一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其包括农杆菌转化、超净台吹干、浸染、生根诱导、炼苗、移栽等步骤，以消毒处理后的甘蔗叶圆片为受体，通过农杆菌介导，快速获得一种转基因甘蔗。本发明的方法不受材料限制，节约时间，在三个月内就可获得转基因甘蔗植株，适合大规模的转基因甘蔗研制；同时，方法培养时间短，避免了长期组织培养过程中，外源激素导致变异的影响。

说明书

 

技术领域

本发明涉及植物转基因培养技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法。

 

背景技术

转基因技术是指将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的改变，是可遗传的修饰。植物转基因技术是植物学研究领域的重要方面，是研究特定目的基因功能和开发转基因植物的基础技术手段。一直以来，植物转基因技术是研究者关注的热点，随着研究的逐渐深入，转基因技术也日趋完善。

甘蔗是一种重要的糖料作物，甘蔗糖占我国食糖总量的90%以上。同时，甘蔗也是一种生物质能源作物，甘蔗作为目前栽培作物中光合效率最高、产量最高的高光效C₄作物，是生产乙醇的最佳能源作物。甘蔗遗传背景复杂，常规的杂交育种周期长，效率低下。转基因技术能够快速对现有品种进行定向改良，在甘蔗育种上有着广泛对应用前景。甘蔗转基因技术和其它植物相比，十分落后，直到上世纪九十年代才通过愈伤组织途径获得了转基因植株。目前，甘蔗转基因所常用的受体材料多为愈伤组织或胚状体。这两者都需要一定的时间进行愈伤组织的诱导，比较费时费力，同时受到再生体系建立困难的限制。

 

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的在于提供一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，利用处理后的甘蔗叶圆片为受体，通过农杆菌介导快速获得转基因甘蔗。

为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：

一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其步骤如下：

1）农杆菌转化：将含有外源基因的农杆菌培养至对数生长期，收集菌体，重悬于含乙酰丁香酮的MS液体培养基中，得到转化菌液； 

2）干旱胁迫：取甘蔗末梢的叶片，酒精表面消毒后切成厚度为0.3～0.5cm的甘蔗叶圆片，在超净台上放置15～50分钟，进行干旱胁迫；

3）浸染：将步骤2）得到的甘蔗叶圆片浸泡在步骤1）制备的转化菌液中，将液体吸干后再将甘蔗叶圆片置于共培养培养基上，于25～30℃暗培养3～4天；

4）生根诱导：将上述经过浸染后的甘蔗胚性细胞置于选择培养基培养，进行再生；待苗高为2～3cm时，切取植株接到生根培养基进行生根诱导，得到生根的植株；

5）炼苗、移栽：将生根的植株炼苗、移栽，得到转基因甘蔗植株。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤1）的MS液体培养基中乙酰丁香酮的含量为100～250 μM。

本发明中，甘蔗叶圆片在超净台上处理的目的是让叶片失水，加大对叶片的伤害，以达到提高转化率的目的。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤3）的共培养培养基为MS培养基与2～5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1～3mg/L 6-苄氨基嘌呤以及5.5 g/L 琼脂粉的混合培养基，其pH 5.5。优选的，在步骤3中浸泡的时间为10～15min。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤4）所述的选择培养基为MS培养基与2～5 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1～3 mg/L 6-苄氨基嘌呤、250mg/L 头孢霉素、5.5 g/L 琼脂粉的混合培养基以及抗性标记筛选物质，其pH 5.8；所述的生根培养基为MS培养基与2-5 mg/L萘乙酸、250mg/L 头孢霉素、5.5 g/L 琼脂粉以及抗性标记筛选物质的混合培养基，其pH 5.8。在本发明中步骤4）的培养基中加入抗性标记筛选物质的目的是让非转化的细胞死亡，含有外源基因的细胞正常生长所述抗性标记筛选物质为抗生素或除草剂，抗性标记筛选物质的加入量为：3-5mg/L。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤1）中农杆菌采用YEB液体培养基培养，具体步骤为：将含有外源基因的农杆菌接种于含抗生素的YEB液体培养基中，25～30℃摇床过夜，再按体积百分比1%接种量转接入50mL同样培养基中培养2～4小时至OD600为0. 5～0.6，收集菌体；然后用5mL含100μM AS的MS液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL含100μM AS的MS液体培养基中，28℃摇床上培养至OD600到0.5～0.6。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，所述外源基因为草丁膦抗性基因。

优选的，在步骤4）中生根诱导的时间为4周。

上述方法中，作为本发明的一种优选的方案，步骤5）中移栽所用的基质为园土和泥炭土按质量比1：1混合。

先比现有技术，本发明的有益效果在于：

1. 本发明以甘蔗叶片直接为转化受体取材容易，通过叶片直接诱导分化成苗能大量减少获得转基因植株的时间；在农杆菌侵染前期，对外植体进行干旱处理，加强外植体的伤害，有效促进农杆菌的侵染能力，转化效率提高；

2. 本发明所述的方法不受材料限制，节约时间，在三个月内就可获得转基因甘蔗植株；

3. 本发明和以愈伤组织等其它受体的转基因方法相比，取材容易，也大大缩短了得到转基因甘蔗植株的时间，在2～3个月就可以获得甘蔗植株，更适合大规模的转基因甘蔗研制；同时，方法培养时间短，避免了长期组织培养过程中，外源激素导致变异的影响；

4. 本方法采用甘蔗叶圆片直接做位转基因受体，为获得转基因甘蔗提供新方法；

5. 本发明转化效率高，得到的嵌合体少；而且具有可拓展性，可以适用于大规模转基因甘蔗的研制，大大减少工作量，降低研究费用；

下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。

 

附图说明

图1为本发明的甘蔗叶圆片浸染之后的照片；

图2为本发明的生根诱导后得到的植株的照片；

图3为本发明的方法培育后的甘蔗叶片与正常培育的甘蔗叶片的PPT离体鉴定；其中两边的两只试管是正常培育的叶片，中间的三只试管是本发明的方法培育后的叶片； 

图4为通过本发明的方法获得的甘蔗植株叶片PCR检测的电泳图，其中1为mark，5、8、9为本发明的甘蔗植株叶片PCR扩增产物。

 

具体实施方式

实施例1

一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其步骤如下：

 1）制备含有Bar 基因的农杆菌LBA4404：LBA4404 感受态细胞购买于宝  

生物工程(大连)有限公司，Bar基因来源于商业载体pCAMBIA3301，将pCAMBIA3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到LBA4404细胞中；

2）培养：挑取含有Bar基因的农杆菌LBA4404单菌落，接种于5 ml含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床过夜，再接着将0.5 ml菌液接种于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.5左右，将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体，用5mL含100μM AS的MS液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含100μM AS的MS液体培养基中，28℃摇床上培养至OD600为0.5，得到农杆菌菌液；

3）干旱胁迫：取甘蔗（新台糖22号，台糖公司选育）末梢的叶片，用体积百分比70%酒精表面消毒后，用手术刀片切成30片厚度为0.5cm的圆片，在超净台上放置30分钟；

4）农杆菌浸染：将步骤3）处理后的30片甘蔗叶圆片浸入步骤2）制备的农杆菌菌液中12后将受体取出，中间轻缓晃动数次；然后将受体置于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到由MS培养基、2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、2 mg/L6-苄氨基嘌呤（6-BA）、250mg/L 头孢霉素以及5.5 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.5的共培养培养基上，于25℃暗培养3天；

5）转基因抗除草剂甘蔗再生与移栽：将步骤4）与浸染后的转化材料移到选由MS培养基、3 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）6-BA 1mg/L、3mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的择培养基上进行再生；2-3周更换培养基；待苗高为3 cm时，切取植株接到由MS培养基、3 mg/L NAA、5 mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的生根培养基中，进行生根诱导； 4周后，可见植株高约6 cm，下部出现长约2 cm的根；

6）炼苗、移栽：打开瓶盖，炼苗1周，洗净植株根部的培养基后植株移栽到基质为园土和泥炭土按质量比1：1混合育苗盘中。

重复上述实验两组，每组均为30片甘蔗叶圆片，共得到10棵甘蔗植株。

 

实施例2

一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其步骤如下：

 1）制备含有Bar 基因的农杆菌LBA4404：LBA4404 感受态细胞购买于宝生物工程(大连)有限公司，Bar基因来源于商业载体pCAMBIA3301，将pCAMBIA3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到LBA4404细胞中；

2）培养：挑取含有Bar基因的农杆菌LBA4404单菌落，接种于5 ml含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，25℃摇床过夜，再接着将0.5 ml菌液接种于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.6，将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体，用5mL含100μM AS的MS液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含100μM AS的MS液体培养基中，28℃摇床上培养至OD600为0.6，得到农杆菌菌液；

3）干旱胁迫：取甘蔗（新台糖20号，台糖公司选育）末梢的叶片，用体积百分比70%酒精表面消毒后，用手术刀片切成30片厚度为0.5cm的圆片，在超净台上放置15分钟；

4）农杆菌浸染：将步骤3）处理后的30片甘蔗叶圆片浸入步骤2）制备的农杆菌菌液中10后将受体取出，中间轻缓晃动数次；然后将受体置于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到由MS培养基、2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、2 mg/L6-苄氨基嘌呤（6-BA）以及5.5 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.5的共培养培养基上，于25℃暗培养2天；

5）转基因抗除草剂甘蔗再生与移栽：将步骤4）与浸染后的转化材料移到选由MS培养基、6-BA 3mg/L、5 mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的择培养基上进行再生；待苗高为2cm时，切取植株接到由MS培养基、3 mg/L NAA、5 mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的生根培养基中，进行生根诱导； 4周后，可见植株高约6 cm，下部出现长约2 cm的根；

6）炼苗、移栽：打开瓶盖，炼苗6天，洗净植株根部的培养基后植株移栽到基质为园土和泥炭土按质量比1：1混合育苗盘中。

采用30片甘蔗叶圆片，共得到2棵甘蔗植株。

实施例3

一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其步骤如下：

 1）制备含有Bar 基因的农杆菌LBA4404：LBA4404 感受态细胞购买于宝生物工程(大连)有限公司，Bar基因来源于商业载体pCAMBIA3301，将pCAMBIA3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到LBA4404细胞中；

2）培养：挑取含有Bar基因的农杆菌LBA4404单菌落，接种于5 ml含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床过夜，再接着将0.5 ml菌液接种于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.5左右，将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体，用5mL含200μM AS的MS液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含200μM AS的MS液体培养基中，28℃摇床上培养至OD600为0.5，得到农杆菌菌液；

3）干旱胁迫：取甘蔗（粤农91-600，广东省农业科学作物研究所选育）末梢的叶片，用体积百分比70%酒精表面消毒后，用手术刀片切成30片厚度为0.5cm的圆片，在超净台上放置50分钟；

4）农杆菌浸染：将步骤3）制备的外植体浸入步骤2）制备的农杆菌菌液中15min后将受体取出，中间轻缓晃动数次；然后将受体置于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到由MS培养基、3 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、1 mg/L6-苄氨基嘌呤（6-BA）以及5.5 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.5的共培养培养基上，于25℃暗培养4天；

5）转基因抗除草剂甘蔗再生与移栽：将步骤4）与浸染后的转化材料移到选由MS培养基、6-BA 3mg/L、5 mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的择培养基上进行再生；待苗高为3 cm时，切取植株接到由MS培养基、3 mg/L NAA、5 mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的生根培养基中，进行生根诱导； 4周后，可见植株高约6 cm，下部出现长约2 cm的根；

6）炼苗、移栽：打开瓶盖，炼苗5天，洗净植株根部的培养基后植株移栽到基质为园土和泥炭土按质量比1：1混合育苗盘中。

采用30片甘蔗叶圆片，共得到3棵甘蔗植株。

实施例4

一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其步骤如下：

 1）制备含有Bar 基因的农杆菌EHA105：EHA105 感受态细胞本实验室保存，Bar基因来源于商业载体pCAMBIA3301，将pCAMBIA3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到EHA105细胞中；

2）培养：挑取含有Bar基因的农杆菌EHA105菌落，接种于5 ml含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床过夜，再接着将0.5 ml菌液接种于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.5左右，将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体，用50 mL含100μM AS的MS液体培养基重新悬浮沉淀，28℃摇床上培养至OD600为0.5，得到农杆菌菌液；

3）干旱胁迫：取甘蔗（粤糖00-236，广州甘蔗糖业研究所选育）末梢的叶片，用体积百分比70%酒精表面消毒后，用手术刀片切成30片厚度为0.5cm的圆片，在超净台上放置30分钟；

4）农杆菌浸染：将步骤3）制备的外植体浸入步骤2）制备的农杆菌菌液中12后将受体取出，中间轻缓晃动数次；然后将受体置于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到由MS培养基、2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、2 mg/L6-苄氨基嘌呤（6-BA）以及5.5 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.5的共培养培养基上，于25℃暗培养3～5天；

5）转基因抗除草剂甘蔗再生与移栽：将步骤4）与浸染后的转化材料移到选由MS培养基、6-BA 3mg/L、5 mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的择培养基上进行再生；待苗高为3 cm时，切取植株接到由MS培养基、3 mg/L NAA、5 mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的生根培养基中，进行生根诱导； 4周后，可见植株高约6 cm，下部出现长约2 cm的根；

6）炼苗、移栽：打开瓶盖，炼苗1周，洗净植株根部的培养基后植株移栽到基质为园土和泥炭土按质量比1：1混合育苗盘中。

采用30片甘蔗叶圆片，共得到5棵甘蔗植株。

实施例5

一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法，其步骤如下：

 1）制备含有Bar 基因的农杆菌LBA4404：LBA4404 感受态细胞购买于宝生物工程(大连)有限公司，Bar基因来源于商业载体pCAMBIA3301，将pCAMBIA3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到LBA4404细胞中；

2）培养：挑取含有Bar基因的农杆菌LBA4404单菌落，接种于5 ml含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床过夜，再接着将0.5 ml菌液接种于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.5左右，将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体，用5mL含200μM AS的MS液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含200μM AS的MS液体培养基中，27℃摇床上培养至OD600为0.5，得到农杆菌菌液；

3）干旱胁迫：取甘蔗（粤农91-600，广东省农业科作物研究所选育）末梢的叶片诱导出的甘蔗愈伤组织，用消毒后的手术刀片切成0.2*0.2 cm大小的愈伤颗粒，在超净台上放置50分钟，；

4）农杆菌浸染：将步骤3）制备的外植体浸入步骤2）制备的农杆菌菌液中15min后将受体取出，中间轻缓晃动数次；然后将受体置于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到由MS培养基、1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、3 mg/L6-苄氨基嘌呤（6-BA）以及5.5 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.5的共培养培养基上，于25℃暗培养4天；

5）转基因抗除草剂甘蔗再生与移栽：将步骤4）与浸染后的转化材料移到选由MS培养基、6-BA 3mg/L、5 mg/L草丁膦、500mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的择培养基上进行再生；待苗高为3 cm时，切取植株接到由MS培养基、3 mg/L NAA、5 mg/L草丁膦、250mg/L 头孢霉素、5.0 g/L 琼脂粉组成，pH 为5.8的生根培养基中，进行生根诱导； 4周后，可见植株高约6 cm，下部出现长约2 cm的根；

6）炼苗、移栽：打开瓶盖，炼苗5天，洗净植株根部的培养基后植株移栽到基质为园土和泥炭土按质量比1：1混合育苗盘中。

采用30片甘蔗叶圆片诱导的愈伤组织，共得到3棵甘蔗植株。

对比实施例1：

按照上述实施例同样的条件操作，区别在于用手术刀片切成30片厚度为0.5cm的圆片后，不进行干旱伤害，直接进行浸染。重复实验两组，每组均为30片甘蔗叶圆片，三组实验共得到2棵甘蔗植株。

参见图3，两边的两只试管是正常培育的叶片，中间的三只试管是本发明的方法培育后的叶片；图3的照片显示，转基因甘蔗叶片获得草丁膦抗性，在草丁膦溶液中仍然保持绿色，而对照没有抗性，受到伤害，变黄。

参见图4，图4,中1为mark，5、8、9为本发明的甘蔗植株叶片PCR扩增产物；由图中结果可以得出扩增出的片段大小和载体一致。

 

转基因甘蔗检测

对上述实施例1-3育苗盘中的再生甘蔗进行检测。

A）取种植在育苗盘中再生植株叶片，采用微量法提取总DNA进行PCR扩增。

B）PCR扩增引物是依据质粒表达载体中Bar序列设计，上游序列：5'–ACCA TCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5' –AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反应体系：模板DNA 50～100 ng，10×Buffer 1.5μL，10 mmol/L dNTP 0.35μL，10 mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25 mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2μL，补ddH₂O至15μL。反应条件：95℃预变性3 min；95℃ 30sec，60℃ 40sec，72℃ 40sec，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；

C）质量体积比1％琼脂糖凝胶电泳检测。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。