一种植物胚芽鞘特异性表达启动子及其应用

摘要

本发明提供一种植物胚芽鞘特异性表达启动子及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物胚芽鞘中特异性表达，适用于任何种子具有胚芽鞘的植物，尤其能够驱动外源基因在稻米胚芽鞘中特异性表达，因此可以用于提高和改善水稻的生长特性，从而培育出理想的、品质更加优良的水稻品种。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明 涉及一种植物胚芽鞘基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转 基因调控体系中驱动目标基因在胚芽鞘中表达。

背景技术

水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米 为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高 的要求。因而利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着积极重 要的意义。通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业 生产中具有很好的应用前景。自1983年获得第一株转基因烟草以来，在近 30年的时间里，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为现 代生物学和育种学中一项重要的方法和技术。

高等生物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用 的过程。在此过程中基因表达的开启、关闭、表达部位和表达量的高低都 将会受到精细的调控，基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同 的调节因素控制，也是在多阶段水平来实现的，即转录前、转录、转录后、 翻译、翻译后五个水平。尽管基因表达在高等生物中是多级调控系统，但 是转录水平上的调控是最关键的环节。因为转录的起始及其发生频率是基 因表达环节中最基本的一步。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件， 是众多转录因子及RNA聚合酶的最终作用靶标，因此深入研究启动子的结 构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重 大意义。因此，人们在开发一些新的转化技术如细胞器转化、定向转化等 的同时，越来越注重通过控制目的基因的时空表达来达到相应的转化目的。 研究者们通过寻找更为有效的组织、器官特异性表达启动子或者是诱导表 达启动子来代替组成型启动子，以期更好地调控植物基因表达。正因为如 此，组织特异性启动子在植物基因工程中的研究地位也越来越突出。

胚芽鞘是作物子叶应对生长初期逆境的保护组织，在成熟种子中完成 分化。在种子萌发后期，随着细胞的伸长和扩大，胚芽鞘伸长使种子破土 生长，保护胚芽露出地面并抵御逆境胁迫。由于胚芽鞘在作物生长初期具 有重要意义，已有大量的关于胚芽鞘伸长及生理反应的机理研究报道。王 玮等发现在干旱胁迫下小麦胚芽鞘长度与抗旱系数呈极显著正相关，可用 作衡量小麦抗旱性的指标；并在小麦的抗旱育种中通过在早期世代对抗旱 基因型进行筛选，取得了良好效果。周小梅等研究表明，渗透胁迫下水稻 幼苗体内腐胺（Put）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm）含量的上升有利于提 高水稻幼苗的抗渗透胁迫能力，并且水稻芽期的抗旱性可在一定程度上反 应该品种的抗旱性。在水稻上已有研究表明在进行直播稻生产时选择长胚 芽鞘类型的品种是有效利的，但未见有更深入的的研究报道。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是禾本科作物功能基因组学 研究的模式植物。由于水稻幼苗的胚芽鞘不仅能在湿润空气中生长，也能 够在水层中生长，而且生长的更快。水稻胚芽鞘所具有的这种特性，在水 稻栽培中已加以利用，如我国双季稻地区晚稻育秧，常直接在蓄水田中播 种，美国加利福尼亚州至今犹保持用飞机在蓄水田中播种的习惯。由于胚 芽鞘在胚中已经分化完成，萌发后不再进行细胞分裂增殖，是研究生长机 制的好材料，因此，对水稻胚芽鞘特异性表达基因的深入研究，具有十分 重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻胚芽鞘中特异性表达的 启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本 文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、 高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物胚芽鞘特异性表达 启动子，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所 示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴 水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）的水稻胚芽鞘特异表达启动子，本文 中称为PCole1或启动子PCole1。

优选地，本发明提供的植物胚芽鞘特异性表达启动子的DNA序列为 SEQ ID No:1所示的序列，即PCole1或启动子PCole1。

另一方面，本发明提供一种植物胚芽鞘特异性表达启动子，其DNA序 列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者，所述植物 胚芽鞘特异性表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、 插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或 者所述植物胚芽鞘特异性表达启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列 杂交的产物。这些植物胚芽鞘特异性表达启动子序列与SEQ ID No:1所示 的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物胚芽鞘中特异性表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物胚芽鞘特异性表达启动子 的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含 上述的植物胚芽鞘特异性表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物 胚芽鞘特异性表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述 待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PCole1， 该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即PCole1或启动子PCole1 构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391- PCole1。

另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的 上述植物胚芽鞘特异性表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体； 优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上 述植物胚芽鞘特异性表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上 述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物胚芽鞘特异性表达启动子在培育转基 因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物胚芽鞘特异性表 达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游（例如，将所述启动子序列 置于目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到 植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达的基因即目标基因包括用于改 良植物品质和积累的基因以及植物营养吸收相关的基因。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物胚芽鞘性状，所述植物为单 子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻；更 优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为 pCAMBIA1391-PCole1，以用于改良水稻胚芽鞘形状。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No：1 中相同）：

GCGTGTTGCGGAGTATGAGGTCCCTTTTTGGGCTTAAAACTTAAAAGTCCTTTGAGCCGTCGAA

TCCTTTTTGTGGAGAAGCAATGGCTAGTAAGTTGTAACCTCTATCCAGTTCATATACTGGTAGTTT

ACAAGCGGGATTGATTGTTCCACTTAGATATTTTTTTCAGCTAATATTCTAAAAACTTTCCACACT

TTACTGGGTTAATCATCATCATGTAATCCTGAGTTTAAATGGAACAATTATCTGCATTGAAATTAG

TTAGAGCAGGTACAATAGCAGGCTATAAGCCAGCTGTAAACATATTTTAAGGAGATAAATAAGG

AGAGAAGAGCAGCGGGCTACATATTTGTAGTCAGCTGTAGTACGGACTCTAAGACGCAGTGTGT

ATATGACAGGTGGGACCATGTATTAATAGTATAGTATGTAACTATTGTATAAATGAGTTATTAGATT

GACTATAGATGAATTGGAGCTAGTAGTTGGCTATACTATTAATCTTGCTCTTATCGATGCACAGGT

AATAGTTGAACTAACTGCACCTATAATACCTTGTTCTTCTAGACTTGCTCGAAATTTAGGACTATC

TTCAATTAAAAGTATGGTGTAACACCTTTTATGCAATAGTACTCCGTCGACCGAAAAAATATGGA

AGAATACAATTTTTAGCTAAAATTTATCATAGTTTAATACGCCGAATTGACGGCCTAGTAAATCTA

TATCCCTTTAAAAGAAAAGAAATTAGAAATAAAGTAGTGATGGTAATAGTGAATTTGCTACTTCA

CCTACTGCATTGAGATTTTTGCAAGTTAACTCCTGAACTTTTTAATATTAAAAAGATCGAATCTA

AATGGGTAGCTCCTAAAAAAAATAAAAGTAGGATGAATATTCTCTATAGCAAAAAGTGAAAGTA

CATTAATACATTATTTTATCTGTAGCGAGCATGGACATTTAGATGGTTTCTAAAAATTATATAGTAT

TTTGTGTTTATCATGATTTTTTCTTAGGAAAACAACGCTTACTACACGTACTATTTTCAGAATGGG

CTTTCTTTATAGAAGAAAAATAATCCATCCTTTCGGAGGATCGGTTGTGGTCGTTAGCAGGCATT

GCTTCCTTTAGGGATTTGTTGAAAGTGTAGCGTGGCTTTGCCCTCTCCCGCTGATTGGAGTAGC

GTTACCTGTCGTACGAGTTATATTTTTCTTCCTTGGTTGTTTTTTTTCTCTCCTTGGTATAAGTTGG

TCTAGCTAATTACATTGAGTAATATATTGACGTATAATCTTTTTCGCGTTCATGAAAAAATTATAGA

AAAATAATTTTGGAGCGGAAACTAGTCTCCGCAGGAACTCTTTGATTTCTGACGGACTCAACGC

CTGCGGGCTGCAGCTTCTCCCTGCTATCCTCCTTCCCTTTTGATATCGGGTCGAACTTTCCAGGA

CCGGTGCTGCGCATGCAAGTGATCTTCTGGTTTACTAGATGTTCACATTTTCTCCTTTCCAGCCA

CGGCGAAATGTCAGTCCATCTTCGCCGGTTGACTAGCACCGGTCGCCAAACTTCAAGGAAACC

GACGTGCAGGATTCTTTCGTTGCCATGTTGTCACTCACCCGTGCCACCATCGCGCAGCAGAATC

CTTCAGCGGCAAACCAAGAAACGACATCCCGTTGAAAGGTCAGGTCAACCGTAATCCTCATCA

CGGCATCAGTGCATCACCTGAGGCCGACCTGCTCTCCCGATCCCTCGCGAACTCCCCGGGAAG

ACGACGAAGACCAGTTACTTCTACAACGCAAATCGAACTATAGCCGCCCTGCTCTGTCCAGGA

AGCAACGCGCCGGCGCGGGATGCTCCACTATAAAACGCACCCGCTAATCACATCGACCCGCCA

CACCACCTATCACAGCAACACAAGCCAACCACAAAGAATT

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表 示的序列“GCGTGTTGCG GAGTATGAGG TC”为获得启动子过程中使用的正向引 物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列 “CAAGCCAACCACAAAGAATT”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序 列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计20bp；该DNA序列中 剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所 提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序 列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare）中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的1923bp的DNA 序列，并将其命名为PCole1（序列表中的SEQ ID No:1）。将该序列经酶切 后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即 重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农 杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因 水稻进行组织化学检测发现，转基因植株整体上的Gus基因表达水平相对 较低，仅在胚芽鞘处显蓝色，从而证明该1923bp的序列具有驱动基因表达 的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻胚芽鞘中特异性表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成 型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植 物表达载体，经转化后可驱动靶标基因在胚芽鞘中的特异性表达，从而提 高外源靶标基因在植物胚芽鞘中的表达量，增加转基因的效果，减轻外源 靶标基因由于过量表达而对作物性状的影响。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子PCole1能够调控基因在胚芽鞘中集中表 达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改 造，如通过该启动子调控目标基因在胚芽鞘中特异性表达，可以提高和改 善水稻的生长特性和机制，从而培育出理想的、品质更加优良的水稻新品 种，由于其具有在胚芽鞘中特异性表达的特征，可用其代替35S等组成 型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1A-1B为将PCole1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意 图，其中图1A为pCAMBIA1391示意图，图1B为pCAMBIA1391-PCole1 示意图，其中示出了利用PCole1启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为利用PCole1启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，其中图中 的a表示根；b表示茎；c表示叶；d表示叶鞘；e表示叶枕；f表示花；g 表示果实；h表示种子；i表示胚芽鞘；j表示放大后的胚芽鞘，结果显示 PCole1启动子驱动Gus基因仅在胚芽鞘中明显表达，而在其它部位均不表 达。

图3为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这 些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实 施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的PCole1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare） 全基因组序列，依据水稻PCole1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的 载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391（图1A，来自于 CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分 监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的 引物为：正向引物（SEQ ID No:2）5’端带HindIII，酶切位点（AAGCTT）， 反向引物（SEQ ID No:3）5’端带BamHI，酶切位点（GGATCC），引物序 列如下：

正向引物：AAGCTTGCGTGTTGCGGAGTATGAGGTC HindIII

反向引物：GGATCCAATTCTTTGTGGTTGGCTTGTG BamHI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子PCole1的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子 PCole1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s， 35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1923bp，将其连接到 PGEM-T-Easy载体（购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上， 按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进 而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳 性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证， 如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的 克隆即为所要获得的启动子PCole1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子PCole1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒， 用HindIII和BamHI双酶切，回收启动子PCole1片段。同时利用HindIII 和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上 述的PCole1片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶（购于TaKaRa公司） 进行连接，得到启动子PCole1与Gus基因融合的植物表达载体 pCAMBIA1391-PCole1（图1B），利用冻融法将植物表达载体转入根癌农 杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（安徽省农业科学院农业部转基 因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存），从冻融法所得产物中提取 阳性质粒，用HindIII和BamHI进行酶切验证，验证结果如图3中所示。

利用启动子PCole1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有 1滴Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4%）溶液浸泡种子 40min（150r/min）。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸 钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚 接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离， 将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农 杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组 表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子 筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan（Yongbo Duan，Chenguang Zhai， et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated  transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in  Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.）等提出的方法。

共获得27株PCole1-pCAMBIA1391植株（PCole1：：gus转基因水稻 植株）。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a  sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987， 6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中， 37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料 呈白色。

通过GUS组织染色，检测启动子PCole1在水稻转基因植株中对GUS 的启动活性。结果显示，PCole1：：gus转基因水稻种子的胚芽鞘经GUS 染色后呈现蓝色，而其它部分组织无染色。结果说明，启动子PCole1能够 驱动Gus基因在水稻胚芽鞘中特异性高水平的表达，结果见图2。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员 可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属 于本发明所附权利要求的范围。