羰基还原酶、其基因及用于度洛西汀手性中间体的制备

摘要

本发明公开了一种来源于金黄杆菌（Chryseobacteriumsp.CA49）的羰基还原酶ChKRED15及其编码基因，并利用该羰基还原酶作为生物催化剂制备度洛西汀手性醇中间体(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。产物的对映体过量值大于99.9%。以ChKRED15粗酶液（2U/mL）可催化20g/L的底物，2h内获得99%以上转化率，且辅酶循环体系简单、具有较大的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物，具体涉及一种来源于金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）的新型羰基还原酶ChKRED15及其基因，并利用这种羰基还原酶作为生物催化剂制备度洛西汀手性中间体，属于应用微生物与酶工程领域。 

背景技术

度洛西汀是第三代抗抑郁药，是市场销售最主要的抗抑郁药，能有效地抑制5-羟色氨和去甲肾上腺素的再摄取(Wong DT,et al.Life Sci,1988,43:2049-2057)，高效、安全、副作用小，对其他症状如全身疼痛和胃肠道紊乱也有疗效(Bymaster FP,et al.Neuropsychopharmacology,2001,25:871-880)。该药还被批准用于糖尿病引起的神经疼痛以及女性尿失禁的治疗(Norton PA,et al.Am J Obstet Gynecol,2002,187:40-48)。 

度洛西汀含有一个手性中心，研究表明仅(S)构型的对映体具有药物活性。(S)-度洛西汀的合成关键步骤为(S)构型手性醇中间体的获得。目前对(S)构型手性醇中间体的获得主要通过化学途径，但存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，由于产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致其难以应用于医药中间体的生产。 

与化学方法相比，生物催化过程具有高度的化学、区域和立体选择性，反应条件温和，后处理容易，能耗较低，是一种环境友好的合成方法，也是当今化工生产和相关领域发展一大潮流。其中生物催化不对称还原已经发展成为全球各大医药公司研发部门的重要组成部分。然而，迄今为止的绝大部分研究集中于苯基酮为骨架的底物，而以杂芳环酮为骨架的底物研究较少见，其中与度洛西汀手性中间体合成相关的更是屈指可数(Wada M,et al.Biosci Biotechnol Biochem,2004,68:1481-1488;Stürmer R,et al.,2008,US0318288A1;Tang CG,et al.Biotechnol Lett,2011,33:1435-1440)。其中，汤传根等（Tang CG,et al. Biotechnol Lett,2011,33:1435-1440)2011年报道了粘红酵母菌（Rhodotorula sp.CY12）催化杂芳环酮为骨架的底物N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-度洛西汀关键醇中间体合成路线，该工艺以原始菌休止细胞为生物催化剂，48h内可转化底物浓度为30g/l，为(S)-度洛西汀关键醇中间体提供了一种可选择方法。为该底物筛选更多优良催化剂可进一步丰富生物催化工具箱，发掘更多有潜力的备用酶源。 

发明内容

本发明公开了一种来源于金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）的羰基还原酶ChKRED15及其基因，并提供了该酶异源表达体系的构建方法以及该酶作为生物催化剂用于制备度洛西汀手性中间体的方法。 

羰基还原酶ChKRED15的基因的核苷酸序列（738bp）为SEQ ID No.1所示。 

羰基还原酶ChKRED15基因编码的蛋白质（245aa）的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。 

羰基还原酶ChKRED15从金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）基因组中克隆获得，该菌的保藏编号为CCTCC M2012484（中国武汉，中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年11月27日）。 

通过设计如下引物：正向：5′-GCG GAATTC ATG AAA ACA GTA TTA ATT ACA GGC GCC-3′（酶切位点：EcoRⅠ）；反向：5′-GCG AAGCTT CTA CCA CGG ACT GAT TCC GG-3′（酶切位点：Hind III），以金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）基因组DNA为模板，经PCR扩增获得目标基因，该基因编码的蛋白质命名为羰基还原酶ChKRED15。将目标基因连入pET28a(+)载体，并转入E.coli BL21（DE3），构建pET28a(+)-BL21异源表达体系。异源表达产物经纯化后得到纯酶。 

根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，羰基还原酶ChKRED15表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。 

本发明还提供了羰基还原酶ChKRED15作为生物催化剂在转化底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺中的应用。上述应用中，所述的催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。 羰基还原酶ChKRED15作催化剂时，反应体系为：羰基还原酶ChKRED15，磷酸钾缓冲液或Tris-HCl缓冲液，NADH或NADPH，底物N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺（由于底物在水中的溶解度较低，因此先溶解于DMSO中配成40%的底物贮存液，再加入到反应体系中，w/v）。反应体系的酶浓度、NADH或NADPH量、底物浓度等可以调整。反应结束后，乙酸乙酯萃取终止反应，获得产物。经验证该酶能够高选择性（ee>99%）地催化N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的羰基不对称还原。 

可进行上述生物催化反应的包括羰基还原酶ChKRED15纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。采用羰基还原酶ChKRED15重组菌休止细胞作催化剂时，通常用辅酶循环底物代替辅酶进行反应，常用的辅酶循环底物为：葡萄糖和/或异丙醇。 

根据现有的公共知识，任何基因通过DNA突变技术可以改变其序列，从而产生各种不同的突变体，这些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。本发明涉及基因及其产物也具有相同的特点。经等位基因突变或者经添加、插入、缺失或/和取代一个或多个氨基酸且编码具有同等活性蛋白的氨基酸序列同样能作为生物催化剂转化底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。 

本发明涉及的羰基还原酶ChKRED15可高效转化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成S-醇，为(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生物催化合成提供了可供选择的新型酶源。 

羰基还原酶ChKRED15的潜力：该蛋白在大肠杆菌中过量表达后制成粗酶液，2U/mL酶量便可在2h内转化20g/L的底物，且转化率为99%以上，ee值大于99.9%。粗酶液转化工艺简单，辅酶循环体系稳定，具有较大的工业应用前景。 

附图说明

图1羰基还原酶ChKRED15蛋白过量表达后的SDS-PAGE图,M为marker，1：E.coli（pET28a）空载体，2：E.coli（pET28a-ChKRED15）全细胞，3：E.coli（pET28a-ChKRED15）细胞破碎后上清，4：ChKRED15纯化后。 

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但 并非对本发明的限制。 

实施例1 羰基还原酶（ChKRED15）基因的扩增 

根据金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）全基因组测序信息，挖掘其中大量的羰基还原酶，其中一个具有催化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺功能的酶为本发明涉及的羰基还原酶ChKRED15，该基因获取过程为常规的操作方法。设计如下引物：正向：5′-GCG  GAATTC ATG AAA ACA GTA TTA ATT ACA GGC GCC-3′（酶切位点：EcoRⅠ）；反向：5′-GCG AAGCTT CTA CCA CGG ACT GAT TCC GG-3′（酶切位点：Hind III），以金黄杆菌CCTCC M2012484基因组DNA为模板，经PCR扩增获得羰基还原酶ChKRED15基因。 

PCR程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。 

将PCR产物以0.8%的琼脂糖电泳后经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段（天根生化科技北京有限公司），而后以EcoRⅠ/Hind III双酶切后连接到具有相同酶切位点的pET28a(+)载体，得到重组质粒pET28a-ChKRED15，并送至上海生工生物工程公司测序。经测序，目标基因全长738bp，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。 

将测序正确的质粒化学转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞，得重组子E.coli（pET28a-ChKRED15）。 

实施例2 羰基还原酶（ChKRED15）的诱导表达 

挑取实施例1所构建的重组子E.coli（pET28a-ChKRED15）单克隆，接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃，180rpm培养16h作为种子液，以1%接种率转接至新鲜LB或者TB培养基中（500mL容量摇瓶装液200mL培养基），于37℃振荡培养4h，随后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导羰基还原酶ChKRED15基因的表达，于30℃诱导36h后，4℃，8000rpm冷冻离心10min收获菌体。 

菌体可作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。 

实施例3 羰基还原酶（ChKRED15）的分离纯化 

将实施例2中获得的菌体以结合缓冲液（100mM，pH8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl,5mM咪唑）重悬后，经高压均质机破碎，12000rpm离心15min，上清 与经上述结合液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，使用漂洗缓冲液（100mM，pH8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，10mM咪唑）漂洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液（100mM，pH8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl,250mM咪唑）洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液（100mM，pH8.0磷酸钾缓冲液）透析48h，超滤浓缩后利用BCA Protein Assay kit测定蛋白浓度为8mg/mL，将酶液稀释至终浓度为5mg/mL分装，冻存于-80℃（羰基还原酶ChKRED15蛋白电泳图见附图1）。 

实施例4 羰基还原酶（ChKRED15）的活性测定 

将实施例3中分离纯化得到的羰基还原酶ChKRED15纯酶用于催化底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺。 

反应体系10mL，包括磷酸钾缓冲液（0.1M，pH8.0），纯酶浓度0.1g/L，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺1g/L，NADPH10mM。30℃，转速50rpm，转化30min。反应结束后用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，氮吹仪氮吹后除去乙酸乙酯，所得残余物用0.1mL异丙醇(HPLC级)充分溶解，取2μl样品，HPLC检测转化率和ee值（检测方法见实施例5）。计算转化率为66%，ee值>99.9%（S型）。以下实施例中产物均为S构型。 

底物和产物数据如下： 

N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺数据如下： 

白色粉末 

1H NMR[(600MHz,CDCl₃)δppm2.86(d,3H,-NMe),3.8952(s,2H,-CH₂),7.12(m,2H,aromatic and NH),7.74(d,1H,aromatic),7.836(d,1H,aromatic)]。 

(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺数据如下： 

白色粉末，[α]_D²⁵=-32.5(c=0.90;CHCl₃) 

1H NMR[(600MHz,CDCl₃):δ=2.67(d,2H,-CH₂),2.83(d,3H,-NCH₃),5.36(t,1H,-CH),5.75(br,1H,-NH),6.96(m,2H,aromatic),7.24(m,1H,aromatic)]。 

其他实施例中底物和产物数据与本例相同。 

因此，羰基还原酶ChKRED15具有高选择性还原羰基的功能，是一种羰基还原酶。 

实施例5 HPLC检测 

HPLC检测所用仪器：Shimadzu Prominence LC-20AD系统-PDA检测器。 

检测转化率时色谱柱为Inertsil SIL-100A250×4.6mm，流动相：正己烷：异丙醇=70:30，流速1mL/min，柱温35℃，N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺和N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的滞留时间分别为8.921min和13.022min。 

检测ee值时手性色谱柱为Daicel Chiralcel OJ-H250×4.6mm，流动相：正己烷：异丙醇=90:10，流速0.5mL/min,(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺和(R)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的滞留时间分别为22.808min和24.176min。 

实施例6 羰基还原酶ChKRED15纯酶生物催化 

将实施例3中分离纯化得到的羰基还原酶ChKRED15纯酶用于催化底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺。 

反应体系10mL，包括磷酸钾缓冲液（0.1M，pH7.0），纯酶浓度0.1g/L，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺1g/L，NADH10mM。30℃，转速100rpm，转化30min。反应结束后用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，氮吹除去乙酸乙酯，所得残余物用0.1mL异丙醇(HPLC级)充分溶解，取2μl样品，按照实施例5的条件进行HPLC检测。计算转化率为28%，ee值>99.9%。 

实施例7 羰基还原酶ChKRED15辅酶偏好性 

反应体系10mL，包括磷酸钾缓冲液（0.1M，pH7.0），纯酶浓度0.1g/L，10mM底物和5mM NADH或者NADPH。30℃，转速150rpm，反应1h。等体积乙酸乙酯萃取两次，样品处理方法与实施例6相同，测定产物的转化率。以NADH为辅酶时，转化率为17%；以NADPH为辅酶时，转化率为49%；两者的ee值均大于99.9%，因此该酶以NADPH为辅酶时转化率更高。 

实施例8 羰基还原酶ChKRED15在不同温度下的生物还原反应 

选取的生物催化温度分别为5℃、10℃、15℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、35℃、40℃。 

反应体系10mL，包括磷酸钾缓冲液（0.1M，pH7.0），羰基还原酶ChKRED15纯酶浓度0.1g/L，N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺10mM，10mM NADPH，分别于上述温度下反应1h，转速200rpm。等体积乙酸乙酯萃取两次，样品处理方法与实施例6相同，测定产物的转化率和ee值。结果见表1。 

表1 羰基还原酶ChKRED15在不同温度下的生物还原反应转化率 

结果表明，羰基还原酶ChKRED15在5℃～40℃范围内均可以转化底物，在24℃～32℃转化率相差不大。以上温度条件下产物ee值均大于99.9%。 

实施例9 羰基还原酶ChKRED15在不同pH值的生物还原反应 

缓冲体系包括：磷酸钾缓冲液(pH6.0～8.0，0.1M)、Tris–HCl(pH8.0–9.0，0.1M)。转化体系10mL，除缓冲液外其他组分为：纯酶浓度0.1g/L，N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺10mM和10mM NADPH。反应温度为28℃，转速100rpm，反应时间为1h。等体积乙酸乙酯萃取两次，样品处理方法与实施例6相同，测定产物的转化率和ee值。结果见表2。 

表2 羰基还原酶ChKRED15在不同缓冲液与pH值的生物还原反应 

结果表明羰基还原酶ChKRED15在两种缓冲液中均能进行生物还原反应，pH范围为6.0～9.0左右。磷酸钾缓冲液pH8.0时表现出最高的转化率。以上催化反应的产物ee值均大于99.9%。 

实施例10 羰基还原酶ChKRED15生物催化适宜的缓冲液浓度 

以pH8.0磷酸钾缓冲液为缓冲体系，缓冲液浓度分别为：0.1M，0.2M，0.4M，0.6M，0.8M，1.0M，1.2M，1.4M，1.6M，1.8M，2.0M，2.2M，2.4M。 

转化体系10mL，除缓冲液外其他组分为：纯酶浓度0.1g/L，N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺10mM和10mM NADPH。反应温度为28℃，转速120rpm，反应时间为30min。等体积乙酸乙酯萃取两次，样品处理方法与实施例6相同，测定产物的转化率和ee值。结果见表3。 

表3 羰基还原酶ChKRED15在不同缓冲液浓度下的生物催化 

结果表明羰基还原酶ChKRED15在pH8.0磷酸钾缓冲液中，缓冲液浓度为0.1～2.4M左右均可转化目标底物。当缓冲液浓度为1.0～1.4M时转化率相差不大。以上催化反应的产物ee值均大于99.9%。 

实施例11 羰基还原酶ChKRED15重组菌全细胞生物催化 

羰基还原酶ChKRED15重组菌E.coli（pET28a-ChKRED15）的培养方法和菌体收集方法见实施例2。 

取菌体1.0g，用磷酸钾缓冲液（pH8.0,0.3M）配成细胞浓度为100g/l菌悬液。5mL反应体系，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺浓度为10g/L，加入10%（w/v）的葡萄糖作为辅酶再生底物，28℃，230rpm，转化24h，反应 混合液用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏将除去乙酸乙酯，所得残余物用2mL异丙醇(HPLC级)充分溶解，取2μL样品进行HPLC检测，样品处理方法与实施例6相同，计算转化率为>99%，ee值>99.9%。 

实施例12 羰基还原酶ChKRED15辅酶再生体系 

羰基还原酶ChKRED15重组菌E.coli（pET28a-ChKRED15）的诱导表达方法见实施例2，蛋白分离纯化方法见实施例3。 

（1）羰基还原酶ChKRED15辅酶再生循环体系中GDH浓度优化 

转化体系10mL：磷酸钾缓冲液（0.1M，pH8.0），羰基还原酶ChKRED15浓度2U/mL（1分钟转化1μmol底物所需酶量定义为1U），底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺10mM，NADP⁺0.2mM，葡萄糖10%，葡萄糖脱氢酶（GDH）浓度分别为0U/mL，0.1U/mL，0.2U/mL，0.5U/mL，1U/mL，2U/mL，4U/mL，6U/mL，28℃，150rpm，转化60min。等体积乙酸乙酯萃取两次，样品处理方法与实施例6相同，测定产物的转化率和ee值，优化结果见表4。 

表4 羰基还原酶ChKRED15辅酶再生循环体系中GDH浓度优化 

结果表明当GDH浓度为2U/mL时，辅酶再生循环体系已基本上能够满足羰基还原酶ChKRED15对NADPH的需求。以上催化反应产物ee值均大于99.9%。 

（2）羰基还原酶ChKRED15辅酶再生循环体系中NADP⁺浓度优化 

转化体系10mL：磷酸钾缓冲液（0.1M，pH8.0），羰基还原酶ChKRED15浓度2U/mL（1分钟转化1μmol底物所需酶量定义为1U），底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺110mM，GDH浓度2U/mL，葡萄糖10%，NADP⁺浓度分别为0mM，0.01mM，0.02mM，0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.5mM，1mM，2mM，28℃，100rpm转化60min。等体积乙酸乙酯萃取两次，样品处理方法与实施例 6相同，测定产物的转化率和ee值，优化结果见表5。 

表5 羰基还原酶ChKRED15辅酶再生循环体系中NADP⁺浓度优化 

结果表明羰基还原酶ChKRED15催化底物的转化率随NADP⁺浓度增加而增加，当NADP⁺浓度大于0.5mM时，转化率趋于稳定。以上催化反应产物ee值均大于99.9%。 

实施例13 羰基还原酶ChKRED15粗酶液生物催化 

羰基还原酶ChKRED15重组菌的诱导表达方法见实施例2。 

取新鲜培养的湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液（0.1M，pH8.0），以均质机破碎细胞，13 000rpm离心20min，所得上清即为粗酶液。 

转化体系10mL：磷酸钾缓冲液（0.1M，pH8.0），羰基还原酶ChKRED15浓度2U/mL（1分钟转化1μmol底物所需酶量定义为1U），底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺20g/L，GDH浓度2U/mL，葡萄糖10%（w/v），NADP⁺浓度0.2mM，28℃，转速150rpm，转化时间分别为10min，20min，30min，40min，50min，60min，90min，120min。等体积乙酸乙酯萃取两次，样品处理方法与实施例6相同，测定产物的转化率和ee值，结果见表6。 

表6 羰基还原酶ChKRED15粗酶液生物催化 

结果表明10min内底物就能转化15%左右，120min底物完全转化，且产物 的ee值大于99.9%。 

实施例14 羰基还原酶ChKRED15粗酶粉生物催化 

获得羰基还原酶ChKRED15粗酶液的方法与实施例13相同；将粗酶液冷冻于-80℃过夜，而后用冷冻真空干燥机进行干燥，制成粗酶粉。测定粗酶粉的酶活（1分钟转化1μmol底物所需酶量定义为1U）。 

转化体系10mL：磷酸钾缓冲液（0.1M，pH8.0），羰基还原酶ChKRED15浓度2U/mL，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺20g/L，GDH浓度2U/mL，葡萄糖10%（w/v），NADP⁺浓度0.2mM，28℃，转速160rpm，转化时间分别为10min，20min，30min，40min，50min，60min，90min，120min。等体积乙酸乙酯萃取两次，样品处理方法与实施例6相同，测定产物的转化率和ee值，结果见表7。 

表7 羰基还原酶ChKRED15粗酶粉生物催化 

结果表明10min内底物就能转化14%左右，120min底物完全转化，且产物的ee值大于99.9%。