脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测试剂盒及制备、操作方法

摘要

本发明涉及一种体外诊断试剂制备领域，属于生物技术领域，具体涉及一种脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测试剂盒及制备、操作方法，包含磁分离试剂、酶反应物、底物溶液、稀释液、缓冲液、校准品、质控品和清洗液，所述磁分离试剂为含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球，所述酶反应物为含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体，所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液，所述校准品及质控品为含有Lp-PLA2抗原的BSA蛋白溶液。本发明还包括其制备和操作方法。本发明的有益之处在于：具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数；与普通酶联免疫技术相比，缩短了临床检测时间；与化学发光法相比，降低了临床开展本检测的成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诊断试剂制备领域，属于生物技术领域，具 体涉及一种测定血清中人脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）含量的试剂 盒及制备、操作方法。

背景技术

脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2， Lp-PLA2)，属于磷脂酶超家族,含有441个氨基酸残基,相对分子 质量约为45400。Lp-PLA2主要由炎症细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞 等)分泌，并受炎性介质的调节，目前研究表明Lp-PLA2作用主要是 产生二十烷酸类炎性介质，促进血小板聚集、中性粒细胞和单核细胞 趋化以及促进白三烯等炎症介质释放，从而促进血栓形成、炎症反应 以及促进动脉粥样硬化，被视为一种新的炎性反应标志物，是反映血 管炎症的特异性标记物，在促进动脉粥样硬化以及冠心病和卒中的形 成等方面发挥重要作用。外周血中Lp-PLA2浓度增加被视为患心脑血 管栓塞疾病（如冠心病、中风）的独立危险因子。

临床检测人外周血Lp-PLA2浓度能给临床医生提供预防和治疗 心脑血管事件的新靶点，为临床疾病的早期干预、临床应用治疗提供 新思路新方向。

目前用于检测Lp-PLA2的试剂和方法主要是化学发光免疫分析 法(CLIA)、酶联免疫吸附法（ELISA）和胶乳增强比浊法。产品存在 操作繁琐，数据重复性差以及精确度不足等缺点。

化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化 和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种激发态的中间体回到 稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接 测定Lp-PLA2的浓度。目前市场上有管式和板式两种试剂盒，但此 法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记 物不稳定，这种直接标记法属于瞬间发光型，很难保证测试结果的稳 定性和重复性，而且需要特殊的检测仪器，不便于常规实验室开展。

普通酶联免疫法（ELISA）自动化程度不高，且受人为因素影响 较大，重复性差，整个反应测定时间也很长（至少需要40分钟）。 胶乳增强比浊法是一种灵敏、简洁、快速的检测方法，但在脂血的抗 干扰方面效果不佳，而心血管病人有很大一部分都存在血脂浓度高的 情况，检测中容易出现假阳性结果，而且抗凝剂的使用对该方法的影 响也比较大。因此迫切需要一种高灵敏度、高特异性，同时方法简便、 快速，不容易受其他因素干扰的方法。

在20世纪90年代开始推广的磁微粒分离酶联免疫检测技术是一 种结合免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术建立的新型酶联免 疫检测方法。与传统ELISA方法中抗原、抗体的结合反应是在固相 表面进行的不一样的是，磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体 的结合反应在近似液相下进行，克服了普通微孔板酶联免疫分析 （ELISA）分析精密度差、灵敏度差的缺点，反应快速、彻底，具有 灵敏度高，特异性高，操作简便，检测用时少和不易受脂血等外界因 素干扰的优点。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脂蛋白相关 磷脂酶A2定量检测试剂盒及制备、操作方法，采用该试剂盒进行 Lp-PLA2检测具有较高的灵敏度、特异性、操作简便和更短检测时间 的优点。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒，包含磁分离试剂、酶反 应物、底物溶液、稀释液、缓冲液、校准品、质控品和清洗液，所述 磁分离试剂为含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球，所述酶 反应物为含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体，所述底物溶 液为酶促化学发光底物溶液，所述校准品及质控品为含有Lp-PLA2抗 原的BSA蛋白溶液。

前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒，所述稀释液为含 有BSA的溶液。

前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒，所述缓冲液为含 有Tris的溶液。

前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒，所述清洗液为含 有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。

前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒，所述的Lp-PLA2 试剂盒检测浓度为0.1—1600ng/mL。

一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步 骤：

步骤一，磁分离试剂的制备

（1）制备MES溶液；

（2）取表面含羧基活性基团的磁微粒，加入活化剂，25℃混匀2—4 小时，用MES溶液洗涤后用MES溶液重悬，加入Lp-PLA2抗体，37℃ 混匀2—4小时，加入缓冲液于37℃封闭1小时，然后用缓冲液洗涤 磁珠，并用缓冲液制成磁分离试剂溶液；

步骤二，酶反应物的制备

（1）将抗Lp-PLA2抗体溶于PBS溶液中，加入活化剂，20℃放置30 —60分钟后加入甘氨酸终止反应，20℃静置3—5分钟，通过层析柱 除去活化剂，收集蛋白峰，在活化后的抗体溶液中加入DTT和PBS 溶液，混匀后室温放置30—60分钟，通过层析柱除去游离的DTT， 收集蛋白峰；

（2）将碱性磷酸酶ALP溶于EDTA和Tris-HCl溶液中，加入Traunt 试剂，室温放置40—60分钟，通过层析柱除去活化剂，收集蛋白峰；

（3）将（1）和（2）的溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1 混合，室温放置3—5小时，然后用层析柱分离纯化，收集第一和第 二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃；

步骤三，底物溶液的制备

称取Tris、NaCl、Na2SO3和Proclin-300，用纯化水溶解， pH值调整到7.8—8.2之间，加入发光底物后，过滤收集滤液，用纯 化水定容，混匀后即得；

步骤四，稀释液的制备

称取NaCl和BSA，量取Proclin-300加纯化水溶解，混合定容， pH值调制7.2—7.6之间，完全溶解后，过滤，贴好标签于4℃冷库 贮存；

步骤五，缓冲液的制备

取Tris和NaCl，量取Proclin-300用纯化水溶解，混合待完 全溶解，调整pH到7.2—7.6之间，称取阻断剂溶于上述溶液中定容， 待完全溶解后，过滤即得；

步骤六，校准品和质控品的制备

将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的 校准品与质控品，校准品浓度分别为在1ng/mL——1600ng/mL之间按 浓度差取6个值；

步骤七，清洗液的制备

称取Tris和NaCl，称取吐温20加纯化水，完全溶解后与Tris 和NaCl混合，量取Proclin-300加纯化水完全溶解后倒入上述混合 液中，用纯化水定容，PH调在7.2—7.6之间，过滤即得。

前述的一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备方法，步骤 二中所述的酶反应物稀释液配制方法为：Tris、NaCl、叠氮钠，用纯 化水溶解，调整pH值至7.5，加入吐温20、BSA，定容，过滤，于4℃ 保存。

一种人外周血Lp-PLA2定量检测试剂盒的操作方法，其特征在 于，包括以下步骤：

步骤一，加样与免疫反应

在试管中加入Lp-PLA2待测样本、校准品和质控品，然后依次加入 酶反应物、磁分离试剂和缓冲液，用多管混匀器轻轻振荡1分钟后， 37℃水浴30分钟；

步骤二，洗涤

反应试管放置在磁分离器上，使磁微粒在磁场中沉降2分钟，缓缓倒 转分离器，倒去上清液，并除去黏在管壁上的液滴；

步骤三，每支试管加入清洗液，震荡30秒使磁微粒充分混悬，再次 使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；

步骤四，重复步骤二与步骤三2次；

步骤五，加底物溶液

每管加入底物溶液。37℃混匀后1分钟内检测；

步骤六，读值

在分光光度计或发光强度检测仪上读取吸光度或发光强度值。

本发明工作原理：磁分离酶联免疫技术采用磁粒为包被固相， 37℃孵育后，磁粒在液相中与免疫复合物反应,磁性微粒上结合的 Lp-PLA2抗体与酶标抗体分别与Lp-PLA2抗原的不同表位结合，反应 形成双抗夹心复合物。在外加磁场中直接沉淀，倒去上清液后清洗沉 淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂 解发出光子，形成发光反应，使用发光仪检测反应的发光强度，根据 标准曲线即可算出样品中的Lp-PLA2含量。在试剂盒检测范围内，发 光强度与样本中的Lp-PLA2浓度成正比。

本发明的有益之处在于：本发明Lp-PLA2定量测定试剂盒运用磁 微粒分离酶联免疫技术，提供了一种接近均相的反应体系，与现有化 学发光法以及普通酶联免疫法相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵 敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。与普通酶联免疫技术相比， 运用本试剂盒可以在1小时内完成所有检测过程，缩短了临床检测时 间。与化学发光法相比，本试剂盒不需要特殊的全自动化学发光仪器， 可以在普通分光光度计或发光检测仪上开展，极大的降低了临床开展 本检测的成本。

附图说明

图1是本发明的Lp-PLA2校准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例一：

一磁分离试剂（含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球） 的制备

（1）0.1mol/L的pH4.5的MES溶液（2-（N-吗啉代）乙磺酸） 制备：

称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取 950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径 0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

（2）取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛 活化，25℃混匀2小时，用0.1mol/L MES，pH4.5溶液10mL洗涤3 次，磁微粒用该溶液1mL重悬；加入2mg Lp-PLA2抗体，37℃混合 均匀2小时；之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液 于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。

二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的 制备

（1）将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液 中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL， 20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3分钟；通过 SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；每毫升活化的抗体溶液 中加入0.5mL0.05mol/mL DTT（二硫苏糖醇）0.01mol/L PBS PH7.4 溶液，混匀后，室温放置30分钟；通过SephadexG25柱子除去游离 的二硫苏糖醇，收集蛋白峰。

（2）将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCL PH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mL Traunt试剂（巯基活 化试剂）室温放置40分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收 集蛋白峰；

（3）将（1）和（2）溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1 混合，室温放置3小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化， 收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保 存在4℃。

将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL， 使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。

酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠 1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g， 加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。

三底物溶液（酶促化学发光底物溶液）的制备

称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL 于1000mL烧杯中；量筒量取700mL纯化水于烧杯中，充分搅拌，直 至完全溶解，pH值调整到7.8；加入250mL发光底物鲁米诺 (Luminol-Phos)后，用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容 至1L，混匀后即得。

四稀释液的制备

称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中；用移液器将 Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解，倒入上述烧杯中；最 后定容1L，pH值调至7.2；待完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，贴 好标签于4℃冷库贮存（有效期1年）。

五缓冲液的制备

取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中，取0.2mL Proclin-300 于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L烧杯中；取800mL 纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调整pH到7.2； 称取阻断剂（优选Mak33）0.9g溶于上述溶液中；最后定容至1L， 完全溶解后，用0.2μm滤器过滤即得。

六校准品与质控品的制备

将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的 校准品与质控品。校准品浓度分别为1.5ng/mL，6ng/mL，24ng/mL， 96ng/mL，384ng/mL，1536ng/mL，质控品浓度分别为6ng/mL，384ng/mL。

七清洗液的制备

称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中；称取5g吐 温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后，倒入烧杯中；用 移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全 溶解后，倒入烧杯中；用量筒量取800mL纯化水于烧杯中，充分搅拌， 直至完全溶解，溶液PH调至7.2；最后用纯化水定容1000mL，完全 溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。

Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例二：

一磁分离试剂（含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球） 的制备

（1）0.1mol/L的pH4.5的MES溶液（2-（N-吗啉代）乙磺酸） 制备：

称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取 950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径 0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

（2）取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛 活化，25℃混匀3小时，用0.1mol/L MES，pH4.5溶液10mL洗涤3 次，磁微粒用该溶液1mL重悬；加入2mg Lp-PLA2抗体，37℃混合 均匀3小时；之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液 于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。

二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的 制备

（1）将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液 中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL， 20℃放置45分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置4分钟；通过 SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；每毫升活化的抗体溶液 中加入0.5mL0.05mol/mL DTT（二硫苏糖醇）0.01mol/L PBS PH7.4 溶液，混匀后，室温放置45分钟；通过SephadexG25柱子除去游离 的二硫苏糖醇，收集蛋白峰。

（2）将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCL PH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mL Traunt试剂（巯基活 化试剂）室温放置50分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收 集蛋白峰；

（3）将（1）和（2）溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1 混合，室温放置4小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化， 收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保 存在4℃。

将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL， 使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。

酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠 1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g， 加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。

三底物溶液（酶促化学发光底物溶液）的制备

称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL 于1000mL烧杯中；量筒量取700mL纯化水于烧杯中，充分搅拌，直 至完全溶解，pH值调整到8.0；加入250mL发光底物鲁米诺 (Luminol-Phos)后，用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容 至1L，混匀后即得。

四稀释液的制备

称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中；用移液器将 Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解，倒入上述烧杯中；最 后定容1L，pH值调至7.4；待完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，贴 好标签于4℃冷库贮存（有效期1年）。

五缓冲液的制备

取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中，取0.2mL Proclin-300 于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L烧杯中；取800mL 纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调整pH到7.4； 称取阻断剂（优选Mak33）0.9g溶于上述溶液中；最后定容至1L， 完全溶解后，用0.2μm滤器过滤即得。

六校准品与质控品的制备

将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的 校准品与质控品。校准品浓度分别为1ng/mL，5ng/mL，25ng/mL， 125ng/mL，625ng/mL，1250ng/mL，质控品浓度分别为5ng/mL， 525ng/mL。

七清洗液的制备

称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中；称取5g吐 温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后，倒入烧杯中；用 移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全 溶解后，倒入烧杯中；用量筒量取800mL纯化水于烧杯中，充分搅拌， 直至完全溶解，溶液PH调至7.4；最后用纯化水定容1000mL，完全 溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。

Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例三：

一磁分离试剂（含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球） 的制备

（1）0.1mol/L的pH4.5的MES溶液（2-（N-吗啉代）乙磺酸） 制备：

称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取 950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径 0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

（2）取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛 活化，25℃混匀4小时，用0.1mol/L MES，pH4.5溶液10mL洗涤3 次，磁微粒用该溶液1mL重悬；加入2mg Lp-PLA2抗体，37℃混合 均匀4小时；之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液 于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。

二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的 制备

（1）将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液 中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL， 20℃放置60分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置5分钟；通过 SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；每毫升活化的抗体溶液 中加入0.5mL0.05mol/mL DTT（二硫苏糖醇）0.01mol/L PBS PH7.4 溶液，混匀后，室温放置60分钟；通过SephadexG25柱子除去游离 的二硫苏糖醇，收集蛋白峰。

（2）将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCL PH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mL Traunt试剂（巯基活 化试剂）室温放置60分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收 集蛋白峰；

（3）将（1）和（2）溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1 混合，室温放置5小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化， 收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保 存在4℃。

将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL， 使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。

酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠 1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g， 加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。

三底物溶液（酶促化学发光底物溶液）的制备

称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na₂SO₃0.002g和Proclin-3000.2mL 于1000mL烧杯中；量筒量取700mL纯化水于烧杯中，充分搅拌，直 至完全溶解，pH值调整到8.2；加入250mL发光底物鲁米诺 (Luminol-Phos)后，用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容 至1L，混匀后即得。

四稀释液的制备

称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中；用移液器将 Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解，倒入上述烧杯中；最 后定容1L，pH值调至7.6；待完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，贴 好标签于4℃冷库贮存（有效期1年）。

五缓冲液的制备

取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中，取0.2mL Proclin-300 于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L烧杯中；取800mL 纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调整pH到7.6； 称取阻断剂（优选Mak33）0.9g溶于上述溶液中；最后定容至1L， 完全溶解后，用0.2μm滤器过滤即得。

六校准品与质控品的制备

将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的 校准品与质控品。校准品浓度分别为2ng/mL，7ng/mL，24.5ng/mL， 85.75ng/mL，300ng/mL，1050ng/mL，质控品浓度分别为7ng/mL， 1050ng/mL。

七清洗液的制备

称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中；称取5g吐 温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后，倒入烧杯中；用 移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全 溶解后，倒入烧杯中；用量筒量取800mL纯化水于烧杯中，充分搅拌， 直至完全溶解，溶液PH调至7.6；最后用纯化水定容1000mL，完全 溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。

Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例四：

一磁分离试剂（含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球） 的制备

（1）0.1mol/L的pH5的MES溶液（2-（N-吗啉代）乙磺酸）制 备：

称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取 950mL纯化水溶解，pH调节至5.0；加纯化水定容到1L，采用孔径 0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

（2）取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛 活化，25℃混匀3小时，用0.1mol/L MES，pH5溶液10mL洗涤3次， 磁微粒用该溶液1mL重悬；加入2mg Lp-PLA2抗体，37℃混合均匀 3小时；之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37° 封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS(pH7.4) 缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。

二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的 制备

（1）将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液 中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane〃HCl(2IT)溶液20μL， 20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3分钟；通过 SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；每毫升活化的抗体溶液 中加入0.5mL0.05mol/mL DTT（二硫苏糖醇）0.01mol/L PBS PH7.4 溶液，混匀后，室温放置30分钟；通过SephadexG25柱子除去游离 的二硫苏糖醇，收集蛋白峰。

（2）将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCL PH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mL Traunt试剂（巯基活 化试剂）室温放置1小时，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集 蛋白峰；

（3）将（1）和（2）溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1 混合，室温放置3小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化， 收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保 存在4℃。

将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL， 使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。

酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠 1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g， 加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。

三底物溶液（酶促化学发光底物溶液）的制备

称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL 于1000mL烧杯中；量筒量取700mL纯化水于烧杯中，充分搅拌，直 至完全溶解，pH值调整到7.8；加入250mL发光底物鲁米诺 (Luminol-Phos)后，用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容 至1L，混匀后即得。

四稀释液的制备

称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中；用移液器将 Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解，倒入上述烧杯中；最 后定容1L，pH值调至7.2；待完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，贴 好标签于4℃冷库贮存（有效期1年）。

五缓冲液的制备

取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中，取0.2mL Proclin-300 于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L烧杯中；取800mL 纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调整pH到7.2； 称取阻断剂（优选Mak33）0.9g溶于上述溶液中；最后定容至1L， 完全溶解后，用0.2μm滤器过滤即得。

六校准品与质控品的制备

将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的 校准品与质控品。校准品浓度分别为1ng/mL，20ng/mL，100ng/mL， 200ng/mL，500ng/mL，1500ng/mL，质控品浓度分别为20ng/mL， 500ng/mL。

七清洗液的制备

称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中；称取5g吐 温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后，倒入烧杯中；用 移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全 溶解后，倒入烧杯中；用量筒量取800mL纯化水于烧杯中，充分搅拌， 直至完全溶解，溶液PH调至7.2；最后用纯化水定容1000mL，完 全溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。

Lp-PLA2定量检测试剂盒的制备实施例五：

一磁分离试剂（含有标记有抗Lp-PLA2单克隆抗体的磁性微球） 的制备

（1）0.1mol/L的pH5的MES溶液（2-（N-吗啉代）乙磺酸）制 备：

称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取 950mL纯化水溶解，pH调节至5.0；加纯化水定容到1L，采用孔径 0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

（2）取磁微粒(表面含“羧基COOH-”活性基团)100mg用戊二醛 活化，25℃混匀5小时，用0.1mol/L MES，pH5溶液10mL洗涤3次， 磁微粒用该溶液1mL重悬；加入2mg Lp-PLA2抗体，37℃混合均匀 5小时；之后加入等体积0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37° 封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS(pH7.4) 缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。

二酶反应物(含有碱性磷酸酶标记的抗Lp-PLA2单克隆抗体)的 制备

（1）将2.5mg抗Lp-PLA2抗体溶于0.01mol/L PBS PH7.4溶液 中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL， 20℃放置60分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置5分钟；通过 SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；每毫升活化的抗体溶液 中加入0.5mL0.05mol/mL DTT（二硫苏糖醇）0.01mol/L PBS PH7.4 溶液，混匀后，室温放置60分钟；通过SephadexG25柱子除去游离 的二硫苏糖醇，收集蛋白峰。

（2）将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCL  PH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mL Traunt试剂（巯基活 化试剂）室温放置1小时，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集 蛋白峰；

（3）将（1）和（2）溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1 混合，室温放置4小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化， 收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保 存在4℃。

将上述Lp-PLA2-ALP连接物用酶反应物稀释液稀释到1-5ug/mL， 使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。

酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠 1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g， 加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。

三底物溶液（酶促化学发光底物溶液）的制备

称取Tris2.4g、NaCl6.4g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2mL 于1000mL烧杯中；量筒量取700mL纯化水于烧杯中，充分搅拌，直 至完全溶解，pH值调整到8.2；加入250mL发光底物鲁米诺 (Luminol-Phos)后，用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容 至1L，混匀后即得。

四稀释液的制备

称取NaCl9.0g和BSA60g于1L的烧杯中；用移液器将 Proclin-300量取0.5mL加10mL纯化水溶解，倒入上述烧杯中；最 后定容1L，pH值调至7.6；待完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，贴 好标签于4℃冷库贮存（有效期1年）。

五缓冲液的制备

取Tris1.56g和NaCl4.24g于1L烧杯中，取0.2mL Proclin-300 于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L烧杯中；取800mL 纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调整pH到7.6； 称取阻断剂（优选Mak33）0.9g溶于上述溶液中；最后定容至1L， 完全溶解后，用0.2μm滤器过滤即得。

六校准品与质控品的制备

将高纯度Lp-PLA2抗原称重后用稀释液溶解分装制成Lp-PLA2的 校准品与质控品。校准品浓度分别为10ng/mL，30ng/mL，90ng/mL， 270ng/mL，810ng/mL，1620ng/mL，质控品浓度分别为30ng/mL， 810ng/mL。

七清洗液的制备

称取Tris12.5g和NaCl325.5g于1000mL烧杯中；称取5g吐 温20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后，倒入烧杯中；用 移液器将Proclin-300量取0.2mL于盛有10mL纯化水的烧杯中完全 溶解后，倒入烧杯中；用量筒量取800mL纯化水于烧杯中，充分搅拌， 直至完全溶解，溶液PH调至7.6；最后用纯化水定容1000mL，完 全溶解后用0.2μm孔径的过滤器过滤即得。

将本发明所得的Lp-PLA2定量检测试剂盒进行如下操作：

步骤一，加样与免疫反应

在试管中加入45μl LPPLA2待测样本、校准品和质控品，然后 依次加入60μL酶反应物、30μL磁分离试剂和60μL缓冲液。用多 管混匀器轻轻振荡1分钟后，37℃水浴30分钟；

步骤二，洗涤

反应试管放置在磁分离器上（所有试管都要求与磁分离器接触）， 使磁微粒在磁场中沉降2分钟，缓缓倒转分离器，倒去上清液，并除 去黏在管壁上的液滴。

步骤三，每支试管加入200μL清洗液，震荡30秒使磁微粒充 分混悬，再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液。

步骤四，重复步骤二和步骤三2次；

步骤五，加底物溶液

每管加入200μL底物溶液。37℃混匀后1分钟内检测；

步骤六，读值

在分光光度计或发光强度检测仪上读取吸光度或发光强度值。

检测结果：

以本试剂实施例1为例制备出脂蛋白相关磷脂酶A2定量试剂盒， 并以此检测200例盲样标本，得到以下试剂盒检测结果：

分析灵敏度：对20次零校准品的测定，取其2倍的平均偏差， 其在标准曲线上对应的浓度即为分析灵敏度；本发明试剂盒分析灵敏 度为0.1ng/mL。

精密性：同时评价批内和批间不精密度：每天做2个批次的测试， 每批测试时，对同一样品作双份测量，共做20天。评估结束时共有 40对，即80个测试结果。从40批次测量中双份结果的差值求出批 内精密度。从所有80个数据计算出批间精密度。

本发明试剂盒：批内精密度CV%≤10.0%；批间精密度CV%≤ 15.0%；

线性范围：取本试剂实施例1，每点重复检测3次，得出本试剂 盒标准曲线为：y=2.9931x-31.509,线性相关R²=0.9997。本发明试剂 盒线性范围为0.1-3500ng/mL。图1为Lp-PLA2校准曲线。

又以本试剂盒与市售酶联免疫法试剂盒分别检测同一批40例标 本，得出以下值，显示出了两者良好的相关性，见表1：

表140个样本ELISA法检测结果与本发明的检测结果对比

以上所述的仅是本发明的优选实施方案，对于本技术领城的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作为若干的改进和 调整，这些改进的调整也应视为本发明的保护范围。