，植株增殖倍数达9.2。

实施例3：

将“杰兔”越橘接种于改良的WPM的增殖培养基中，其培养基成分和含量包括：

大量元素：1071.6 mg·L^-1硝酸钾、 370 mg·L^-1硫酸镁、96 mg·L^-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；

微量元素：22.3 mg·L^-1硫酸锰、8.6 mg·L^-1硫酸锌、0.025 mg·L^-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L^-1硼酸；

铁盐：37.3 mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L^-1硫酸亚铁；

有机物：0.5 mg·L^-1烟酸、0.5 mg·L^-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L^-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L^-1肌醇、2 mg·L^-1甘氨酸；

蔗糖30 g·L^-1，琼脂8 g·L^-1；

玉米素0.8 mg·L^-1 ；

其余为蒸馏水，pH为4.9；

制备方法如下：

（1）配制改良WPM培养基：

(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO₃，53.58g；MgSO₄，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；

称取CaCl₂·2H₂O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ

称取KH₂PO₄，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；

使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；

(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO₄·H₂O，4.46g；ZnSO₄·7H₂O，1.72

g；H₃BO₃ 1.24g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g；CuSO₄·5H₂O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO₄·7H₂O和7.46gNa₂-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；

(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(15)激素母液的配制：称取0.05g玉米素，先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；

(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂8g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L^-1盐酸调pH至4.9，灭菌；待培养基温度降至70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1.6ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。

使用方法：将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，每日光照时间为16小时。

30天后统计发现植株生长健壮，叶片呈绿色，植株增殖倍数达9.6。

 

对照例：

将杰兔越橘接种于传统的WPM的增殖培养基中，其培养基成分和含量包括：

大量元素：1071.6 mg·L^-1硝酸钾、 900mg·L^-1硫酸钾、370mg·L^-1硫酸镁、96 mg·L^-1氯化钙、 556 mg·L^-1硝酸钙、170 mg·L^-1磷酸二氢钾；

微量元素：22.3 mg·L^-1硫酸锰、8.6 mg·L^-1硫酸锌、0.025 mg·L^-1硫酸铜、0.25 mg·L^-1钼酸钠、6.2mg·L^-1硼酸；

铁盐：37.3 mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L^-1硫酸亚铁；

有机物：0.5 mg·L^-1烟酸、0.5 mg·L^-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L^-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L^-1肌醇、2 mg·L^-1甘氨酸；

蔗糖30 g·L^-1，琼脂7 g·L^-1

玉米素0.5mg·L^-1 ；

其余为蒸馏水，pH为5.4；

制备方法如下： 

（1）配制改良WPM培养基：

(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO₃，53.58g；K₂SO₄，45g；MgSO₄，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；

称取CaCl₂·2H₂O，4.8g；Ca（NO₃）₂·4H₂O，27.8g；用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ

称取KH₂PO₄，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；

使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；

(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO₄·H₂O，4.46g；ZnSO₄·7H₂O，1.72

g；H₃BO₃ 1.24g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g；CuSO₄·5H₂O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO₄·7H₂O和7.46gNa₂-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；

(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；

(15)激素母液的配制：称取0.05g玉米素，先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；

(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂7g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L^-1盐酸调pH至5.4，灭菌；待培养基温度降至60℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。

使用方法：将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度25-27℃，每日光照时间为16小时。

30天后统计发现植株生长缓慢，叶片偏黄，植株增殖倍数为4.4。