无背景的磁性流式细胞仪

摘要

本发明涉及用于磁性流式细胞仪的装置和方法。其中设置磁单元(22，24)于流动通道(10)内，这样来配置该流动通道的流动通道直径(100)和流动通道内壁的表面性质，使得在流动通道(10)内产生具有层流状流动剖面(40)的复合悬浮液的流。由磁单元(22，24)引起的力(FM)和由流所引起的力(FS)作用于未结合细胞的磁标记(26)，将这些未结合细胞的磁标记物(26)阻拦在前部通道段(240)中，并且不沿着流动通道的进一步延伸(10)流过细胞测量装置(20)。

说明书

技术领域

本发明涉及流式细胞仪，特别涉及磁性细胞测量。

背景技术

在细胞测量和细胞检测的领域内，除光散射测量或荧光测量这样的光学 测量方法之外，还已知有磁性检测法，其中通过磁标签来标记待检测的细胞 类型。

特别已知有基于磁体的测量方法，其中，通过磁电泳从例如为血液样本 的复合悬浮液中挑选经磁标记的细胞。特别通过将细胞特异性标记物引入到 复合悬浮液中来进行磁标记。可通过磁电泳将经磁标记的细胞或通常是磁性 的颗粒引入穿流中，或定向并且由此分类。

对于在诊断和科技中的细胞测量来说必要的是，恰好测量在血液样本中 仅以非常低的浓度存在的细胞类型，例如扩散的肿瘤细胞。因此，对细胞浓 度的定量分析或对特定细胞的可靠的检测要争取达到单细胞检测。已知的 是，为此必需从具有复杂背景的悬浮液中预先富集待确定的细胞。然而，仅 凭这一点，在大多数情况下还未产生足够的测量特异性。正因为磁性细胞测 量伴有非常简单的通过加入细胞特异性标记物而进行的样品准备，流式细胞 仪就出现了未经结合的磁标记物总是造成背景信号这样的问题。该背景会导 致例如假阳性的检测信号。

发明内容

本发明的目的是通过未结合的磁标记物最小化在磁性流式细胞仪中造 成的背景信号。

该目的通过权利要求1所述的装置得以实现。权利要求9给出了用于磁 性流式细胞仪的方法。权利要求15给出了本发明装置的制造方法。本发明 有利的实施方式是从属权利要求的主体。

本发明的用于磁性流式细胞仪的装置包括流动通道、用于富集经磁标记 的细胞的第一磁单元和用于排列经磁标记的细胞的第二磁单元，以及至少一 个细胞测量装置。在相对流动方向的前部通道段上设置磁性装置。这样来配 置该流动通道的流动通道直径和流动通道内壁的表面性质，使得在流动通道 内可产生具有层流状流动剖面的复合悬浮液的流。进一步地配置流动通道， 使得由磁单元引起的力和由流所引起的力作用于未结合细胞的磁标记，以便 于将未结合细胞的磁标记阻拦在前部通道段中。其优势在于，这些未结合的 标记物不会到达位于流动通道内的沿流动方向更靠后的细胞测量装置。从 而，将未结合细胞的标记物阻拦在前部通道段中，其不会沿着流动通道的进 一步延伸流过细胞测量装置，并且作为干扰组分消除，由此来减少由未经结 合的磁标记物造成的背景信号。其优势在于，在测量经磁标记的细胞时能确 保较高的特异性，特别是单细胞检测。

特别地，在前部通道段这样来设置第一磁单元，使得由此可产生梯度磁 场，其在流动通道内将经磁标记的细胞以及未结合细胞的磁标记物富集于通 道底部。所述富集过程的优势在于，其将待测量的经磁标记的细胞引导至靠 近通道底部的细胞测量装置，并且还具有的优势在于，将未结合细胞的磁标 记物引导至通道底部上的第二磁单元，由此，正如下文所描述的那样，特别 有助于阻拦未经结合的标记物。

特别地，在前部通道段这样来设置第二磁单元，使得经磁标记的细胞由 此在流动通道内沿轴线排列，在该轴线上沿着通道的进一步延伸设置细胞测 量装置。第二磁单元的这种设置的优势在于，可以对经磁标记的细胞实施磁 电泳，由此，细胞可被排列并且特别地可使其单独地经过细胞测量装置。

此外，例如在通道底部设置第二磁单元，使其在流动通道内凸起。这样 的优势在于，磁单元可额外地将磁力作用于磁标记物，特别是未经结合的磁 标记物也能造成妨碍该磁标记物继续流动的机械障碍。或者，也可在通道底 部放入导向带(Führungsstreifen)，使得对流动不构成机械障碍。但随后，作 用于未经结合的标记物的磁性保持力(Haltekraft)必须偏高，或者流速必须偏 低，由此能同样可靠地阻拦经结合的标记物。

第二磁单元特别具有磁性导向带。其特别由铁磁材料制成。优选以鱼骨 设计设置该磁性导向带。导向带在通道的中间还会呈现箭头形状。因此，可 特别有效地将经磁标记的细胞沿通道底部排列在此中轴线上，之后它们流向 细胞测量装置。为了达到过滤的目的，该导向带特别地在整个通道宽度上延 伸。

在本发明一项有利的实施方式中，在装置中这样设置第二磁单元，使得 磁力以及额外的阻力(Rückhaltekraft)通过该第二磁单元作用于未结合细胞的 磁标记物，这些力在方向和大小上抵消了复合悬浮液的流的剪切力。磁单元 的这种实施方式具有的优势在于，通过在未经结合的标记物上的两种力的组 合可以在通道中逆流动方向地阻拦该标记物。

在本发明另一项有利的实施方式中，这样来配置该装置的流动通道的通 道直径，使得通过磁标记物互相结合的多个细胞的细胞聚集体可以在通道中 部突起，突起的程度使得通过作用在该细胞聚集体上的力可将所述细胞聚集 体以在通道中部占优势(vorherrschenden)的流速运离。通道直径的这一设置 带来的另一优势在于，细胞聚集体不会导致假阳性的信号，因为会将其以在 通道中占优势的最高流速运离。特别地进一步配置流动通道的直径，使得在 通道中部流动的细胞聚集体到特别设置在通道底部之上或之中的细胞测量 装置的距离是可维持的，在该距离中可不引起细胞聚集体的检测。也就是说， 应选择这样大的通道直径，使得通过磁标记物互相结合的多个细胞的细胞聚 集体在离细胞测量装置足够远的距离上流过该装置。磁阻传感器的灵敏度约 以1/d³减小，其中d为至传感器的距离。用磁阻传感器便利地实现了细胞测 量装置。此传感器可以是GMR传感器。有利的是，设置多个例如像 Wheatstone桥式电路的桥元件的传感器元件。

在根据本发明的用于磁性流式细胞仪的方法中，产生了具有经磁标记的 细胞以及未结合细胞的标记物的细胞样本的层流。接下来，经磁标记的细胞 以及未结合细胞的标记物在梯度磁场中动态富集。额外地，以磁电泳的方式 沿轴线排列经磁标记的细胞。其中，选择梯度磁场的磁场强度以及流速，使 得作用在未结合细胞的磁标记物上的力可阻拦在流中的该磁标记物。其优势 在于，每一个受到阻拦的未经结合的标记物不会产生背景信号。

在该方法中，特别在细胞样本中加入过量的磁标记物。虽然由此会立刻 产生强背景信号，但由此也会首先确保，仅以较低浓度存在于样本中的极其 特异性的细胞无需进一步的样本处理就可得到可靠地标记，并且由此可得到 选择性地检测。仅通过过滤或阻拦过量的磁标记物的构思就可在例如为血液 的细胞样本中实现令人满意的单细胞的检测。

在本发明一项有利的实施方式中，该方法中的在流动通道内的细胞样本 层流的产生导致了朝向通道底部内壁的动态富集，以及沿轴线的磁电泳式的 排列，其中所述轴线沿通道底部的通道内壁在流动方向上延伸。通过这样的 轴线延伸，将经磁标记的细胞引导经过细胞测量装置。因此，会使细胞样本 这样经过在通道底部的内壁上的磁单元，以便于将该细胞样本中的未结合细 胞的磁标记物刚好被阻拦在此磁单元旁。

在该方法中优选使用超顺磁标记物作为磁标记物。

在本发明一项有利的实施方式中，如此选择梯度磁场的磁场强度和流 速，使得作用在通过磁标记物互相结合的多个细胞的细胞聚集体上的力以在 通道中部占优势的流速将这些细胞聚集体运离。其优势还在于，这样所述细 胞聚集体不会导致假阳性的信号。特别使细胞聚集体于其中移动的通道中部 如此远离细胞测量装置(特别是远离在通道壁旁或内的磁阻传感器)，使得不 会检测到在细胞聚集体中或周围的标记物的杂散磁场。

在该方法的一项实施方式中，特别将细胞样本注射进上述装置。

在本发明的用于磁性流式细胞仪的装置的制造方法中，在流动通道内于 通道底部设置用于排列经磁标记的细胞的第二磁单元，并且特别使其在流动 通道内突起。这样做的优势在于，相对于在通道底部的装置，可额外地实现 磁性保持力，也可通过流阻()实现机械阻力。

本发明的特别优势在于，通过阻拦未结合的标记物来减少背景信号，使 得磁性流式细胞仪的样品预备保持简单化。这特别是磁性测量的一个显著的 优势。因为必须向样本添加过量的磁标记物以得到足够可靠的待测细胞的标 记，所以这种背景的减少对于改善信噪比()来说仍 有更重要的意义。可特别考虑具有抗体的超顺磁性标签作为磁标记物，该超 顺磁性标签可通过抗体选择性地结合细胞表面上的同位素。然后，例如将超 顺磁性纳米颗粒结合于各抗体上。所述纳米颗粒特别具有20～200nm的直 径。

磁性标签通常很小。这些未结合细胞的标签具有小于500nm的流体动 力直径(hydrodynamische Durchmesser)。因此通过磁力可很好地阻拦曾经在 通道底部富集的这样小的磁单元，特别是因为流速在通道底部最小。所选的 流速通常低于5mm/s。与未经结合的标记物相反，经标记的细胞或更大的磁 珠具有例如3～20nm的直径，细胞聚集体具有相应更大的流体动力直径。所 述颗粒在微流体通道中扩展的越广，流速就越高，并且层流就越早地将它们 卷走。

用于以磁电泳方式排列经磁标记的细胞的磁单元具有有利的鱼骨形结 构。已证实这样的结构是特别有效的，经磁标记的细胞会这样二维地排列在 通道底部，有利于它们各自沿轴线相继流动，并且由此可引导其各自通过例 如为磁阻传感器的传感器单元。例如将Wheatstone桥式电路作为细胞测量装 置，并且其具有作为电桥元件的至少一个，特别为多个的磁阻传感器。

此外，鱼骨形结构不是不合适的，其对于未经结合的磁性颗粒的流动也 相应地产生了机械阻碍，并且由此对阻拦还有帮助。特别地，磁单元的“鱼 骨形”覆盖了整个通道宽度。

流动通道特别为微流体通道。该通道的直径特别适合于各细胞样本。特 征性细胞直径因待测细胞的类型而异，该直径对于在悬浮液的细胞和颗粒上 的流动剖面的影响是重要的。

因此，该方法的一个重要组成部分特别是在小体积的悬浮液中有针对性 地动态富集细胞。在微流体底部的方向上通过外部磁体进行富集过程。对于 经磁标记的细胞的严谨富集来说，重要的参数除磁标记物的类型和其杂散磁 场之外，还有流速和微流体尺寸，此外还有磁电泳导轨的实施，例如其与流 动方向之间的角度和其磁矩以及外部的梯度磁场。

以在三维空间中发生富集以及同步地在原位过滤(in-situ-Filterung)悬浮 液中的未经结合的标记物的方式，通过使用有利的鱼骨形式的磁电泳来确保 单细胞的检测。原位过滤的临界条件是铁磁性线路(ferromagnetischen Linien) 的阻力、外部磁场以及流速、和与待测物的流体动力直径相关的标记物的流 体动力直径，待测物即经磁标记的细胞或磁珠。

特别有利的是将未经结合的标记物的磁性阻拦与在铁磁性线路上的标 记物的过滤相结合，该铁磁性线路特别地分布在通道底部的整个宽度上。由 此，未经结合的标记物可以在任何点流过这些机械障碍，其无须向着外部磁 场移动。由此确保了未经结合的标记物的动态过滤。

在可选的实施方式中，例如这样设置铁磁性的导向带，使它们从通道壁 的两侧开始并且倾斜地朝向通道中部，例如以相对于通道壁以在0°～90°之间 的角度倾斜。其中导向带特别指向流动的方向。然而，在通道中部的导向带 不会像处在鱼骨形结构的情况下一样互相碰触，而是彼此略有偏移。

另外，磁电泳例如可串联其它铁磁带作为过滤带。即，铁磁性过滤带沿 着流动方向在磁电泳前方从一个通道壁至另一通道壁横穿通道底部。可将其 设置成垂直于通道壁或与通道壁形成在0°～90°之间的任意的角度。

所描述的用于磁性流式细胞仪的装置额外具有的特别优势在于，通过回 收流式细胞仪可在使用后更新其过滤效果。为此，可以特别去除或消除由 第一磁单元引起的外部磁场。额外地，可以用冲洗掉过滤颗粒的非常高的流 速来实施冲洗。

附图说明

参照附图1～6以示例的方式将对本发明的实施方式进行描述：

图1示出了该装置的流动通道的横截面图；

图2示出了具有磁导轨装置的流动通道和流动剖面的的横截面；

图3示出了磁导轨装置的俯视图；

图4示出了具有流动通道的传感器单元的装置的俯视图；

图5示出了关于在未结合的磁标记物上的力分布的第一实施例；以及

图6示出了关于在未结合的磁标记物上的力分布的另一实施例。

具体实施方式

图1示出了流动通道10的横截面的示意图。其具有上方的限制和通道 底部11。左侧示出的是通道入口12，右侧示出的是通道出口13。箭头44 表示流动的方向。在通道底部11中示出两个矩形，其为细胞测量装置，即 磁传感器20。在通道底部11的下方沿整个通道长度绘有永磁体22。其也可 仅为通道的一半长并且可限定在通道前段的左侧。在通道10中示出椭圆形 细胞30、32。其中，通过不同的阴影将未经标记的细胞30和经标记的细胞 32区分开来。通过永磁体22在梯度磁场中只有经磁标记的细胞32受到磁 力并且富集于通道底部11，这使得它们运动向磁传感器20上方靠近。所有 其它的细胞30更加远离通道底部11地移动越过磁传感器20。必须根据流 速41、通道直径和细胞标记物26的磁矩来选择富集路径240的长度并由此 选择在流动通道10下方的永磁体22的长度，尽可能使所有经磁标记的细胞 32从悬浮液中向通道底部富集。在所示的用于磁性流式细胞仪的装置中， 涉及到在动态富集细胞32之前发生的动态测量。对比细胞诊断的其它方法， 例如荧光流式细胞仪，将所述动态测量与动态富集和简单的样本处理(基本 上为将磁标记物26添加到细胞样本中)相结合，是磁性流式细胞仪的最大优 势之一。

图2示出了流动通道10横截面。左侧示意性地示出流动剖面40。在通 道层流40的情况下，将其轮廓大致设定为抛物线。箭头41代表了从通道的 中部向边缘减小的流速。从而，最高流速41占居通道中部。

通道段的左侧示出了所谓的富集和排列段240。在流动方向44上将其 插在检测区域20之前。在前部通道段240中设置有磁单元、永磁体22以及 磁导轨24。磁导轨24特别为例如由镍制成的铁磁性金属带。图2中，在通 道底部11上放置这些金属带24，使其在通道10中凸出。在流动方向44上 于前部通道段240的后面示出了经磁标记的细胞32会经过的磁传感器20。

再次用阴影表示经磁标记的细胞32。然而，有必要区分它是否是具有 多个磁标记物26并作为经标记的单细胞32在复合悬浮液中移动的所谓正确 的经磁标记的细胞32，还是以错误的方式附在单个磁标记物26上并通过此 标记物聚集的细胞30。这样的通过磁标记物26相互结合的多个细胞的聚集 体34具有比经标记的细胞32大的多的流体动力直径。对于单细胞32和细 胞聚集体34的不同的流动性能这是至关重要的。由于其大得多的流体动力 直径，这样的聚集体34在占据更高流速41的通道中部总是前进得更远。这 样的高流速41将较大的聚集体34卷走并使其再次远离通道底部11，这样 使得它们以距传感器20较远的距离200流过该传感器，并且因此不会检测 到它们。这就排除了由细胞聚集体34造成的假阳性信号。因此，通过例如 为流动通道直径和流动剖面40或流速41的参数，细胞测量可以是特异性的。 传感器20的灵敏度以1/d3减小，其中d为至传感器的距离。

干扰测量的背景信号主要是由未经结合的标记物26引起的，在细胞样 本中会过量地加入该标记物以确保能完全地标记样品中所有待测细胞32。 磁标记物26例如为通过抗体结合细胞表面上的同位素的超顺磁性标签。磁 传感器20例如为GMR传感器，其中GMR表示巨磁阻(giant magneto  resistance)。

图2示意性地示出了装置的过滤原理。较小的未结合的标记物26仅具 有非常小的流体动力直径，并且通过磁性富集靠近通道底部11。在那里铁 磁带24可以将它们从流体中所谓地过滤出来并且将其阻拦。此处，铁磁带 24首先在流动中充当机械障碍。磁标记物26必须向着永磁体22的梯度磁 场移动以使其从磁性过滤中解脱出来。此外，阻拦磁标记物26的磁性保持 力F_M在该铁磁带24上也占主导地位。因此，所述过滤是磁力过滤F_M和剪 切力过滤F_S的结合。

图3示出了图2所示的通道段的俯视图。再次用箭头标记流动方向44。 在前部，即在通道10的流动方向上的靠前区域，再次示出了富集段240。 在该区域内，分布着用于以电磁泳的方式富集和排列经磁标记的细胞32的 铁磁导轨24。按特别有利的鱼骨形设计来设置该磁导轨24，该鱼骨形设计 从通道壁14向通道中部渐缩。此外，它对于有效地过滤未结合的磁标记物 26是特别有利的，该磁导轨24覆盖了通道的整个宽度100且没有留下一点 空隙。此外，未在图中明确地示出永磁体22，因为它位于通道底部11的下 方，特别地延伸至整个通道宽度100，使得均匀的梯度磁场在整个通道宽度 100上作用于在悬浮液中的磁性颗粒26。特别有利的是，当永磁体22延伸 超过通道宽度100，例如至分布在通道壁14上的虚线时，有利于在通道10 内产生均匀的梯度磁场。

此外，图3还示出了分布在中心的磁导轨24，其标记了通道中部，并 且可将它视为所述的在其上排列有经磁标记的细胞32的轴线。沿着该轴线 的假象延长线上，在流动通道10中接着设有经磁标记的细胞32会流动通过 的磁传感器20。图3还示出了不受磁场作用影响的未经磁标记的细胞30。

代替经磁标记的细胞32，也可以这种方式富集和排列磁珠。这种测量 方法对于可经磁标记的其它分析物也是合适的。

在荧光流式细胞仪中，也会在样品准备阶段加入过量的荧光标记物，之 后必须通过离心和清洗步骤将其倾析。如果适当地调整磁单元以及流动性能 的参数，使其适应待测磁性细胞的大小，对于磁性流式细胞仪来说就不需要 这样的步骤。

图4最终示出了具有在Wheatstone桥式电路中彼此相连接的磁阻元件 20的磁传感器单元的装置。此外，还示出了磁阻20的电引线21。箭头再次 表示通过流动通道10的流动方向44。

图5和图6最后应示意性地示出作用在未经结合的磁标记物26上的力。 为此，只示出了具有铁磁带24的通道底部11的截面。在图5中示出的是具 有抗体和磁性颗粒的磁标记物26，其通过磁性保持力F_M在通道底部11受 到阻拦，该保持力是由铁磁带24和位于通道底部11下方的永磁体22的梯 度磁场一起引起的。此磁性保持力F_M在垂直于通道底部11的方向上作用于 磁标记物26，并且将其固定在铁磁带24旁。作用在磁标记物26上的还有 复合悬浮液流的剪切力FS。该力沿流动方向44平行于通道底部11。从而， 为固定住磁标记物26，磁性保持力F_M必须大于剪切力F_S。

图6最终示出了有利于过滤作用的铁磁带24在通道底部11的设置。该 铁磁带24在流动通道10中凸起，以便于在流动方向44上于铁磁带24后面 抓住磁标记物26。在那里位于通道底部11下方的永磁体22的磁性保持力 FM在垂直于通道底部11的方向上作用于磁标记物26。复合悬浮液流动44 上的冲击(angreifende)剪切力FS支配在磁标记物26上的受冲击面较小。另 外，铁磁带24提供了流动障碍，这对于磁标记物26而言意味着是额外的阻 力F_R。

在横截面积为0.105μm²的流体通道10内，当流速为1μl/s时，流速约 为1500μm/s并且复合悬浮液扫过磁传感器20。镍带24阻拦住磁性纳米磁珠 26。在测量之后应使镍带系统24再次摆脱这些纳米磁珠26。为此，例如以 4μl/s的速率清洗流动通道10。然后，过滤装置24中的未经结合的磁性纳米 磁珠26也会移动穿过通道10。此外，更高的流速可以使外部磁场最小化或 将其断开。

图7最后还示出了具有交错的铁磁性导带24的通道10的另一实施方 式，该铁磁性导带在通道10的中部不互相接触，而是像拉链一样偏移。也 优选将其设置成与通道壁成45°角并指向流动方向44。独立于精确的设置， 磁电泳240还可以将一个额外的过滤装置250设置在前面。如此，将该过滤 装置在流动方向44上更靠前地设置在通道10中，即在图7中为更靠左的位 置。从而延伸铁磁带25从一个通道壁横穿通道底部11至另一通道壁。特别 地将其设置成垂直于通道壁或与通道壁形成0°～90°的角度。