一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法

摘要

本发明提出了一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法，主要步骤包括：构建LIC载体质粒LIC-A；制备LIC-A线性载体；构建组装DNA片段的受体载体puc-Kana；选择目标基因，划分300bp左右的小片段进行合成；多个小片段DNA利用金门克隆反应组装成大片段基因。本发明操作简单，无需再重复做克隆和测序的操作，直接退火，克隆效率高，使用了发光报告基因sfgfp、gfp，筛选方法直观，合成方法的错误率很低，合成基因的周期短，大大节约了成本，节约了时间。本发明适用于各种基因的合成，对于大基因的合成特别有效。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因合成方法的研究，是一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合 成基因的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

合成生物学是生命科学在二十一世纪刚刚出现的一个分支学科，近年来合成生物学的 研究进展很快，特别是基因合成技术。全基因合成是依照某一蛋白质的基因序列，设计合 成相互重叠的单链寡核苷酸，再通过重叠延伸PCR法拼接出全长，基因合成无需模板，是获 取基因的手段之一。通过全基因合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常 规手段。因此，建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因 的方法十分重要。

随着合成生物学的研究越来越流行，人们对生命的探究不再仅仅局限在宏观生物上，而 是从更简单的基本单元基因着手，至从上个世纪70年代以来分子生物学基因工程迅猛发展 ，到目前为止DNA合成的方法主要集中3种方法：（1）化学合成方法，由于化学合成的原 理决定了化学法合成的DNA片段不可能太长，所以主要用于寡核苷酸的合成；（2）PCR介 导的合成方法，这种方法是可以合成大的DNA片段，而且周期也比较短，但是到目前为止 ，PCR介导的合成方法错误率比较高，尤其对于合成大于2kb以上的DNA由于错误率高，所 以为了得到正确的克隆，需要做多次克隆和测序的重复工作，这样成本会很高;而且由于是P CR介导的方法，需要DNA高温聚合酶和DNTP等试剂，这样成本会比较高;(3)非PCR介导的 方法，到目前为止报道的基于非PCR的DNA合成方法主要是DNA的固相合成技术。这种固 相合成技术，在合成中的错误率确实大大降低了很多，但是由于在合成的时候引物需要经 过特殊的修饰，再加上该方法需要建库，引物成本会比较高；其次是由于该方法每次只能 增加3个碱基，这样合成的速度会比较慢，特别对于大的DNA片段的合成，周期尤为长，虽 然可以实现自动化操作，但是对于一般的实验室研究不是很实用。

鉴于目前的基因合成的方法中错误率高，合成成本高等问题，有必要寻找新的基因合成 方法来解决现有技术存在的问题。

发明内容

本发明的目的是提出一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的一种新的 基因合成方法。该方法利用大肠杆菌自身的修复机制，在大肠杆菌中一步法合成DNA片段 ，并把DNA小片段组装合成基因。主要步骤包括：载体的改造，线性载体的制备，小DNA片 段的合成，组装DNA片段的载体的构建，多个300bp左右的DNA片段的组装合成基因。

具体做法如下：

1）、构建LIC载体LIC-A。

以商品化的pet23a和pLP-VSVG载体用常规方法构建T7-sfgfp质粒，以sfgfp-PF/PBR– PR、T7- sfgfp质粒为模板，通过PCR扩增得到线性载体骨架LIC（3.5kb）(序列列表对应为NO 1)；设计SPC-PF/SPC-PR(序列见表1)为两对引物，以T7- sfgfp为模板，通过PCR扩增得到SPC盒式结构（1kb）(序列列表对应为NO 2)，扩增好的SPC盒式结构的两端都带上了一个限制性酶切位点（BciVI）和13bp的片段填 充序列和T7启动子下游的10个碱基的序列；其次，在载体骨架LIC- A和SPC盒式结构两端引入了20 bp的同源序列，扩增获得的SPC盒式结构，通过无酶克隆的方式（Zhu D,Zhong X,Tan R, Chen L,Huang G,Li J,et al.High-throughput cloning of human liver complete open reading  frames using homologous recombination in Escherichia coli.[J]Anal Biochem.2010;397(2):162- 7）克隆到载体骨架LIC-A上。经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的LIC- A载体质粒(序列列表对应为NO3)，命名为LIC-A载体质粒（构建过程见图1）。

表1骨架载体LIC-A构建中使用的引物

2）、LIC-A线性载体的制备（如图2所示）。把测序正确的LIC- A质粒先用限制性内切酶BciVI在37℃酶切，并凝胶回收后的产物，然后再用T4 DNA聚合酶3次分别在加dGTP、dCTP、dTTP的保护下12℃利用T4DNA聚合酶3’- 5’外切酶活性的作用消化30min，溶液回收后备用，这样处理的载体在其3’端各突出13nt。

3）、构建组装DNA片段的受体载体puc-Kana，构建过程见图3。

首先，以PBR322-PF/PBR322-PR为引物(序列见表2)，以商品化的puc- 19质粒为模板，通过PCR扩增获得线性骨架载体片段PBR322(序列列表对应为NO4)；以gfp- PF/gfp-PR(序列见表2)为引物，以pGSilG- Lic为模板，通过PCR获得两端带有BspQI酶切位点和EarI酶切位点的gfp盒式结构（约1.0 kb）(序列列表对应为NO5)；以Kana-PF/Kana-PR(序列见表2)为引物，以pGSilG- Lic为模板通过PCR扩增，获得Kana盒式结构(序列列表对应为NO 6)。其次，通过重叠延伸PCR(Overlap Extension  PCR)将gfp盒式结构和Kana盒式结构拼接成gfp-Kana单元。

最后，将gfp- Kana单元和线性骨架载体片段PBR322进行1:3混合通过无酶克隆方式转化大肠杆菌XL- Gold进行克隆。挑取在蓝光仪下发绿光的菌落，通过质粒电泳、质粒酶切鉴定和质粒测序 等方式得到了正确的puc-Kana质粒，puc-Kana质粒大小为3686bp(序列列表对应为NO 7)。puc-Kana用于后续的金门克隆反应的受体载体用。

表2骨架载体puc-Kana构建中使用的引物

4）、选择目标基因，划分300bp左右的小片段进行合成。

先选择确定目标基因XY，将需要合成的目标基因的DNA序列按照每300bp左右进行划分 为G1、G2、G3、G4、G5……多个小片段，分别设计彼此重叠（overlapping ）17bp左右且无缝的引物序列对，每个300bp左右的片段需要合成12条长度为40- 45nt左右的寡核苷酸引物。再分别将合成好的12条寡核苷酸序列稀释成终浓度10 μM，然后分别取0.5μL至一PCR管内，加2ul的LA Taq Buffer最后加双蒸水至终体积20 μL混合，分别让其按照94℃5min，94℃à37℃slope20min，37℃ 7min的逐步降温的程序退火，且首尾两条引物的5’端分别引入13nt与线性载体同源互补的 序列。

将步骤2）准备好的线性载体与退火形成的小DNA片段混合，37℃放置30 min后转化大肠杆菌感受态细胞，通过重构T7 启动子启动下游报告基因sfgfp的表达，由于重组子质粒内含sfgfp的表达盒，其发光比普通g fp强，不需要借助蓝光仪等外界仪器就可以看见发光，从而可以很直观可视化的筛选发光的 重组子，所以可以直接通过筛选发光的菌落送测序就可以得到正确的序列。将测序正确重 组子分别命名为XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5……。

5、多个小片段DNA组装成大片段基因。

要合成大于300bp以上的DNA片段，需要用步骤4的XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5…… 质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒puc-Kana做金门克隆反应（Engler,C.,R. Kandzia,and S.Marillonnet,A one pot,one step,precision cloning method with high throughput capability. PLoS One,2008.3(11):p. e3647），这样就合成了与目标基因序列一致相同的合成基因，具体过程见图4。

合成的300bp左右的DNA片段XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5……转化大肠杆菌的菌落 是发光的，本发明构建的金门克隆受体载体puc- Kana也有gfp表达盒式结构，所以受体质粒转化大肠杆菌菌落也是发光的，而且puc- Kana受体载体和LIC- F供体质粒的抗性不一样，所以最后转化所得重组子可以通过Kana抗性的正筛选作用和gfp 的负筛选作用，这样可以使后期筛选重组子的工作进一步的简洁化和效率化。将PCR鉴定正 确的重组子送测序，就可以得到正确的完整的DNA序列，由于在后期的金门克隆反应中只 涉及到酶切连接反应，所以只要合成的小片段DNA是正确的，就不会突变，这样准确率很 高。

本发明的DNA合成方法具有以下优势：

（1）操作简单，合成成本低。现有的DNA合成方法的过程繁琐，合成的成本较高，比如DN  A纯化、PCR扩增反应、DNA酶切还有电泳等。而本发明的DNA合成过程只要将引物简 单稀释退火，再与载体孵育30min便可直接转化，主要利用了大肠杆菌自身的多核苷 酸激酶将引物的3’端磷酸化，然后再利用大肠杆菌自身的连接酶把缺刻的环状DNA 质粒进行连接和修复成环化质粒，大大简化了实验步骤，而且不需要用高温DNA聚合 酶，DNTP等试剂，节省了实验试剂，由于退火的条件简单，在退火的过程中甚至都 可以不需要PCR仪，不需要将DNA纯化、PCR反应、电泳、片段与载体的连接等操作， 而且具有较高的克隆效率。这样合成的成本主要就只有引物的合成成本，一方面节 约了大量时间，另一方面节省了大量人力，也大大降低了成本。

（2）克隆效率高，筛选方法直观。本发明合成DNA片段的方法是引物直接退火搭桥，任 意一条引物没有退火上去，下一条引物就不能退火，而且退火后的DNA与载体的连 接用的是LIC的克隆原理，LIC克隆是利用了碱基间氢键的力量以及大肠杆菌的DNA 修复能力，克隆效率不受体外连接效率的限制，克隆效率极其高。载体与片段退火 的两段DNA序列是不同的，因此也决定了目的DNA与载体退火时的方向，所以不会 出现DNA反向插入的情况。本发明选用的是重构T7 启动子启动sfgfp的表达，由于T7启动子在启动外源蛋白的表达的时候存在渗漏表达 ，再加上sfgfp比普通的gfp发光更强，所以即使不加任何诱导剂如IPTG等也能不借助 蓝光仪等任何仪器就能很直观的观察到发光的重组菌落。

（3）合成方法的错误率很低。本发明的DNA合成方法错误很低，没有经过任何方式处理 如MutS，核酸酶等降低突变率的方法处理，目前得到的数据中错误率大约在0.04%左 右。由于发明的合成方法中是用引物直接退火的，没有涉及PCR反应，所以引物的错 误率不会被积累和放大化。由于引物退火靠的是引物直接的氢键直接互补配对，只 要引物碱基中有大的缺失或错误，就可以进行淘汰一些错误的引物，从而降低错误 率。

（4）合成基因的周期短。本发明的合成方法错误率极低，用本发明的方法合成小基因， 一次就可得到正确的基因。对于大基因，可以先分成小片段（300bp左右）组装合成 ，然后再用金门克隆的方法把这些300bp左右的片段组装成完整的基因。本发明的基 因合成的方法对于大基因的合成特别有效，由于大基因在PCR的过程相对容易突变， 传统的Muts处理等校正突变的方法都比较麻烦，而本发明的方法相当于先把大基因 进行模块化，突变率极低，无需后期的校正突变的操作，这样就无需再重复做克隆 和测序的操作，这样就大大节约了成本，节约了时间，这样合成的周期就比较短。

附图说明

图1为载体LIC-A的构建过程。以实验室保存的载体质粒T7- sfgfp为骨架，改造载体，通过PCR和无酶克隆等操作构建载体LIC-A。

图2为线性LIC-A载体的制备过程。先用BciVI酶切，然后再用T4 DNA聚合酶3次分别在加dGTP,dCTP，dTTP的保护下12℃利用T4DNA聚合酶3’- 5’外切酶活性的作用消化30min，溶液回收后备用，这样处理的载体在其3’端各突出13nt

图3为载体puc-Kana的构建过程。以载体puc19和实验室保存的载体pGSiLG- Lic出发，通过PCR以及overlapping和无酶克隆等操作最终构建puc-Kana。

图4为以LIC-F供体质粒和puc-Kana受体载体做金门克隆反应的原理和流程图。

具体实施方式

下面以实施例对本发明进一步说明

实施例1：利用本发明，合成黑曲霉（Aspergillus  niger）来源的葡萄糖氧化酶（AGOX）基因。

1、使用发明内容的1）、2）、3）步骤分别制备合成LIC-A载体质粒、LIC- A线性载体，受体载体puc-Kana，备用。

2、先将目标基因AGOX的氨基酸（589个aa）序列分成10个小段，分别命名为 AG1、AG2、……AG10，每段大约为55-60个aa，再在DNA works在线软件设计无缝的引物序列，合成10组引物(每组10-12条)。

3、分别将合成好的每组12条寡核苷酸序列首先分别稀释成终浓度10 μM，然后分别取0.5μL至一PCR管内，加2ul的LA Taq Buffer最后加双蒸水至终体积20 μL（终浓度约为0.25μM），退火时在PCR仪上按照94℃5min，94℃à37℃slope 20min，37℃ 7min的逐步降温的程序对混合物进行处理，且在首尾两条引物的5’端分别引入13nt与线性 载体同源互补的序列（如图2所示）。

4、将步骤（1）准备好的线性载体LIC- A与步骤（3）退火形成的小DNA片段(AG1、AG2、……AG10)分别以1:3的比例混合，37℃放 置30min后分别转化Rosetta(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞，通过重构T7 启动子启动下游报告基因sfgfp的表达，不需要借助仪器直观可视化的筛选发光的重组子， 将筛选发光的菌落送测序就可以得到正确的序列，分别命名为LAG1、LAG2……LAG10。

5、将测序正确的质粒（LAG1、LAG2……LAG10和步骤（1）构建好的载体质粒puc- Kana按照以下体系和程序反应

反应体系：

反应程序：

反应完后取5ul直接转化大肠杆菌感受态细胞，涂LB+kana的平板，37度培养过夜，挑 取不发光的菌落进行PCR和质粒大小鉴定，再送去测序，就可以得到正确的全长的AGO  X的基因序列。

实施例2：利用本发明，合成产黄青霉（Penicillium chrysogenum Wisconsin54- 125）来源的脯氨酸内肽酶（SCP）基因。

1、使用发明内容的1）、2）、3）步骤分别制备合成LIC-A载体质粒、LIC- A线性载体，受体载体puc-Kana，备用。

2、先将目标基因SCP的氨基酸（543个aa）序列分成9个小段，分别命名为SP1、SP2、… …SP9，每段大约为55-60个aa，再在DNA works在线软件设计无缝的引物序列，合成9组引物(每组10-12条)。

3、分别将合成好的每组12条寡核苷酸序列首先分别稀释成终浓度10 μM，然后分别取0.5μL至一PCR管内，加2ul的LA Taq Buffer最后加双蒸水至终体积20 μL（终浓度约为0.25μM），退火时在PCR仪上按照94℃5min，94℃à37℃slope 20min，37℃ 7min的逐步降温的程序对混合物进行处理，且在首尾两条引物的5’端分别引入13nt与线性 载体同源互补的序列（如图2所示）。

4、将步骤（1）准备好的线性载体LIC- A与退火形成的小DNA片段(SP1、SP2、……SP9)分别以1:3的比例混合，37℃放置30 min后分别转化Rosetta(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞，通过重构T7 启动子启动下游报告基因sfgfp的表达，不需要借助仪器直观可视化的筛选发光的重组子， 将筛选发光的菌落送测序就可以得到正确的序列，分别命名为LSP1、LSP2……LSP9。

5、将测序正确的质粒LSP1、LSP2……LSP9和步骤（1）构建好的载体质粒puc-Kana 按照以下体系和程序反应

反应体系：

反应程序：

反应完后取5ul直接转化大肠杆菌感受态细胞，涂LB+kana的平板，37度培养过夜，挑 取不发光的菌落进行PCR和质粒大小鉴定，再送去测序，就可以得到正确的全长的SCP 的基因序列。