栀子厚朴汤颗粒HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱

摘要

本发明公开一种栀子厚朴汤颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备对照品溶液：分别配制厚朴酚、和厚朴酚、栀子苷、橙皮苷、辛弗林及芸香柚皮苷对照品溶液；(2)制备供试品溶液：称取栀子厚朴汤颗粒，进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱；检测波长230nm；(4)评价相似度：供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。所述方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可将其作为栀子厚朴汤颗粒剂的质量控制和鉴别产品的真伪优劣的指标之一。

说明书

技术领域

本发明涉及一种栀子厚朴汤的质量控制方法，具体涉及栀子厚朴汤颗粒HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。

背景技术

栀子厚朴汤源自《伤寒论》，其组方为栀子、厚朴、枳实三味药，除烦泄满的代表方剂，主要用于热扰胸膈、心烦腹满证；现在已越来越多地将该方用于治疗神经官能症、焦虑症、失眠症等。

滇虹药业集团有限公司研发了我国第一个栀子厚朴汤颗粒制剂。已被列为云南省科技厅重大专项。有关栀子厚朴汤的临床应用以及栀子厚朴汤中各单味药材的研究虽有报道，但是仅有朱兰等(朱兰，冯芳，任杨帆等，多种色谱-波谱联用技术分析栀子厚朴汤中特征成分及其配伍前后的溶出变化.中国药科大学学报，2009，40(5)：426-430)采用多种色谱-波谱联用技术，鉴别并归属栀子厚朴汤中的特征成分，庄波阳等(庄波阳，冯芳，周娟.高效液相柱前衍生化法和高效液相荧光法测定栀子厚朴汤4种生物碱的比较.海峡药学，2010，22(7)：98-101)对其中的四个碱进行了测定，但至今还没有文献报道对栀子厚朴汤颗粒指纹图谱的研究。而中药指纹图谱技术是一种表征中药所含成分与其质量关系的有效手段，已成为国内外广泛认可的重要质量评价模式。

发明内容

本发明为栀子厚朴汤颗粒的质量控制和真伪鉴别提供一种新的方法，即建立栀子厚朴汤颗粒HPLC指纹图谱的方法，并由此方法得到栀子厚朴汤颗粒的标准指纹图谱。

本发明建立的HPLC指纹图谱有良好的精密度、重复性和稳定性，能够用于栀子厚朴汤颗粒剂的质量控制和鉴别真伪。

因此本发明的第一个目的是提供一种栀子厚朴汤颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：分别配制厚朴酚、和厚朴酚、栀子苷、橙皮苷、辛弗林及芸香柚皮苷对照品溶液，优选浓度均为20～500μg/mL；

(2)制备供试品溶液：称取栀子厚朴汤颗粒，优选0.1～10g，进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱；检测波长230nm；

(4)评价相似度：供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。

本发明所使用的术语“HPLC程序检测”是指利用二极管阵列检测器(DAD)特有的程序HPLC功能，根据各组分的出峰顺序，在不同时间段分别采用各组分的最佳吸收波长进行检测的方法。

本发明所使用的术语“评价相似度”是指对现有的栀子厚朴汤颗粒供试品的指纹图谱按照国家药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行相似度的评价。

以下具体描述以上各步骤。

(1)对照品溶液的制备：

A.厚朴酚对照品溶液的制备：精密称取厚朴酚对照品适量，用甲醇配制成每1ml含厚朴酚20～500μg的溶液；

B.和厚朴酚对照品溶液的制备：精密称取和厚朴酚对照品适量，用甲醇配制成每1ml含和厚朴酚20～500μg的溶液；

C.栀子苷对照品溶液的制备：精密称取栀子苷对照品适量，用甲醇配制成每1ml含栀子苷20～500μg的溶液；

D.橙皮苷对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷对照品适量，用50％甲醇配制成每1ml含橙皮苷20～500μg的溶液；

E.辛弗林对照品溶液的制备：精密称取辛弗林对照品适量，用50％甲醇配制成每1ml含辛弗林20～500μg的溶液；

F.芸香柚皮苷对照品溶液的制备：精密称取芸香柚皮苷对照品适量，用50％甲醇配制成每1ml含芸香柚皮苷20～500μg的溶液；

(2)供试品溶液的制备：精密称取栀子厚朴汤颗粒0.1～10g，0％～50％(体积百分比)甲醇提取，再超声提取，提取时间为10～80min，提取时间为优选为30min，提取液用微孔滤膜(孔径为0.2μm～0.8μm，优选0.45μm)过滤，即得供试品溶液；

(3)高效液相色谱仪自动进样器进样0.5～20μl，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，梯度洗脱的流动相A为0.01～3％(体积百分比)三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱时间为20～180min，流速0.3～1.5ml/min；柱温20～45℃；检测波长230nm，程序HPLC检测；

(4)相似度评价：供试品指纹图谱在程序HPLC检测下的相似度均大于0.90。

根据本发明一个优选的实施方式，在步骤(3)中，所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如以下浓度配制进行：0min→36min→80min→95min→130min→140min，乙腈2％→10％→20％→30％→75％→90％(体积百分比)。

根据本发明另一个优选的实施方式，在步骤(3)中，所述的HPLC检测程序为：检测波长为230nm。

根据本发明一个特别优选的实施方式，本发明检测方法中的步骤(2)至(3)可以通过下述步骤实施：(2)供试品溶液的制备：取栀子厚朴汤颗粒研细(过60目筛)，精密称取0.28g，置具塞锥形瓶中，精密加入双蒸水25ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，离心15min，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液。(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0.05％三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱时间为140min，流速1.0ml/min；柱温35℃；紫外检测波长：程序HPLC检测。

本发明的第二个目的是提供按照本发明HPLC指纹图谱的建立方法所得到的栀子厚朴汤颗粒的标准指纹图谱，其中有32个共有峰，2.322min、2.742min、3.485min、5.211min、6.203min、6.878min、15.512min、18.842min、20.762min、21.168min、23.231min、24.321min、25.033min、28.337min、35.916min、36.752min、37.654min、42.899min、45.937min、49.824min、51.586min、56.636min、57.794min、70.556min、74.25min、80.67min、85.033min、88.313min、91.643min、95.27min、120.169min、123.57min，峰号依次记为1-32号，以25号峰(芸香柚皮苷)作为参比峰，峰号(相对保留时间)分别为：1(0.031)、2(0.037)、3(0.047)、4(0.070)、5(0.084)、6(0.093)、7(0.209)、8(0.254)、9(0.280)、10(0.285)、11(0.313)、12(0.328)、13(0.337)、14(0.382)、15(0.484)、16(0.495)、17(0.507)、18(0.578)、19(0.619)、20(0.671)、21(0.695)、22(0.763)、23(0.778)、24(0.950)、25(1)、26(1.086)、27(1.145)、28(1.189)、29(1.234)、30(1.283)、31(1.618)、32(1.664)。其中6号峰为辛弗林，18号共有峰即栀子苷，25号峰为芸香柚皮苷(S)，26号峰为橙皮苷，31号峰为和厚朴酚，32号峰为厚朴峰。这些共有特征峰构成了栀子厚朴汤颗粒的HPLC指纹图谱，可作为栀子厚朴汤颗粒的标准指纹图谱。

根据本发明一个优选的实施方式，按照本发明所提供HPLC指纹图谱的建立方法所得到的栀子厚朴汤颗粒的标准指纹图谱中的32个共有峰中，其中单峰面积占总峰面积大于5％，而小于10％的共有峰为峰6、峰22、峰26；单峰面积占总峰面积大于10％的共有峰为峰18、峰25；其余色谱峰峰面积均小于5％。

本发明方法具有如下显著的优点和用途：

(a)本发明首次公开程序HPLC检测用于栀子厚朴汤颗粒指纹图谱的建立；

(b)供试品制作简便，色谱条件容易实现；

(c)方法稳定性和重现性均较好；

(d)有效表征了栀子厚朴汤颗粒的质量，有利于产品质量监控；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可准确地鉴别产品的真伪优劣。

下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所例举的实施例及附图对本发明没有限制。

附图说明

图1：实施例2的10批次栀子厚朴汤颗粒剂叠加图，其中S1～S10分别为栀子厚朴汤颗粒1～10号，R为生成的对照谱。

图2：栀子厚朴汤颗粒HPLC对照图谱及共有色谱峰的标定，其由中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版生成，记为ZZHPT-CP-R。

图3：实施例1栀子厚朴汤颗粒HPLC指纹图谱的检测结果。

图4：实施例3栀子厚朴汤颗粒中间体HPLC指纹图谱。

图5：实施例4中ZZHPT-CP-1与HP-1比较图，其中由上到下分别代表栀子厚朴汤成品的色谱图和厚朴1的色谱图。

图6：实施例4中ZZHPT-CP-1与ZZ-1的比较图，其中由上到下分别代表栀子厚朴汤成品的色谱图和栀子1的色谱图。

图7：实施例4中ZZHPT-CP-1、ZZHPT-CP-4、ZS-1和ZS-2的比较图，其中由上到下分别代表ZZHPT-CP-4、ZS-2、ZZHPT-CP-1、ZS-1的色谱图。

图8：实施例4中HP-110801、ZS-110802、ZZ-110801、ZZHPT-111107和空白比较图，其中由上到下分别代表空白、ZZHPT-111107、ZZ-110801、ZS-110802和HP-110801的色谱图，图中用相同颜色标明了ZZHPT-111107的主要成分来源于何种药材。注意：提交文档都是黑白的，不能用颜色来区分

图9：实施例5中ZZHPT-111107供试品溶液DAD图谱。

图10：实施例5中ZZHPT-111107供试品溶液不同波长下色谱图比较，其中由下至上分别为：275nm、240nm、440nm、230nm、315nm、202nm、210nm。

具体实施方式

实施例1：栀子厚朴汤颗粒HPLC指纹图谱的检测

1仪器与试药

1.1仪器：Agilent 1260液相色谱仪(Agilent 1260四元泵、MWD检测器、DAD检测器、Agilent 1260自动进样器)，Agilent Chemstation色谱工作站；

1.2试剂：

厚朴酚、和厚朴酚、栀子苷、橙皮苷、辛弗林标准品(中国药品生物制品检定所，批号分别为：0729-9805、0730-9204、110749-200714、110721-200613、110727-200306)，芸香柚皮苷(批号MUST-11101011，上海雅吉生物科技有限公司)；乙腈、甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2.高效液相色谱

2.1色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(SHISEIDOCAPCELL PAK C18MGII色谱柱，4.6mm×250mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动相A为0.05％三氟乙酸酸水溶液，流动相B为乙腈，分析时间为140min，流速1.0ml/min；柱温35℃；

梯度洗脱程序：0min→36min→80min→95min→130min→140min，乙腈2％→10％→20％→30％→75％→90％。检测波长为230nm。

2.2对照品溶液的制备：取厚朴酚、和厚朴酚，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含40μg、24μg的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤即得。取栀子苷、橙皮苷、辛弗林及芸香柚皮苷适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含30μg、500μg，30μg、320μg的溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过即得。

2.3供试品溶液的制备：

栀子厚朴汤颗粒供试品溶液的制备：取栀子厚朴汤颗粒研细(过60目筛)，精密称取0.28g，置具塞锥形瓶中，精密加入双蒸水25ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，离心(3000r/min)15min，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液。

2.4测定：高效液相色谱仪自动进样器进样20μl，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱(如图3)与图2相似。

实施例2：检测10批次栀子厚朴汤颗粒的标准指纹图谱

取栀子厚朴汤颗粒10批次，编号为：ZZHPT-KL-111101、ZZHPT-KL-111102、ZZHPT-KL-111103、ZZHPT-KL-111201、ZZHPT-KL-111202、ZZHPT-KL-111203、ZZHPT-KL-111204、ZZHPT-KL-111205、ZZHPT-KL-111206和ZZHPT-KL-111207，分别记为ZZHPT-CP-1～10，均由滇虹药业集团有限公司提供，规格：6g/袋，含浸膏粉4.2g。)，按实施例1条件进行检测，得10批次样品的HPLC图谱，如图1所示，通过10批HPLC图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰：

指纹图谱中有32个特征共有峰，现将图谱的保留时间、峰面积相对保留时间、相对峰面积、占总峰面积百分比汇总，具体表1所示：

表1：32个共有峰相对保留时间、相对峰面积及占总峰面积百分比

所述指纹图谱中，栀子厚朴汤颗粒的HPLC指纹图谱中含有32个特征共有峰，6号峰为辛弗林，18号共有峰即栀子苷，25号峰为芸香柚皮苷(S)，26号峰为橙皮苷，31号峰为和厚朴酚，32号峰为厚朴峰，图谱总长为140min，其中单峰面积占总峰面积大于5％而小于10％的共有峰为峰6、峰22、峰26；单峰面积占总峰面积大于10％的共有峰为峰18、峰25；其余色谱峰峰面积均小于5％。

相似度评价：采用中国药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对HPLC图谱进行综合评价，相似度结果见表2。

由表2可见10批栀子厚朴汤颗粒HPLC指纹图谱之间及与对照谱比较，相似度均大于0.99。

通过上述方法所建立的栀子厚朴汤颗粒HPLC标准指纹图谱如附图2所示。

实施例3：

取栀子厚朴汤半成品10批，编号分别为：ZZHPT-111001、ZZHPT-111002、ZZHPT-111003、ZZHPT-111101、ZZHPT-111102、ZZHPT-111103、ZZHPT-111104、ZZHPT-111105、ZZHPT-111106、ZZHPT-111107；均由滇虹药业集团有限公司提供，按实施例1条件进行检测，得10批次样品的HPLC图谱，通过10批HPLC图谱的比较，进行相似度评价，结果见表3。并与10批栀子厚朴汤颗粒剂的HPLC图谱进行比较，见图4。

由图4可见，栀子厚朴汤成品和栀子厚朴汤半成品的色谱行为一致，因此栀子厚朴汤成品各峰的指认、标定及参照物的选择，按照栀子厚朴汤半成品的结果进行研究。

实施例4：

取制备栀子厚朴汤浸膏粉的栀子、枳实、厚朴药材，记为ZZ-1～3、ZS-1、2、HP-1、2，均由滇虹药业集团有限公司提供，按实施例1条件进行检测，得样品的HPLC图谱，通过与10批栀子厚朴汤浸膏粉HPLC图谱的比较，对色谱峰进行归属，结果见图5～7和表4。

由图5、图6可见栀子和厚朴中的成分都能在成品的图谱中进行指认。

由图7可见不同批号ZZHPT成品与枳实比较与ZZHPT半成品的比较一致，都显示枳实的来源更接近于ZS-2。

表4生成的对照指纹图谱中32个共有峰在三味药材中的指认结果

实施例5：

按实施例1条件进行检测，通过全波长扫描得到ZZHPT-11110供试品溶液在200-400nm的图谱，见图9、图10。

经比较，检测波长为230nm时，基线较稳定，色谱信息量大，因此选用检测波长为230nm。实施例5不限于对不同波长的考察，我们还对不同类型色谱柱、不同柱温、不同提取方式等进行了考察，最终优选出最终的色谱条件。