多功能纳米颗粒设计和应用

摘要

本发明公开了用于装配和实施具有空芯和可密封孔的纳米颗粒的方法、结构、装置以及系统。在一方面，纳米颗粒装置可以包括壳结构和在中空内部区域内包含的物质，该壳结构包括至少两层，所述至少两层包括内层和外层，该内层被构造成封闭中空内部区域且包括一个或多个贯穿内层的孔，该外层为多孔材料且在内层周围形成并密封一个或多个孔，所述物质不能穿过该外层。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年4月14日提交的第61/475,649号美国临时专 利申请的优先权，前述专利申请的全部内容通过援引并入本文作为本申 请的公开的一部分。

关于联邦政府资助的研究或研发的声明

在国立卫生研究院所给予的政府支持下(批号CA119335)进行本发 明。政府对本发明拥有某些权利。

技术领域

本专利文件涉及纳米技术。

发明背景

纳米技术提供了用于装配以分子尺度或原子尺度为特征的结构、装 置和系统的技术或方法，例如在一些应用中的一纳米至数百纳米的结构。 例如，纳米尺度的装置可以配置为尺寸比人细胞小100倍至1,000倍，例 如，与一些诸如酶和受体的大生物学分子(生物分子)的尺寸相近。纳米尺 寸的材料用于创建纳米结构、纳米装置或纳米系统，其可以展现出以较 大尺寸按比例缩放的相同材料中不存在的多种独特形式，并且可以开发 此类性质以用于广泛的应用。

发明概述

描述了用于装配和实施纳米结构或纳米颗粒的技术、系统和装置， 所述纳米结构或纳米颗粒包括空芯和可密封孔。

在所公开的技术的一方面，装配颗粒的方法包括将芯颗粒与一个或 多个掩蔽颗粒组合以形成模板，其中一个或多个掩蔽颗粒与芯颗粒结合 并且覆盖芯颗粒表面的一个或多个区域，所述一个或多个区域中每一个 区域对应于一个或多个掩蔽颗粒中每一个掩蔽颗粒与芯颗粒之间所形成 的表面区域，在模板之上形成多孔材料层，其中该层形成在除已覆盖的 一个或多个区域之外的芯颗粒的表面之上，以及移除模板以产生由多孔 材料形成的颗粒，该颗粒具有一个或多个在中空的内部区域与颗粒的外 表面之间延伸的孔，所述一个或多个孔在外表面上具有基本为所述表面 区域尺寸的尺寸，并且分布在颗粒上的一个或多个区域。

实施可以任选地包括下列特征中的一个或多个。例如，方法还可以 包括将物质通过一个或多个孔装载入颗粒的内部区域，该物质不能穿过 多孔材料，以及在颗粒之上形成允许所选颗粒穿过的外部多孔层，其中 外部多孔层密封颗粒的一个或多个孔，从而将物质封闭在颗粒内。

在另一方面，用于运载负荷的纳米颗粒装置包括壳结构，该壳结构 包括至少两层，所述至少两层包括内层和外层，内层被构造为封闭中空 内部区域并且包括一个或多个贯穿内层的孔，外层在内层周围形成，其 中壳结构包括在中空内部区域内的物质，该物质已通过一个或多个孔进 入壳结构并且不能穿过外层。

在另一方面，纳米颗粒装置包括：壳结构，壳结构被构造为包括在 中空内部区域与壳结构的外表面之间延伸的一个或多个孔；以及至少一 个中心颗粒，其包含于内部区域内并具有比一个或多个孔中每一个孔的 尺寸更大的尺寸，其中一个或多个孔被构造为接收进入内部区域的物质， 并且该物质与至少一个中心颗粒结合。

在另一方面，装配颗粒的方法包括将芯颗粒与一个或多个掩蔽颗粒 组合以形成模板，其中一个或多个掩蔽颗粒与芯颗粒结合并且覆盖芯颗 粒表面的一个或多个区域，该一个或多个区域中每一个区域对应于在一 个或多个掩蔽颗粒中每一个掩蔽颗粒与芯颗粒之间所形成的表面区域， 在模板之上形成层，其中该层形成在除已覆盖的一个或多个区域之外的 芯颗粒的表面之上，以及移除模板以产生具有一个或多个在中空内部区 域与外表面之间延伸的孔的壳结构，该一个或多个孔在外表面上具有基 本为所述表面区域尺寸的尺寸，并且分布在壳结构上的一个或多个区域。

实施可以任选地包括下列特征中的一个或多个。例如，方法还可以 包括将物质通过一个或多个孔装载入壳结构的内部区域，并且在壳结构 之上形成外部层，其中外部层密封壳结构的一个或多个孔并且将所述物 质封闭在内部区域内。

在另一方面，纳米颗粒装置包括壳结构和物质，该壳结构包括至少 两层，所述至少两层包括内层和外层，内层被构造为封闭中空内部区域 并且包括一个或多个贯穿内层的孔，外层为多孔材料且在内层周围形成 并密封所述一个或多个孔，所述物质包含在空芯内部区域内且不能穿过 外层。

可以以特定方式实施本专利文件中所述的主题，所述方式提供了下 列特征中的一个或多个。例如，所公开的纳米和微观结构可以包括具有 中空内部的可密封孔的纳米颗粒，所述可密封孔可以封装在中空区域内 包含的其他物质。例如，示例的具有可密封孔的中空纳米颗粒还可以包 括允许所选颗粒或物质传输而不允许所封装的物质传输的孔隙。描述了 用于装配所公开的纳米颗粒(例如，示例的中空多孔纳米颗粒(HPNP))的 示例性方法，所述方法例如利用各种材料在纳米颗粒的尺寸和渗透性方 面提供精确的控制和柔韧性。所述的纳米和微观结构包括示例的特征， 包括例如高表征表面区域和能够装载物质的中空内部，这可使得实施能 用于广泛的应用，例如包括纳米医学、催化作用、光学、废弃物排除以 及诸多其他应用。所公开的纳米和微观结构可以应用于医疗诊断、监控 和治疗，例如前物-酶治疗、酶或基因递送以及传感器应用。示例性纳米 医学应用可以包括药物、生物分子和化学品的控制释放，生物分子和生 物活性物质的免疫分离和防护，建造光子晶体模块，以及废弃物质的排 除。例如，一个或多个大分子或大分子系统可以被封装在示例性HPNP 中，然后被密封，例如，形成密封的中空多孔纳米颗粒(SHPNP)，此后， 示例性大分子仍然可以与环境保持连通，例如，经由可通过SHPNP的孔 隙出入的小分子。

在一利用所公开技术的应用的实例中，封装在示例性SHPNP中的示 例性大分子可以为能够信号传导诸如pH变化的特定事件的发生的分子。 当环境中的pH改变时，可以通过示例性封装的大分子检测到pH变化， 例如，由于离子可以穿过示例性SHPNP的孔隙。例如，在这种配置中， 没有将用于检测pH变化的示例性大分子引导到环境中，因此不能激活任 何免疫反应。类似地，示例性SHPNP可以用于不同的应用，例如，其中 所封装的结构为酶。例如，酶可以被封装在SHPNP中并且用于激活药物 分子，例如酶一旦与药物分子结合就激活，否则就失活。使示例性酶在 示例性SHPNP内以免于免疫系统，并且示例性SHPNP的外部可以与靶 向剂结合以实现与环境内的靶位点特异性结合。一旦具有封装的酶的示 例性SHPNP被递送到靶位点(例如，肿瘤)，就可以将失活的药物引入到 有机体的血流中(例如，因为药物是失活的，所以没有药物剂量的限制)。 另外，例如，因为药物为小颗粒，因此它可以扩散到许多与靶位点有关 的区域。然而，只有在具有封装示例性酶的SHPNP的区域处才可以激活 药物，例如，该SHPNP可以靶向于特定位点或区域。因此，在这一实例 中，药物只有在靶位点被激活，例如，通过穿过SHPNP孔隙并且与封装 的酶相互作用(例如，激活药物)，然后通过SHPNP孔隙穿出以治疗肿瘤。 例如，经由所公开的纳米颗粒的药物递送可以用于提供稳定性、延长的 循环以及靶向。在其他实例中，封装的负荷可以包括负责激活某些机制 的蛋白、其他的纳米颗粒、和/或毒性物质，例如，其免于示例性SHPNP 所布置的生物环境。

附图简述

图1A-1C示出了例示示例性纳米颗粒合成方案的示意图。

图2A-2B示出了示例性纳米颗粒合成方案的流程图。

图3示出了示例性透射电子显微镜(TEM)图像，该图像示出示例性中 空多孔纳米颗粒的结构特性。

图4示出了扫描电子显微照相(SEM)图像，该图像展示了对示例性中 空纳米颗粒特征的合成自由度。

图5A和5B示出了示例性聚集体和所得中空多孔纳米颗粒的SEM图 像。

图5C示出了示例性未密封的和密封的中空多孔纳米颗粒的SEM图 像。

图6示出了利用所公开的密封的中空多孔纳米颗粒的示例性实施的 例示。

图7A和7B示出了示例性中空多孔纳米颗粒的SEM图像。

图8A-8I示出了示例性中空多孔二氧化硅纳米颗粒的电子显微图。

图9A-9D示出了用以创建密封的中空多孔纳米颗粒的示例性装配过 程的示意图。

图10A和10B示出了数据图，该数据图示出所公开的技术的密封的 中芯多孔纳米颗粒的活性。

图10C-10E示出了显示示例性纳米颗粒的电子显微图。

图11示出了展示所公开的技术的体内活性的图。

图12示出了数据图，该数据图示出与蛋白酶K孵育或不与蛋白酶K 孵育的游离蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)青霉素酶的活性。

图13示出了数据图，该数据图示出与蛋白酶K孵育或不与蛋白酶K 孵育的游离海肾(Renilla reniformis)荧光素酶的活性。

图14示出了数据图，该数据图示出蜡样芽孢杆菌青霉素酶活性的标 准曲线。

图15示出了数据图，该数据图示出与封装在密封的中空多孔纳米颗 粒内的蜡样芽孢杆菌青霉素酶比较，不同浓度的游离蜡样芽孢杆菌青霉 素酶的活性。

图16示出了数据图，该数据图示出海肾荧光素酶活性的标准曲线。

图17示出了数据图，该数据图示出与封装在密封的中空多孔纳米颗 粒内的海肾荧光素酶比较，不同浓度的游离海肾荧光素酶的活性。

图18A和18B示出了例示示例性金属纳米颗粒合成方案的示意图。

图18C示出了示例性中空多孔金纳米颗粒的图像。

图19示出了例示示例性纳米颗粒合成方案的示意图。

图20示出了例示示例性纳米颗粒合成方案的示意图。

各种图中相同的标号和命名指示相同的元素。

详细描述

诸如纳米颗粒的纳米结构可以用于运载作为负荷的化学或生物物质 (例如药物)并且被布置以用于在各种环境中递送所装载的物质，所述环境 包括生物环境，诸如有机体内。例如，布置在体内环境中的纳米结构载 体自身可以触发免疫反应和/或引起毒性问题，例如，这可以归因于纳米 颗粒载体材料和/或所装载的物质材料。在某些情况下，经由纳米颗粒的 药物递送系统可能需要所装载的物质的修饰，这可能降低所装载的物质 的所需功能。

描述了用于装配和实施包括空芯和可密封孔的纳米颗粒的技术、系 统和装置。

所公开的纳米颗粒和纳米颗粒系统可以包括基于中空纳米颗粒的载 体平台，所述载体平台能够封装和保护纳米颗粒内部区域内的物质，例 如通过可密封孔。例如，基于所公开的纳米颗粒的载体平台可以包括中 空多孔纳米颗粒，所述纳米颗粒能够封闭分子负荷，以使其在空芯内而 躲避免疫系统，同时允许所封闭的负荷在期望的环境中受控地相互作用， 例如，经由通向纳米颗粒内部区域的在表面上的孔隙。例如，示例性中 空多孔纳米颗粒可自身为生物相容的，但包裹非生物相容性负荷。例如， 将所公开的纳米颗粒和纳米颗粒系统用于某些应用的实施可以消除修饰 有效负荷物质的需要，当布置有机体中时避免触发不期望的免疫反应， 允许纳米颗粒的柔性表面功能化(例如用于靶向)，或延长纳米颗粒的循环 寿命(与所装载的物质无关)。还例如，所公开的纳米颗粒和纳米颗粒系统 还可以包括基于中空无孔纳米颗粒的载体平台，所述载体平台能够通过 可密封孔来封装和保护纳米颗粒内部区域内的物质并且将所封装的物质 释放入纳米颗粒所布置的环境中，例如，其中可密封孔可以溶解并且将 负荷释放到入所布置的环境中。在其他实例中，所公开的纳米颗粒和纳 米颗粒系统可以包括基于中空纳米颗粒的载体平台，所述载体平台能够 通过可密封孔来封装和保护纳米颗粒内部区域内的物质并且将所封装的 物质释放入纳米颗粒所布置的环境中，例如，其中纳米颗粒可以溶解并 且将负荷释放入所布置的环境中。

在一方面，所公开的技术包括装配技术，其可以用于创建具有可密 封孔和小孔隙(各自为可控尺寸)的纳米尺度结构(例如，诸如纳米笼或纳 米壳的颗粒)，例如，其中结构可以封装内部区域内所包含的其他物质。 描述了装配方法，其可以产生具有配置为可控尺寸的孔的中空多孔纳米 颗粒(HPNP)，例如所述可控尺寸可以允许其他的物质或颗粒(例如大分子) 进入到中空内部。所述的装配方法包括密封HPNP的孔的技术，例如， 形成密封的中空多孔纳米颗粒(SHPNP)，其可以封闭SHPNP内所装载的 物质或颗粒。例如，为装配HPNP，芯颗粒被用作起始模板材料，例如， 其可以为任何形状的形式，包括球体、圆锥、棒、长方体、管，以及其 他形状。掩蔽颗粒可以结合模板材料的外表面，例如通过分子间相互作 用。可以通过将涂覆材料应用到形成芯壳纳米颗粒的模板材料周围，从 而形成多孔壳。然后，可以去除芯和结合的掩蔽颗粒，例如通过溶解或 煅烧或其他类似方法，其中多孔外壳得到保留。这一过程的实施可以形 成中空多孔纳米颗粒，并且其他分子可以被封装在所产生的纳米颗粒的 内部之内。例如，所述的装配方法可以包括装载和完全密封孔的技术， 例如，一旦将示例性大分子封装在内部，则使多孔壳颗粒能够作为负荷 的载体。例如，不依赖于纳米颗粒尺寸的大小，可以调节孔的尺寸。例 如，所述的装配方法可以包括独立地调节孔隙尺寸的技术。

描述了基于示例性模板的技术，该技术可以使用各种材料(例如包括 聚合物、陶瓷和金属)来制备具有单分散尺寸的HPNP，例如，芯颗粒直 径范围从几十纳米到微米。基于示例性模板的技术可以用于沿着中空颗 粒壳产生可控尺寸的表面孔，例如，孔直径范围从几纳米到数十或数百 纳米。所述的装配技术可以提供HPNP渗透性的独立控制。例如，可以 通过控制壳材料的多孔性来配置HPNP的渗透性，例如，产生的孔隙的 尺寸范围可以从几纳米到数纳米(a few to several nanometers)。例如，纳米 孔隙尺寸可以导致大分子扩散入/出HPNP的相对较低的渗透性，例如， 避免酶、蛋白或较大的生物活性物质扩散穿过HPNP，但仍然允许较小的 物质扩散穿过孔隙。例如，描述了利用二氧化硅和金HPNP的示例性实 施，其例示了对颗粒尺寸和表面多孔性的精确控制。可以修改所述的装 配技术来产生不同材料的HPNP，例如，包括但不限于，基于钙的纳米颗 粒，诸如磷酸钙或钙涂覆的颗粒、氧化铁纳米颗粒，以及其他材料。例 如，装配不同材料的HPNP可以提供可适用于特定所需应用的HPNP性 质的设计。

示例性技术可以包括在具有不同化学和物理性质的表面上的胶体制 模反应(templating reaction)。例如，壳材料层在具有由较小的掩蔽胶体颗 粒所封闭的表面部分的胶体颗粒模板上生长。随后，通过诸如煅烧和/或 溶解的方法去除模板和掩蔽颗粒，从而留下在表面上具有开放的孔的中 空颗粒。例如，颗粒的总尺寸由模板颗粒来决定。例如，可以通过改变 掩蔽颗粒的尺寸来调节孔的直径，并且可以通过模板和掩蔽颗粒的相对 摩尔浓度来控制颗粒表面上的孔的数量。

所公开的技术包括用于装配具有空芯、多孔表面和可密封孔的纳米 颗粒的几个方案。图1A-1C示出了例示一示例性纳米颗粒合成方案的示 意图。

图1A示出了过程110的实例，其中掩蔽颗粒115与一个或多个芯或 模板颗粒111混合在一起。例如，掩蔽颗粒115可以是配置为具有表面 电荷、例如负表面电荷的纳米颗粒。例如，掩蔽颗粒115还可以包括具 有功能化外表面116的颗粒，例如具有表面电荷。例如，示例性掩蔽颗 粒115可以为聚苯乙烯纳米颗粒，并且示例性功能化表面116可以为羧 化功能层。例如，模板颗粒111可以是配置为具有与掩蔽颗粒115的表 面电荷的极性相反的表面电荷、例如正表面电荷的纳米颗粒。例如，模 板颗粒111还可以包括功能化外表面112。例如，示例性模板颗粒111可 以为聚苯乙烯纳米颗粒，并且示例性功能化表面112可以为胺功能层。 例如，一旦将示例性羧化掩蔽颗粒115与胺化模板颗粒111混合，则羧 化颗粒115可以与胺化模板颗粒111结合。

图1A还示出了例如通过静电相互作用来使具有羧化功能化表面116 的掩蔽颗粒115与模板颗粒111的胺化功能化表面112结合的过程120 的实例。例如，当示例性羧化颗粒115具有带负电荷的表面时，它们排 斥负离子并且阻止在它们表面上的溶胶凝胶反应，例如，封闭示例性胺 化模板颗粒111的外表面的某些带正电荷的区域。在其他实例中，过程 120可以包括通过其他颗粒吸引方式来使掩蔽颗粒115与模板颗粒111的 表面112结合，例如，所述颗粒吸引方式包括但不限于氢键、共价键、 磁吸引、疏水性相互作用等。

图1A还示出了将层131添加至掩蔽颗粒115—模板颗粒111复合体 的过程130的实例。例如，可以将溶胶凝胶试剂添加至包含与模板颗粒 111结合的掩蔽颗粒115的溶液。示例性溶胶凝胶反应可以只发生在沿着 模板颗粒111的表面112的带正电荷的区域中，例如没有被掩蔽颗粒115 覆盖或封闭的区域。例如，过程130可以用覆盖层131覆盖模板颗粒111 暴露的表面，而不覆盖存在掩蔽颗粒115的位置。例如，覆盖层131可 以为多孔的材料。例如，层131可以为一种材料(例如二氧化硅)，以使过 程130可以产生形成在模板颗粒111表面上的多孔层。例如，过程130 中的溶胶凝胶试剂的添加可以启动二氧化硅生长，例如根植于示例性胺 化功能化表面112的氨基。例如，覆盖层131还可以为无孔材料。在某 些实例中，过程130可以包括通过其他方式将层131添加至掩蔽颗粒115 —模板颗粒111复合体，例如所述方式包括但不限于基于材料的排他性、 或氧化还原化学，以及其他技术，所述氧化还原化学只在一颗粒(例如模 板颗粒111)的表面上而不在其他颗粒(例如掩蔽颗粒115)的表面上形成层 131。用作覆盖层的示例性材料可以包括多孔的或无孔的材料，或可降解 的材料(例如，其可以在某些环境中或在特定条件下或通过示例性触发而 溶解或降解，例如，条件和/或触发包括pH、温度、压力、分子相互作用、 或其他条件和/或触发)。

另外，图1A示出了例如通过移除模板颗粒111和掩蔽颗粒115而形 成中空纳米颗粒的过程140的实例。例如，一旦形成了具有期望厚度的 层131，则例如通过各种方法，包括通过溶剂将它们溶解、煅烧、熔融、 或燃烧、或这些方法或其他相似方法的组合来移除模板颗粒111和掩蔽 颗粒115。例如，过程140可以包括将二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、或其 他溶剂和/或热引入到层覆盖的掩蔽颗粒115—模板颗粒111复合体。例 如，过程140的实施产生了HPNP，所述HPNP包括具有孔145的空(empty) 的或中空的多孔壳141和空的或中空的内部142，例如，当层131由多孔 材料形成时。在某些实例中，可以实施过程140以形成中空无孔纳米颗 粒，例如，通过移除模板颗粒111和掩蔽颗粒115。例如，可以通过将示 例性无孔材料用作覆盖层131来实施过程130，从而形成中空无孔纳米颗 粒。在此类实例中，示例性壳141为中空无孔壳。

一旦创建了示例性HPNP，则它们可以装载有其他物质并且进行密封 以封装所装载的物质。

图1B示出了用于将负荷颗粒151装载入壳结构141的中空内部区域 142中的过程150的实例。例如，通过将高浓度的负荷物质的溶液添加至 壳结构的溶液，可以使壳结构(例如HPNP)的溶液装载有负荷物质。可以 通过几种方法之一来实施过程150。例如，负荷颗粒151可穿过孔145而 扩散入壳结构141中。在其他实例中，负荷颗粒151可通过包括例如电 泳力在内的非扩散方式穿过它们的孔145而进入壳结构141的内部区域 142。将各种类型的材料用作负荷，可以实施过程150以用于各种应用， 所述材料例如包括但不限于药物、生物可降解大分子、pH敏感分子、酶、 激素、和/或其他蛋白、糖蛋白、糖脂、碳水化合物、脂质、核酸、适配 子、金属、聚合物以及陶瓷颗粒。

在用负荷颗粒151装载壳结构141之后，可以密封孔145。图1C示 出了过程160和170，所述过程示出例如通过密封示例性HPNP141的孔 145而形成密封的中空多孔纳米颗粒175，其将负荷颗粒151封闭在中空 内部区域142内。在该实例中，可以用所示为层171的其他的多孔材料(例 如二氧化硅)层来密封孔145。在其他实例中，可以用其他的无孔材料层(例 如，金属层或其他无孔材料)(其也可以由层171表示)来密封孔145。

过程160可以包括用层161(例如，大的带正电荷的聚合物，诸如聚 -L-赖氨酸(PLL))部分地覆盖孔145。例如，PLL聚合物可以在示例性HPNP 141的表面和孔145之上创建网格状结构。过程170可以包括在示例性 HPNP141内密封负荷颗粒151以形成密封的中空多孔纳米颗粒175。例 如，过程170可以包括在示例性PLL覆盖的HPNP141之上形成层171。 例如，溶胶凝胶试剂的进一步添加可以在覆盖孔145的初始层(例如，层 161)的顶部上创建另一层(例如，层171)，例如，通过在示例性PLL聚合 物上的成核位点，由此形成示例性SHPNP175。例如，示例性负荷颗粒 151可以被永久地密封和封闭在示例性SHPNP175内部。在某些实例中， 在不实施过程160的情况下，可以实施过程170以形成示例性密封的中 空多孔纳米颗粒175，例如，通过直接在示例性壳结构141之上形成层 171。在某些实例中，将示例性无孔材料用作覆盖层131，通过实施过程 160和170，可以形成密封的中空无孔纳米颗粒。在此类实例中，示例性 壳141为中空无孔的壳(例如，具有在中空内部区域142内的负荷颗粒 151)，所述壳141可以覆盖有层161(例如，大的带正电荷的材料，在示 例性壳结构141和孔145之上形成网格状结构)，并且通过在示例性层161 覆盖的壳结构141之上形成层171，可以密封孔145(例如，将负荷颗粒 151封闭在示例性壳结构141内)，由此形成示例性密封的中空纳米颗粒 175。在该实例中，示例性密封的中空纳米颗粒175可以包括无孔层141 和多孔层171，例如，其中小的颗粒或物质可以进出示例性纳米颗粒175。 在此类实例中，在不实施过程160的情况下，还可以实施过程170以形 成示例性密封的中空纳米颗粒175，例如通过直接在示例性壳结构141(例 如，装载有在中空内部区域142内的负荷颗粒151)上形成层171。

例如，过程170可以包括可基于所需应用来确定用于层171的材料。 在某些实例中，示例性密封的中空纳米颗粒175可以包括多孔层141和 多孔层171。在其他实例中，示例性密封的中空纳米颗粒175可以包括无 孔层141和多孔层171。在其他实例中，示例性密封的中空纳米颗粒175 可以包括多孔层141和无孔层171。以及在其他实例中，示例性密封的中 空纳米颗粒175可以包括无孔层141和无孔层171。

示例性负荷颗粒151可以包括可降解的材料(例如，其在某些环境中 或在特定条件下或通过示例性触发而溶解或降解，例如条件和/或触发包 括pH、温度、压力、分子相互作用、或其他的条件和/或触发)。例如， 可以在特定环境中布置示例性密封的中空纳米颗粒175负荷颗粒151，其 中示例性负荷颗粒151(例如，为可降解材料)可以经受降解(例如，基于 特定环境的条件)并且通过示例性SHPNP175的孔隙而被释放到颗粒外， 或在某些实例中，与示例性密封的中空纳米颗粒175的降解相组合。

将具有氨基官能团的聚苯乙烯纳米颗粒用作示例性模板颗粒并且将 具有羧基官能团的聚苯乙烯纳米颗粒用作示例性掩蔽颗粒，可以实施图 1A所述的示例性装配过程。例如，氨基官能团为带正电荷的，并且可以 促进示例性装配过程中所用的化学过程。在某些实例中，示例性溶胶凝 胶试剂需要带正电荷的成核位点，可以通过胺化功能化表面来提供所述 成核位点。将诸如囊液(vesicular solution)、胶体、乳滴和聚合物的材料用 作模板以用于形成靶材料的层或其前体，可以实施示例性HPNP的装配。 例如，利用用作前体的硅酸，可以实施示例性装配过程。例如，硅酸向 溶液给予将带负电荷的含硅的离子。这些示例性带负电荷的离子被带正 电荷的模板纳米颗粒表面吸引。例如，可以将二氧化硅选作掩蔽的模板 表面之上的覆盖层材料；例如，二氧化硅的性质可包括可调节的多孔性、 热力和机械稳定性、低密度、高比表面积、以及生物可相容性和生物可 降解性，这些可为基于医学和生物学的应用中重要的性质。

装配示例性二氧化硅HPNP以用于所公开的技术的示例性实施。例 如，胺官能化的聚苯乙烯纳米颗粒(APNP)可以用作模板，该模板用于纳 米多孔二氧化硅溶胶凝胶网络的成核生长。例如，在水溶液中水解四甲 氧基硅烷(TMOS)，从而产生硅酸，其用作用于在颗粒表面上的缩聚反应 的前体。下列的示例性化学反应描述了硅酸的缩聚反应的起始阶段，产 生了二氧化硅层的生长。

Si(OCH₃)₄+4H₂O→Si(OH)₄+4HOCH₃+4OH^–

Si(OH)₄+OH^–→Si(OH)₃O^–+H₂O

Si(OH)₄+Si(OH)₃O^–→(HO)₃Si–O–Si(OH)₃+OH^–

例如，示例性装配过程可以包括在水溶液中将APNP与羧基官能化 聚苯乙烯乳胶纳米颗粒(CPNP)混合(例如，图1A的过程110所例示)。示 例性APNP和CPNP可以聚集在一起，例如，由于官能团的静电相互作 用(例如，图1A的过程120所例示)。例如，在溶液中，带有相反电荷的 表面官能团的示例性颗粒相互吸引。例如，与酸性羧基官能化表面比较， 胺官能化表面创建了更有效率的用于碱催化的硅胶生长的成核位点。在 接触点处，CPNP用作带负电荷的纳米掩模(nanomask)以用于在颗粒表面 上的溶胶凝胶反应。示例性装配过程可以包括将硅烷添加至待水解的溶 液并且产生硅酸，例如，其用作二氧化硅层的前体。例如，APNP上的碱 性胺基可以有效地模塑(template)硅胶生长，而CPNP上的酸性羧基可以 掩蔽与APNP的接触点的反应(例如，图1A的过程130所例示)。示例性 装配过程可以包括例如通过煅烧或溶解来去除APNP和CPNP。一旦形成 具有所需厚度的二氧化硅层，则通过溶解或煅烧来去除聚苯乙烯颗粒， 留下二氧化硅HPNP结构(例如，图1A的过程140所例示)。在某些实例 中，示例性装配过程可以包括利用涡旋混合和温和超声处理而在水中再 悬浮和分散HPNP。例如，煅烧后的最终颗粒直径可为初始500nm模板 APNP的直径的约85%，这可能与在加热或用无水溶剂的萃取期间，硅 胶羟基的部分脱水有关。

例如，可以实施装配过程以产生具有允许小分子通过的孔隙的二氧 化硅壳颗粒(例如，图1A中的HPNP141和图1C中的SHPNP175)。然 而，大的分子负荷(例如，图1C所示的负荷颗粒151)不能通过孔，因此 被密封在颗粒内。可存在能够基于所需应用的该示例性装配技术的其他 各种变体(图1A-1C中所述的)。例如，HPNP可由金属(例如金)形成，或 可存在形成HPNP的不同材料的多个或多个不同的层，例如，金属的第 一内层和聚合物的第二外层(例如二氧化硅)。可以由模板颗粒的尺寸来确 定颗粒的尺寸，并且可以由封闭或掩蔽颗粒的尺寸来确定孔的尺寸。可 以相互独立地配置所公开的中空多孔纳米颗粒的尺寸和它的孔的尺寸。 另外，可不依赖于HPNP的尺寸和它的孔的尺寸来配置HPNP的多孔性。

图2A-2B示出了示例性合成方案的流程图，所述合成方案产生了中 空多孔纳米颗粒和密封的中空多孔纳米颗粒。图2A示出了流程图200， 所述流程图200包括将纳米掩模颗粒结合于芯颗粒的过程201，在纳米掩 模结合的芯颗粒之上形成层的过程202，以及例如通过去除纳米掩模颗粒 和芯颗粒来形成包括孔的中空多孔壳颗粒的过程203。图2B示出了流程 图210，所述流程图210包括通过孔将分子或其他物质装载至中空多孔壳 颗粒的过程211和密封中空多孔壳颗粒的孔以在内部封闭所装载的分子 或其他物质的过程212。

所公开的技术的示例性装配方法独立地提供了对纳米多孔性和颗粒 直径的精确控制。例如，示例性装配方法可以应用于广泛的可通过溶胶 凝胶合成路线而获得的材料。另外，示例性装配方法可以应用于包括基 于金和氧化还原化学过程在内的不同化学过程，例如，将HPNP的适用 性扩展至广泛的应用。

例如，利用四甲氧基硅烷(TMOS)溶液来应用示例性装配方法，所述 四甲氧基硅烷获取自Aldrich-Sigma Ltd。示例性化学物质被原样使用(used  as received)。例如，胺官能化聚苯乙烯球获取自Polysciences,Inc，以及 羧基官能化聚苯乙烯乳胶颗粒获取自Life Technologies,Inc。

所公开的技术的示例性实施包括制备中空多孔二氧化硅纳米球。例 如，50μL模板颗粒溶液与相应量的掩蔽颗粒溶液混合以制备所需的颗粒 浓度比例。振荡所得的混合物过夜并且向溶液添加1000μL无水乙醇。 为了产生二氧化硅前体并启动二氧化硅生长，向溶液添加1000μL的四 甲氧基硅烷。振荡混合物过夜，并且通过离心分离(例如5分钟，14000rpm) 来收集悬浮颗粒，用去离子水洗涤数次，并在盖玻片上真空干燥过夜。 为除去有机化合物，将运载纳米颗粒粉末的盖玻片置于热板之上并且在 450℃下煅烧过夜。煅烧的粉末被转移至管，并且悬浮在水中(例如50μL) 并通过温和超声处理而分散。

所公开的技术的示例性实施包括制备密封的中空多孔二氧化硅纳米 球。例如，将4μL的10mg/mL酶溶液添加至50μL示例性中空多孔二 氧化硅纳米球溶液并孵育过夜。用1000μL磷酸盐缓冲盐水和50μL0.1% 的具有150-300kDa分子量的聚-L-赖氨酸稀释示例性溶液。例如，可以 稀释溶液以防止聚集。以74:500的体积比将TMOS添加至1mM HCl， 并且混合几分钟以产生硅酸溶液。在稀释后立即将25μL示例性硅酸溶 液添加至以上多孔二氧化硅纳米球溶液，并且振荡1小时，从而例如产 生密封的中空多孔二氧化硅纳米球。稍后，通过离心分离(例如，5分钟， 14000rpm)来收集悬浮的密封的中空多孔二氧化硅纳米球，并且用水洗涤 几次。在37℃下，以在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中为0.1mg/mL的 浓度，将样品暴露于蛋白酶-K酶过夜，随后通过离心分离(例如，5分钟， 14000rpm)，再用1X PBS连续洗涤以除去蛋白酶-K。所述的方案可以用 于有效负荷物质的封装。例如，示例性实施中所利用的有效负荷物质包 括青霉素酶和海肾(Renilla reniformis)荧光素酶，例如，其被封装在示例 性中空多孔二氧化硅纳米球内。

例如，来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的青霉素酶获取自 Sigma-Aldrich Co.LLC。CCF2-AM获取自Life Technologies,Inc.,San  Diego,California,USA。兔多克隆生物素化抗体获取自GeneTex,Inc.(San  Antonio,Texas,USA)。所有的荧光强度都在Infinite200Pro(TECAN, Switzerland)上测量。

所公开的技术的示例性实施包括中空二氧化硅纳米球的制备，其中 实施了与所述中空多孔二氧化硅纳米球的装配方案类似的装配方案，但 省略了纳米掩模。

所公开的技术的示例性实施包括用Cy5标记青霉素酶。例如，Cy5 马来酰亚胺被用作标记剂以用于例示所述方案的示例性实施。例如，以 10mg/mL浓度，将1mg青霉素酶溶解于100μL脱气的PBS缓冲液。例 如，在脱气的溶剂/缓冲液中，在氮气下进行硫醇修饰。将示例性溶液在 室温下保持30分钟左右。将约100摩尔的过量的TCEP添加至示例性溶 液。小瓶用氮气冲洗，加盖，彻底地混合。在室温下孵育该反应10分钟。 将100μg Cy5马来酰亚胺溶解在2μL二甲基甲酰胺(DMF)中，并将其添 加至酶溶液。小瓶再次用氮气冲洗，加盖，彻底地混合。在室温下孵育 该反应2小时，同时每隔30分钟进行混合。最终，将反应在2-8℃下保 持过夜。稍后，通过分子量截留为7kDa的脱盐柱来除去未结合的染料。

通过409nm的激发来测量在100%正常小鼠血清中的活性，作为蓝色 荧光(447nm)与绿色荧光(520nm)之比的增加的初始速率。

通过测量620nm激发和665nm发射的荧光强度来检测酶载量(例如 示例性Cy5标记的青霉素酶)。

以下列示例性方式测量抗体结合。例如，用生物素基团功能化抗青 霉素酶。将具有链霉亲和素的Alexa488染料添加至所有的样品，随后连 续的洗涤。在480nm激发和530nm发射处进行荧光强度测量。

所公开的技术的示例性实施包括体内活性测量，以下列示例性方式 制备和进行所述体内活性测量。例如，BALB/c小鼠用于示例性实施。例 如，用100μL海肾荧光素酶(RenLuc)酶肌内注射一小鼠，所述海肾荧光 素酶被密封的中空多孔二氧化硅纳米球溶液封装。以5.68×10¹²个颗粒/mL 浓度，将示例性密封的中空多孔二氧化硅纳米球悬浮在1X磷酸盐缓冲盐 水(PBS)中。例如，用100μL的8μg/mL浓度的游离RenLuc肌内注射其 他小鼠。游离RenLuc被悬浮在1X PBS中。5分钟后，将10μg苄基-腔 肠素(benzyl-coelenterazine)静脉给予入每一小鼠的侧面尾静脉中。将10 μg苄基-腔肠素溶解于95%酒精中，并用1X PBS稀释到酒精的最终浓度 为10%。给予小鼠异氟烷，并且通过2秒的暴露来测量静脉注射后的每 一小鼠的发光强度。

所公开的技术的示例性实施包括纳米结构的表征。例如，在 FEI/Philips XL30FEG ESEM上进行SEM测量，并且在10kV加速电压 的FEI SFEG UHR SEM(例如，在加州大学圣地亚哥分校，Calit2Nano3 设施)上进行超高分辨率(UHR)SEM测量。使用FEI Technai Sphera200kV (例如，加州大学圣地亚哥分校，冷冻电子显微镜)获取TEM图像。在200 kV下操作的日立HD-2000仪器用于扫描透射电子显微镜(STEM)图像。 来自Xenogen Corporation(Alameda,California)的IVIS成像系统200系列 (Imaging System200Series)用于体内发光测量。

描述了所进行的示例性实施，所述实施例示了利用所公开的技术的 装配技术，对示例性二氧化硅中空多孔纳米颗粒的颗粒直径、孔径和孔 浓度的精确控制。例如，所公开的装配技术的稳健性(robustness)和灵活 性提供了在许多领域的各种通用的和独特的应用中实施所装配的纳米颗 粒的能力。

图3展示了揭示所产生的孔的结构的高分辨率电子显微图。图3示 出了示例性透射电子显微镜(TEM)图像301、302、303和304，所述图像 展示了示例性HPNP的结构性质。例如，将500nm APNP用作模板颗粒 和将100nm CPNP用作掩蔽或封闭颗粒，可以产生示例性HPNP。图301 示出了示例性HPNP的表面特征的近貌图，例如，通过扫描透射电子显 微镜(STEM)的次级电子模式所采集的，所述近貌图揭示了在模板与掩蔽 颗粒的接触点处所形成的30±10nm孔的形成。图302示出了示例性 HPNP的TEM图像，所述TEM图像展示了孔结构和二氧化硅壳的厚度。 图303示出了SEM显微图，例如，用超高分辨率模式所采集的，所述SEM 显微图从内部视角示出了整个壳的开放孔结构和壳的厚度。图304示出 了宽场电子显微图，例如，通过STEM的透射模式所采集的，所述电子 显微图示出了示例性均匀HPNP的单分散性和均匀度。例如，图3的图 像示出了在两个颗粒之间的接触点周围完全防止二氧化硅的形成，并且 由所得颗粒的表面形貌来反映掩蔽CPNP表面的曲率。例如，利用500nm  APNP模板且TMOS与APNP重量比为3:1的示例性合成可以产生25nm 厚度的二氧化硅壳。该厚度可与产生稳定颗粒有关。

图4示出了扫描电子显微镜(SEM)图像401、402、403和404，所述 图像展示了对示例性HPNP特征的合成自由度。图401示出了示例性 HPNP表面，所述表面展示出约25-30个孔，例如通过利用500nm APNP 模板颗粒和100nm CPNP掩蔽颗粒且APNP与CPNP数量比为1:30而制 备的。图402示出了示例性HPNP表面，所述表面展示出约10-15个孔， 例如通过利用相同的模板和掩蔽颗粒且APNP与CPNP数量比为1:15而 制备的。图403示出了通过SEM所采集的利用500nm APNP和40nm  CPNP所获取的HPNP的显微图。图404示出了利用200nm APNP和40nm  CPNP所产生的HPNP的SEM图像。插图405示出了这些示例性颗粒的 更高分辨率的近貌TEM显微图，例如，其中示例性箭头表示在颗粒表面 上的孔。图401、402、403和404所示的示例性比例尺代表100nm，以 及插图405所示的示例性比例尺代表50nm。

所公开的装配程序可以包括在产生HPNP中的多重自由度。例如， 示例性装配过程可以包括控制表面上的孔的数量(例如，图402所例示 的)，孔的直径(例如，图403所例示的)和总颗粒尺寸(例如，图404所例 示的)。例如，通过APNP与CPNP的相对摩尔浓度可以控制表面上的孔 的平均数量。图401和402中的SEM显微图示出，当溶液中APNP与 CPNP摩尔比率分别为1:30和1:15时，表面上的孔分布。APNP与CPNP 的示例性摩尔比率可以产生约25-30个孔/颗粒(对1:30比率而言)和约 10-15个孔/颗粒(对1:15比率而言)。

例如，通过选择不同直径的掩蔽CPNP可以调节表面上所创建的孔 的尺寸(例如孔直径)，这与HPNP的总直径无关。图401所示的HPNP的 示例性孔尺寸包括30±6nm直径的孔，例如在500nm APNP上利用100 nm直径的CPNP所创建的。图402所示的HPNP的示例性孔尺寸包括20 ±3nm直径的孔洞，例如在500nm APNP上利用60nm直径的CPNP所 创建的。可以配置直径约20nm的示例性CPNP以产生具有直径为几纳 米的孔的HPNP。

例如，HPNP的总尺寸取决于模板颗粒尺寸。可以在广泛的尺寸范围 内，例如在约30nm至几个微米的范围内，配置示例性APNP以制备 HPNP。例如，模板移除后，由500nm APNP模板创建的HPNP可以收 缩约15%，例如，产生了430nm直径的HPNP(如图401中示例性HPNP 所示)。然而，例如，随着改变APNP模板颗粒尺寸，收缩的百分比不是 恒定的；在示例性实施中，通过利用200nm APNP和40nm CPNP所装 配的HPNP产生了150nm的总颗粒尺寸，这相当于煅烧后收缩了约25% (如图404中示例性HPNP所示)。例如，当使用较小的颗粒时，由脱水的 羟基与总二氧化硅体积的较高的相对体积比率可解释收缩增加。示例性 模板和掩蔽颗粒组合产生的孔为初始掩蔽颗粒直径的约25-35%，例如， 通过较小的尺寸而略微减少。例如，对较小的纳米掩模而言，略微的减 少可与增加表面曲率以产生更小的接触点有关。例如，150nm HPNP的 插图405中所示的更放大的且更高分辨率的TEM显微图包括指示在颗粒 表面上的孔的箭头。例如，在利用200nm APNP/40nm CPNP对所装配 的HPNP上所形成的孔的直径为12±2nm。

图5A示出了示例性聚集体的SEM图510，所述示例性聚集体是通 过500nm APNP作为模板颗粒和100nm CPNP作为掩蔽或封闭颗粒所形 成的。图5B示出了利用图510中颗粒框架的所得示例性HPNP的SEM 图520。图510和520所示的示例性比例尺代表200nm。

图5C示出了示例性未密封的HPNP(图531所示)和密封的中空多孔 的纳米颗粒(SHPNP)(图532所示)的SEM图像。图5C所示的示例性比 例尺代表100nm。

可以在各种应用中实施所公开的多孔纳米颗粒，所述应用包括不可 能通过任何其他方法的非常独特的应用。例如，非人源的酶可用于各种 治疗应用。然而，产生了针对这些异种蛋白的免疫反应、以及内吞细胞 器和新陈代谢清除的器官之内的蛋白水解，并且可以阻碍它们的治疗功 能。

在另一方面，所公开的技术可以包括基于多孔壳的纳米载体平台， 所述平台可以封装并保护来自于可能使货物的所需功能受损的抗体、蛋 白酶和其他生物分子的异种大分子货物(cargo)。所述的基于多孔壳的纳米 载体平台也可以称作HPNP。例如，基于多孔壳的纳米载体平台可以包括 能够高容量装载未修饰的大分子的包括孔(例如介孔)的中空球状纳米壳， 其中随后可以用纳米多孔材料密封所装载的颗粒，所述纳米多孔材料仍 然允许小分子易于扩散进出，但是阻止大分子进入或离开。基于所述的 密封多孔壳的纳米载体平台也可以称作SHPNP。

示例性SHPNP可以应用于体内医疗诊断、监测和治疗，例如酶-前 药治疗、酶替代治疗、基于肿瘤营养物的酶消耗的治疗以及体内生物传 感。例如，因为SHPNP可以被配置为薄的中空纳米壳，所以引入最少的 无机物质，同时使体内负荷容量最大。例如，可以实施所公开的SHPNP 以防止针对它们的异种酶货物的免疫反应并且使它们免于蛋白水解。在 该示例性实施中，SHPNP可以包括在它们表面上的纳米孔(例如<2nm直 径)，以使底物触及空芯内部内所封装的酶，与酶相互作用及被酶修饰， 以及扩散出(如图6所例示的)。

图6示出了示意图600，例示了所公开的密封中空多孔纳米颗粒的示 例性实施，所述纳米颗粒已装载了用于酶-前药治疗应用的酶货物。图600 示出了密封中空多孔纳米颗粒611，其将酶615封闭在它的中空内部内以 与前药分子616相互作用，相互作用发生在SHPNP611之内。例如，在 SHPNP611内部保护所封闭的酶615以例如免于免疫系统或SHPNP611 所布置的环境中的其他物质。例如，因为颗粒表面为多孔的，所以前药 分子616可以扩散入SHPNP611并且随后与酶615相互作用，例如，被 描述为前药-酶复合体617。例如，酶615可以用于激活前药分子616，例 如，否则其是失活的。前药-酶复合体617处的酶615与前药616之间的 相互作用可以导致激活的药物626的形成。激活的药物626可以从SHPNP 611扩散出并且随后与药物所要处理的靶标相互作用。

SHPNP611的示例性实施可以包括在活体中布置以用于治疗性药物 递送。例如，SHPNP611的外表面可以结合靶向剂，例如以能与环境内 的靶向位点特异性结合。例如，一旦将具有已封装的酶615的SHPNP611 递送到靶位点(例如肿瘤)，则可以将失活的药物(例如前药616)引入有机 体的血流中。尽管可以将前药616暴露在有机体内多个区域，但前药616 仅可以在具有示例性酶封装的SHPNP611的区域处被激活，例如，所述 前药616可以靶向于该特定位点或区域。因此，在该实例中，只在靶位 点处激活前药616，例如，通过穿过孔隙移动进入SHPNP611并且与封 装的酶615相互作用(例如激活前药616)，之后将激活的药物626通过孔 隙移动出SHPNP611以处理示例性肿瘤。

利用前述的和图1A-1C中所示的技术可以装配示例性SHPNP的装配 (例如图600所例示的)，例如，其包括高产率和可扩展的利用纳米掩模的 合成方法，阻止在部分壳表面上进行制模反应。例如，所述的装配技术 导致在HPNP和SHPNP中形成介孔(例如，范围为2-50nm)以用于有效 装载较大的分子，例如酶。例如，示例性HPNP可以由表面上带有介孔 的纳米多孔材料的壳制成，其允许大的生物分子扩散入颗粒的中空内部 空间。例如，一旦装载了目标大分子，则可以用纳米多孔壳材料(例如用 于形成HPNP的相同的材料)密封介孔，因此形成了负荷的SHPNP。

例如，还可以功能化示例性SHPNP的表面以用于靶向和改善的循环 半衰期。SHPNP的示例性另一功能化可以消除对所装载的物质进行任何 修饰的需要。例如，在这些条件下，可以递送隐匿的SHPNP到靶向区域 并且允许连续且可控的底物通路以与SHPNP的受保护的环境内的酶货物 相互作用，例如使它们成为用于体内酶递送的理想治疗平台以用于包括 癌症在内的疾病的前药治疗。

中空多孔纳米颗粒的示例性SEM图像示于图7A和7B中，例如， 其例示了所述HPNP合成技术的实施，例如先前图1A-1C中所述的。图 7A示出了聚集的APNP和CPNP的SEM图710。例如，CPNP与较大的 APNP混合，并且具有带相反电荷的表面官能团的CPNP和APNP在溶液 中相互吸引，引起聚集。图710例示了用于示例性HPNP合成技术的框 架，所述框架示出500nm APNP和100nm CPNP。例如，胺官能化表面 的碱性性质可以创建与酸性羧基官能化表面相比更有效率的用于碱催化 的硅胶生长的成核位点。例如，在接触点，CPNP用作用于在颗粒表面上 溶胶凝胶反应的带负电荷的纳米掩模。例如，一旦形成具有所需厚度的 二氧化硅层，则将聚苯乙烯颗粒移除，留下二氧化硅中空多孔纳米颗粒 结构。图7B示出了二氧化硅中空多孔纳米颗粒的SEM图720。例如， 图720所示的煅烧后的最终HPNP直径为初始500nm模板APNP(如图 710所示)的直径的约85%，例如这可能与在加热或用无水溶剂萃取期间 硅胶羟基的部分脱水有关。图710和720中的示例性比例尺代表200nm。

所述中空多孔纳米颗粒的结构特征示于图8A-8I中。图8A-8I包括由 500nm模板和100nm纳米掩模制成的二氧化硅HPNP的电子显微图。图 8A示出了电子显微图801，其揭示了用STEM的次级电子模式所采集的 示例性中空多孔纳米颗粒的表面形貌。例如，图801示出在两个颗粒之 间的接触点周围完全阻止二氧化硅形成以及掩蔽CPNP表面的曲率，其 可通过所得颗粒的表面形貌来反映。图8B示出了示例性HPNP的透射电 子显微图802。例如，利用500nm APNP模板且TMOS与APNP重量比 为3:1的示例性合成技术产生了25nm厚度的二氧化硅壳。该示例性厚度 可产生在该尺寸范围内的稳定的颗粒。图8C示出了示例性破裂的HPNP 的扫描电子显微图803，其从内部视角示出开放孔结构。图8D示出了用 STEM的透射模式所采集的电子显微图804，其示出示例性HPNP的单分 散性。

所公开的装配程序可以应用于广泛尺寸的具有不同特征的颗粒。例 如，HPNP的装配中3个自由度可以包括表面上的孔的数量、孔直径和总 颗粒尺寸。图8E示出了SEM图805，其示出由500nm模板和100nm 纳米掩模，例如，以1:30的特定数量比所形成的示例性HPNP。图8F示 出了SEM图806，其示出由500nm模板和100nm纳米掩模，例如，以 1:15的特定数量比所形成的示例性HPNP。例如，通过APNP与CPNP 的相对摩尔浓度可以控制表面上孔的平均数量。图8E和8F中的SEM显 微图示出，当溶液中APNP与CPNP摩尔比率分别为1:30和1:15时，表 面上的孔分布。这些比率可以产生约25-30个孔/颗粒(对1:30比率而言) (例如，如图8E所示)和约10-15个孔/颗粒(对1:15比率而言)(例如，如 图8F所示)。图8G示出了SEM图807，其示出由500nm模板和60nm 纳米掩模所形成的示例性HPNP。例如，可以通过选择具有不同直径的掩 蔽CPNP来调节表面上所创建的孔的大小，这与HPNP的总直径无关。 100nm掩蔽CPNP的使用可以产生30±4nm直径的孔(例如，图8E和 8F所示)，并且60nm掩蔽CPNP的使用可以在接触点处产生20±3nm 直径的孔(例如，图8G所示)。可以使用具有20nm直径的示例性CPNP， 例如，以高准确度来产生低至几个纳米的孔。

图8H示出了SEM图808，其示出由200nm模板和40nm纳米掩模 所形成的示例性HPNP。例如，可以基于模板颗粒尺寸配置HPNP的总尺 寸。例如模板移除后，可以使由500nm APNP模板所创建的示例性HPNP 表现出直径降低约15%，产生430nm直径的HPNP(如图8E-8G所示)。 然而，随着改变APNP模板颗粒尺寸，收缩的百分比不是恒定的；例如， 通过利用200nm APNP和40nm CPNP所产生的示例性HPNP产生150 nm的总颗粒尺寸，这相当于煅烧后收缩约25%(如图8H所示)。例如， 增加的收缩可归因于当使用较小的颗粒时表面羟基与总二氧化硅体积的 更高的相对体积比率。图808中示例性比例尺代表50nm。

进行的示例性实施示出模板和纳米掩模颗粒组合产生的孔(例如介孔) 为初始纳米掩模直径的约25-35%，例如，通过更小的尺寸而略微减少。 例如，对更小的纳米掩模而言，略微减少可与增加的表面曲率产生更小 的接触点有关。图8I示出了SEM图809，其示出150nm直径的示例性 HPNP。图809所示的示例性箭头表示表面上的孔。例如，孔的直径示出 为12±2nm，并且通过200nm APNP和40nm CPNP形成示例性HPNP。 图809中示例性比例尺代表50nm。

图9A-9D示出了SHPNP的示例性装配技术的示意图。图9A示出了 产生HPNP911的过程910，所述HPNP911包括中空内芯912和延伸穿 过HPNP911的外壳进入到中空内芯912的孔913(例如介孔)。例如，HPNP 911可以包括允许小分子进出HPNP911的小孔隙。例如，过程910可以 包括过程110、120、130和140的实施以产生HPNP911。图9B示出了 将酶925装载入HPNP911的过程920。例如，过程920可以包括将高浓 度的含酶925的溶液添加至含HPNP911的溶液(例如，其可以在HPNP 悬浮液中)。例如，过程920可以包括酶925，其通过扩散穿过孔913扩 散入HPNP911的中空内部912。例如，因为与酶比较，孔相对大，所以 酶925可以自由地快速扩散入结构中，使HPNP911内部和外部的浓度平 衡。在其他实例中，过程920可以使酶925通过电泳力穿过孔913而装 载入HPNP911的中空内部912。图9C示出了用层931部分覆盖孔913 和HPNP911表面的过程930。例如，过程930可以包括沉淀大的带正电 荷的聚合物，诸如PLL。例如，层931可以配置为PLL聚合物层，其可 以在HPNP911和孔913的表面之上创建网格状结构。图9D示出了将酶 925密封在HPNP911内以形成密封的中空多孔纳米颗粒945的过程940。 例如，过程940可以包括在层覆盖的HPNP911之上形成层941。例如， 溶胶凝胶反应物的进一步添加可以在覆盖孔913的初始层的顶部上创建 另一层(例如，层941)，例如，通过在示例性PLL聚合物上的成核位点， 由此将酶925封闭在SHPNP945内。

例如，在二氧化硅HPNP的情况下，HPNP911的表面由于SiO–基而 带负电荷。可以添加诸如PLL的带正电荷的聚合物以吸附至颗粒的表面 并且将表面电荷改变为正的。随后，可以添加TMOS以在表面上生长新 的二氧化硅层，例如，闭合HPNP911的孔(例如介孔)。该示例性反应可 以发生在接近中性的缓冲液环境中并且不会损害酶负荷。例如，一旦将 介孔闭合，则负荷被封装在SHPNP945内而不能逃离。然而，负荷仍可 以经由扩散穿过纳米孔与周围环境中的小分子相互作用。

该示例性能力可以用于提供多种益处。例如，示例性酶负荷避开免 疫系统，例如，因为抗体过大而不能穿过纳米孔以触及酶。例如，使示 例性酶负荷免于免疫系统且免于消化性酶，例如蛋白酶，而仍为完全活 性的。例如，可以用钝化和靶向配体覆盖示例性SHPNP，而无需任何有 效负荷、例如酶负载的化学修饰，从而为体内应用提供了有效的策略。

进行示例性实施以表征酶活性和所公开的SHPNP的保护能力。例如， 来自蜡样芽孢杆菌的青霉素酶为催化β-内酰胺环水解的β-内酰胺酶家族 的成员之一。在SHPNP的示例性表征实施中利用蜡样芽孢杆菌青霉素酶， 例如，因为对基于酶-前药的治疗，它可以被认为是优选的β-内酰胺酶， 并且灵敏的显色和荧光测定是可用的。例如，后者使用底物CCF2，其包 含经由头孢菌素基团而与荧光素连接的香豆素。例如在被青霉素酶分裂 之前，409nm处香豆素的激发引起向荧光素的有效的荧光共振能量转移 (FRET)，产生约520nm的绿色发射峰。例如，青霉素酶分裂头孢菌素基 团，将荧光素与香豆素分离并且干扰FRET，以至于相同的香豆素激发产 生蓝色的447nm发射。CCF2通常以乙酰氧基甲基(AM)酯形式使用，其 在啮齿类动物血浆和血清以及细胞内部中，当暴露于酯酶时迅速复原为 CCF2。

图10A和10B为示出所公开的技术的密封中空多孔纳米颗粒的酶活 性的示例性数据图。图10A示出了在正常血清中带有封装的青霉素酶 SHPNP与作为底物的CCF2-AM的活性比较的数据图1010。例如，表征 4个示例性样品，其包括为中空纳米壳的样品1，为HPNP的样品2，为 密封中空纳米壳的样品3以及为SHPNP的样品4。所有4个示例性样品 都与酶孵育，随后用1X PBS连续洗涤并且在用1X PBS连续洗涤后再用 蛋白酶-K洗涤。在酶孵育后，洗涤前，进行示例性样品3和4的示例性 密封反应。数据图1010所示的数据例示了封装在示例性SHPNP内的青 霉素酶(例如MW=28kDa)的活性。所有示例性样品都暴露于蛋白酶-K， 例如，其可以消化蛋白。因此，例如，暴露于蛋白酶-K后的封装的酶的 持续不变的活性证明了通过封装在SHPNP中而使所封装的酶抗蛋白水解 的保护作用(如稍后图12和13所示)。

例如，如图10A所示，数据图1010示出，示例性样品1和示例性样 品2没有表现出活性或表现出很少的活性，这在暴露于蛋白酶-K之后是 可预期的。例如，数据图1010示出了示例性样品3与示例性样品1相比 在活性方面有2倍增加，例如，这可以归因于在粘于表面的酶之上由二 氧化硅的第二层提供的保护，确认了额外的二氧化硅层的保护效应。然 而，为SHPNP的示例性样品4示出了活性显著的增加。例如，数据图1010 示出了SHPNP与示例性样品3相比在活性方面有10倍的增加，例如， 证明了增加并不归因于覆盖表面的酶而是归因于填满中空内部的酶分 子。示例性HPNP(样品2)和示例性SHPNP(样品4)之间所示的显著差异 进一步确认了这一发现，例如，因为这两个样品经历了相同的装配技术， 除了示例性样品4的额外的密封过程。

图10B示出了针对所封装的青霉素酶的多克隆抗体结合的活性比较 的数据图1020。数据图1020包括示例性红条1021，表示来自具有可使 抗体分子与生物素连接的链霉亲和素的Alexa488的荧光。数据图1020 包括示例性蓝条1022，表示来自Cy5标记的青霉素酶的荧光。例如，表 征3个示例性样品，其包括为空SHPNP的样品1，为中空二氧化硅壳的 样品2(其中青霉素酶被吸附在表面上)，为具有所封装的青霉素酶的 SHPNP的样品3。例如，示例性样品1和3都与蛋白酶-K孵育以移除任 何可能粘于表面的酶。洗涤所有3个示例性样品几次以除去未结合的酶。

图10B所示的示例性数据图1020可以用于评估示例性SHPNP中所 封装的酶的抗体通路。例如，用Cy5荧光标记青霉素酶并且用针对青霉 素酶的兔多克隆生物素化抗体探测它的可及性，例如通过Alexa488标记 的链霉亲和素检测。数据图1020示出了示例性样品1和3所测量的强度 为相当的(例如，在标准误差区间内)，例如，表示来自于示例性样品3的 轻微的荧光与抗体无关，而是来自Alexa488-链霉亲和素的非特异性吸附。 例如，示例性样品2示出了高约5倍的强度，例如，例示了与二氧化硅 表面上的酶分子的显著抗体结合。例如，数据图1020示出了没有来自于 示例性样品1的荧光，例如，由于缺少青霉素酶而是可预期的。例如， 数据图1020示出没有与示例性样品3的抗体结合，例如，尽管其具有最 高的青霉素酶含量，但这产生了对SHPNP内所封装的酶的抗体通路的防 止。

图10C-10E为示出示例性纳米颗粒的电子显微图。图10C示出了示 例性200nm中空无介孔纳米壳的图1030。图10D示出了由200nm模板 和40nm纳米掩模所形成的示例性HPNP的图1040。图10E示出了通过 密封HPNP所形成的示例性SHPNP(通过利用200nm模板和40nm纳米 掩模的装配方法所产生的)的图1050。图1030、1040和1050中示例性比 例尺代表100nm。

图11示出了展示BALB/c小鼠中海肾荧光素酶(RenLuc)的体内活性 的图1100。例如，以在先前实施中与青霉素酶相似的方式将示例性RenLuc 酶封装在200nm SHPNP中，例如包括用蛋白酶-K修整以除去任何表面 暴露的RenLuc。图1100中照亮的和发光的图片是重叠的。例如，用100 μL的浓度为5.68×10¹²个颗粒/mL的RenLuc酶封装的SHPNP溶液肌内 注射示例性BALB/c小鼠1101(图1100左侧所示)，随后，5分钟后，侧 面尾静脉注射10μg苄基-腔肠素。作为对照，用100μL的浓度为8μg/mK 的游离RenLuc酶肌内注射示例性小鼠1102(图1100的右侧所示)。这两 种示例性注射都展示了相似的体外活性(如稍后图16和17所示)。例如， 图1100中所获得的数据包括示例性程序，其中肌内注射后5分钟，在侧 面尾静脉中静脉给予10μg苄基-腔肠素。静脉注射后5分钟测量来自每 只小鼠的发光强度。来自于用RenLuc封装的SHPNP注射的小鼠的发光 强度测量为2.6×10⁵p/sec/cm²/sr，这表示SHPNP内封装的酶的局部活性， 而来自于用游离RenLuc注射的小鼠的强度低于检测极限。例如，来自于 后者的发光的缺失主要归因于游离酶扩散出注射位点。

图12示出了数据图1200，其示出在37℃下、于1X正常小鼠血清 中，与蛋白酶-K孵育12小时或不与蛋白酶-K孵育12小时的游离蜡样芽 胞杆菌青霉素酶的活性图。例如，5μM CCF2-AM被用作底物，并且通 过409nm激发，在100%正常小鼠血清中测量活性，作为蓝色荧光(447nm) 与绿色荧光(520nm)之比的初始增加速率。数据图1200包括不与蛋白酶 -K孵育的游离蜡样芽胞杆菌青霉素酶的绘图数据1201和与蛋白酶-K孵 育的游离蜡样芽胞杆菌青霉素酶的绘图数据1202。

图13示出了数据图1300，其示出在37℃下、于1X正常的小鼠血 清中，与蛋白酶-K孵育12小时或不与蛋白酶-K孵育12小时的游离海肾 荧光素酶的活性图。例如，每一反应为100μL，总计含有10μg/mL苄基 -腔肠素作为底物。数据图1300包括与蛋白酶-K孵育的游离海肾荧光素 酶的绘图数据1301和不与蛋白酶-K孵育的游离海肾荧光素酶的绘图数 据1302。

图14示出了数据图1400，其示出蜡样芽胞杆菌青霉素酶活性的标准 曲线。例如，头孢硝噻测定中吸光度的初始增加速率代表数据图1400的 纵轴。

图15示出了数据图1500，其示出与以1.42×10¹²个颗粒/mL浓度而 封装在密封中空多孔纳米颗粒内的蜡样芽胞杆菌青霉素酶相比，不同浓 度的游离蜡样芽胞杆菌青霉素酶的活性绘图。例如，每一反应为100μL， 总计含有250μg/mL头孢硝噻作为底物，并且在486nm处测量吸光度。 例如，数据图1500示出包括0mg/mL(曲线1501)、0.1mg/mL(曲线1502)、 0.02mg/mL(曲线1503)、0.004mg/mL(曲线1504)和0.0008mg/mL(曲线 1505)的浓度的青霉素酶活性，并且示出1.42×10¹²个SHPNP/mL(曲线 1506)。

例如，与封装在SHPNP内的蜡样芽胞杆菌青霉素酶的所测量的活性 相比，游离蜡样芽胞杆菌青霉素酶的标准曲线(数据图1400所示)对应于 来自于单一200nm SHPNP的4.58×10-¹⁴个国际单位(IU)，例如基于HPNP 合成产率为100%时约50个酶分子/颗粒。例如，酶负荷期间，最初用26.4 μM孵育HPNP。例如，单一SHPNP内的酶的测定浓度可以对应于19.5 μM，例如，产生74%的表观负荷效率。可能影响该百分比的示例性因素 包括以下几个方面。例如，HPNP合成的产率可小于100%，产生了不能 被密封但仍被计为SHPNP的破碎的HPNP。例如，在用于二氧化硅缩聚 反应的稀释期间，可能有一些酶从颗粒泄漏出去。例如，底物向酶的通 路可能受限于底物穿过多孔壳的扩散。例如，通过密封反应期间酶溶液 的浓度，颗粒内的酶浓度可为可调节的。

图16示出了数据图1600，其示出海肾荧光素酶活性的标准曲线。由 于与苄基-肠腔素相互作用所产生的发光强度代表数据图1600的纵轴。

图17示出了数据图1700，其示出与以1.42×10¹²个颗粒/mL浓度封 装在密封的中空多孔纳米颗粒内的海肾荧光素酶相比，不同浓度的海肾 荧光素酶的活性图。例如，每一反应为100μL，总计含有10μg/mL苄基 -肠腔素作为底物。数据图1700示出了包括0.0008mg/mL(曲线1701)、 0.0004mg/mL(曲线1702)、0.0002mg/mL(曲线1703)、0.0001mg/mL(曲 线1704)和0mg/mL(曲线1705)的浓度的海肾荧光素酶活性，并且示出了 1.42×10¹²个SHPNP/mL(曲线1706)。

所公开的SHPNP例示了用于封装诸如酶的功能性生物分子的平台， 所述平台作用于可以穿过SHPNP的小尺寸孔隙而自由地扩散进出的小分 子底物。可以大规模的制造具有严格控制的尺寸和特性的所公开的 SHPNP，并且酶可以保存在免受来自其他生物分子的任何特异性或非特 异性干扰的受控环境中。所公开的SHPNP的示例性实施例示了所封装的 酶维持它们的活性并有效地被庇护以免于抗体或蛋白酶，例如，因为壳 的孔隙比抗体、蛋白酶或此类分子更小。而且，例如，SHPNP的表面修 饰可以增强体内循环和靶向，例如，在所封装的有效负荷上不需要任何 修饰。所公开的技术提供了具有颗粒大小控制和渗透性的所述SHPNP的 灵活的装配技术，并且对特定负荷和底物，可以修整和优化所公开的 SHPNP。

在另一方面，所公开的技术可以包括用于装配具有空芯、多孔表面 和可密封孔的金属纳米颗粒的装配方案。图18A和18B示出了例示一示 例性金属纳米颗粒合成方案的示意图。

图18A示出了例如通过静电吸引将具有功能化表面1816(例如，羧 化表面)的掩蔽颗粒1815与模板芯颗粒1811的功能化表面1812(例如， 胺化表面)结合的过程1820。例如，因为示例性羧化颗粒1815具有带负 电荷的表面，所以它们排斥负离子并且阻止在它们表面上的溶胶凝胶反 应，例如，封闭示例性胺化模板颗粒1811的外表面的某些带正电荷的区 域。

图18A示出了将胶体金属层1831(例如，胶体金)添加至掩蔽颗粒 1815—模板芯颗粒1811复合体的过程1830。例如，可以将溶胶凝胶试剂 添加至含有与模板颗粒结合的掩蔽颗粒的溶液。示例性溶胶凝胶反应可 以发生在沿着模板芯颗粒1811的表面1812的带正电荷的区域中，例如， 未被掩蔽颗粒1815覆盖或封闭的区域，形成示例性胶体金层1831。

图18A示出了使初始层1831增厚成厚层1841的过程1840。例如， 初始层1831可以由胶体金形成，所述胶体金通过过程1830中的溶胶凝 胶反应而产生。示例性胶体金层1831可以用作进一步生长金的成核位点， 例如，形成厚层1841。例如，过程1840可以包括添加金酸和甲醛作为还 原剂以用于形成示例性厚金层1841。

图18A示出了过程1850，其示出形成中空多孔纳米颗粒，例如，通 过移除模板颗粒1811和掩蔽颗粒1815。例如，一旦形成具有所需厚度的 层1841，则将模板和掩蔽颗粒移除，例如，通过各种方法，包括通过溶 剂将它们溶解、煅烧、熔融或燃烧，或这些或其他相似方法的组合。例 如，过程1850的实施产生了金属HPNP(例如金HPNP)，其包括具有孔 1855的空的或中空的多孔壳1841和空的或中空的内部1852。

一旦创建了示例性金属HPNP，则它们可以装载有其他物质，并且被 密封以封装所述其他物质，例如，通过实施以前所述的和图1B和1C中 例示的方法。例如，图18B示出了将负荷颗粒1861装载入金属HPNP1841 的中空内部区域1852的过程1860。例如，通过将负荷物质的高浓度溶液 添加至金属HPNP的溶液，可以使金属HPNP的溶液装载有负荷物质。 通过几个方法之一可以实施过程1860。在一实例中，负荷颗粒1861可以 通过孔1855扩散入金属HPNP1841。在其他实例中，负荷颗粒1861可 以通过包括例如电泳力在内的非扩散方式穿过它们的孔1855而进入金属 HPNP1841的内部区域1852。将各种类型的材料用作负荷，可以实施过 程1860以用于各种应用，例如，所述材料包括但不限于药物、生物可降 解大分子、pH敏感分子、酶和/或其他蛋白、脂质、金属、聚合物以及陶 瓷颗粒。例如，继过程1860的实施之后，可以密封金属HPNP1841以形 成密封的金属HPNP(金属SHPNP)，例如，通过实施以前所述的和图1C 中所示的过程170。图18C示出了图1890，其示出在500nm脂肪族-胺 聚苯乙烯芯萃取之前的示例性金HPNP。

在另一方面，所公开的技术可以包括用于装配具有空芯内的一个或 多个内部颗粒、多孔表面和可密封孔的纳米颗粒的装配方案。图19示出 了例示一示例性纳米颗粒合成方案的示意图。

图19示出了将具有功能化表面1916(例如羧化表面)的掩蔽颗粒 1915与模板芯颗粒1911的功能化表面1912(例如胺化表面)结合的过程 1920，所述模板颗粒1911具有至少一个内部颗粒1913。例如，模板颗粒 1911可以为至少一个内部颗粒1913的外覆盖层，或模板颗粒1911可以 为中空颗粒，所述空芯颗粒在其中空内部之内封闭至少一个内部颗粒 1913。例如，过程1920可以包括将掩蔽颗粒1915与模板颗粒1911的表 面1912结合，通过静电相互作用或通过例如包括但不限于氢键、共价键、 磁性吸引、疏水性相互作用等的方式。例如，因为示例性羧化颗粒1915 具有带负电荷的表面，它们排斥负离子并且阻止在它们表面上的溶胶凝 胶反应，例如封闭示例性胺化模板颗粒1911的外表面的某些带正电荷的 区域。

图19示出了将层1931(例如二氧化硅)添加至掩蔽颗粒1915—模板 芯颗粒1911复合体的过程1930。例如，可以将溶胶凝胶试剂添加至含有 与模板颗粒结合的掩蔽颗粒的溶液。示例性溶胶凝胶反应可以发生在沿 着模板芯颗粒1911的表面1912的带正电荷的区域中，例如，未被掩蔽 颗粒1915覆盖或封闭的区域，形成示例性层1931。

图19示出了例如通过移除模板颗粒1911和掩蔽颗粒1915形成在内 部区域1942内包括内部颗粒1913的中空多孔纳米颗粒的过程1940。例 如，一旦形成具有所需厚度的层1931，则将模板和掩蔽颗粒移除，例如， 通过各种方法，包括通过溶剂将它们溶解、煅烧、熔融或燃烧，或这些 或其他相似方法的组合。例如，过程1940的实施产生了包括多孔壳1941 和的孔1945的HPNP，所述多孔壳1941包括在其中空内部区域1942中 的内部颗粒1913，所述孔1945遍及多孔壳1941而分布，例如基于掩蔽 颗粒1915与模板颗粒1911结合的最初位置。

一旦创建了包括至少一个内部颗粒的示例性HPNP，则可以使它们装 载有其他物质并被密封以封装所述其他物质，例如，通过实施以前所述 的和图1B和1C中例示的方法。例如，图19示出了将负荷颗粒1951装 载入HPNP1941的中空内部区域1942的过程1950。例如，通过将负荷 物质的高浓度溶液添加至示例性HPNP的溶液，可以用负荷物质装载包 括所封闭的内部颗粒的示例性HPNP的溶液。通过几个方法之一可以实 施过程1950。在一实例中，负荷颗粒1951可以通过孔1945扩散入HPNP 1941。在其他实例中，负荷颗粒1951可以通过包括例如电泳力在内非扩 散方式穿过它们的孔1945而进入HPNP1941的内部区域1942。将各种 类型的材料用作负荷，可以实施过程1950以用于各种应用，例如，所述 材料包括但不限于药物、生物可降解大分子、pH敏感分子、酶和/或其他 蛋白、脂质、金属、聚合物以及陶瓷颗粒。例如，在HPNP1941的内部 区域1942内，示例性负荷颗粒1951可以与内部颗粒1913相互作用，例 如，形成修饰的内部颗粒1955。例如，示例性负荷颗粒1951可以结合于 内部颗粒1913的外表面，或在其他实例中，示例性负荷颗粒1951可以 化学地与内部颗粒1913相互作用。例如，修饰的内部颗粒1955可以展 示出在内部颗粒1913上的新的性质，这以其他方式则不能得到。

在另一方面，所公开的技术可以包括用于装配具有带有空芯的一个 孔的纳米颗粒的装配方案，例如，其中孔可以为可密封的。图20示出了 例示一示例性纳米颗粒合成方案的示意图。

图20示出了过程2010的实例，其中大的掩蔽颗粒2015与芯模板颗 粒2011混合在一起。例如，大的掩蔽颗粒2015可以是配置为具有表面 电荷、例如负表面电荷的纳米颗粒。例如，大的掩蔽颗粒2015还可以包 括带有功能化外表面2016、例如具有表面电荷的颗粒。例如，示例性掩 蔽颗粒2015可为聚苯乙烯纳米颗粒，并且示例性功能化表面2016可为 羧化功能化层。例如，模板颗粒2011可以是配置为具有与掩蔽颗粒2015 的表面电荷的极性相反的表面电荷、例如正表面电荷的纳米颗粒。例如， 模板颗粒2011还可以包括带有功能化外表面2012的颗粒。例如，示例 性模板颗粒2011可以为聚苯乙烯纳米颗粒，并且示例性功能化表面2012 可为胺功能化层。例如，一旦将示例性羧化掩蔽颗粒2015与胺化模板颗 粒2011混合，则羧化颗粒2015可以与胺化模板颗粒2011结合。

图20也示出了例如通过静电相互作用将具有羧化功能化表面2016 的大的掩蔽颗粒2015与模板颗粒2011的胺化功能化表面2012结合的过 程2020的实例。在其他实例中，过程2020可以包括通过其他颗粒吸引 方式将大的掩蔽颗粒2015与模板颗粒2011的表面2012结合，所述颗粒 吸引方式例如包括但不限于氢键、共价键、磁吸引、疏水性相互作用等。

图20还示出了将层2031添加至模板颗粒2011的过程2030的实例。 例如，可以将溶胶凝胶试剂添加至含有与模板颗粒2011结合的掩蔽颗粒 2015的溶液。示例性溶胶凝胶反应可以发生在沿着模板颗粒2011的表面 2012的带正电荷的区域中，例如，未被掩蔽颗粒2015覆盖或封闭的区域。 例如，过程2030可以用覆盖层2031覆盖模板颗粒2011的暴露的表面， 而不覆盖存在掩蔽颗粒2015的位置。例如，覆盖层2031可为多孔材料。 例如，层2031可为一种材料(例如二氧化硅)以使过程2030可以产生在模 板颗粒2011的表面上形成的多孔层。例如，过程2030中的溶胶凝胶的 添加可以启动二氧化硅生长，例如根植于示例性胺化功能化表面2012的 氨基。例如，覆盖层2031还可以为无孔材料。在某些实例中，过程2030 可以包括通过其他方式将层2031添加至模板颗粒2011，例如所述其他方 式包括但不限于基于材料的排他性、或氧化还原化学过程，以及其他技 术，所述氧化还原化学过程仅在一颗粒(例如模板颗粒2011)的表面上而不 在其他颗粒(例如掩蔽颗粒2015)的表面上形成层2031。用作覆盖层的示 例性材料可以包括多孔的或无孔的材料，或可降解的材料(例如，其在某 些环境中或在特定条件下或通过示例性触发而可以溶解或降解，例如条 件和/或触发包括pH、温度、压力、分子相互作用、或其他条件和/或触 发)。

另外，图20示出了例如通过移除模板颗粒2011和掩蔽颗粒2015而 形成中空纳米颗粒的过程2040的实例。例如，一旦形成了具有所需厚度 的层2031，则例如通过各种方法，包括通过溶剂将它们溶解、煅烧、熔 融、或燃烧、或这些方法或其他相似方法的组合，移除模板颗粒2011和 掩蔽颗粒2015。例如，过程2040的实施产生了中空纳米颗粒，其包括带 有孔2045的空的或中空的多孔壳2041和中空内部2042。在某些实例中， 可以实施过程2040以形成中空无孔纳米颗粒，例如，当层2031为多孔 材料时。在其他实例中，可以实施过程2040以形成中空无孔纳米颗粒， 例如，当层2031为无孔材料时。一旦形成了示例性中空壳结构，则其可 以装载有其他物质并被密封以封装所述其他物质，例如，通过实施以前 所述的和图1B和1C中所例示的方法。

所述纳米颗粒平台的应用可以至少包括以下方面。例如，比孔隙更 大的大分子可以穿过表面上的孔而扩散到纳米颗粒内，并稍后可以被逐 渐地释放。例如，一旦大分子穿过孔而扩散到纳米颗粒内部，则可以将 孔密封。因为颗粒表面为多孔的，因此小的分子可以扩散进出，从而提 供了大分子与外部环境的连通且同时保护环境免于大分子或保护大分子 免于环境。例如，颗粒内部的大分子可以用作报告环境中某些事件的传 感器而不被暴露于环境。例如，一旦大分子扩散到颗粒内，则可以用具 有特定性质(例如降解性质)的分子密封孔。例如，可以利用特定性质，并 且可以释放封装在颗粒内的大分子。例如，密封在HPNP内的大分子可 以包括特定性质，诸如与足够小到穿过孔隙的分子反应。例如，大分子 可以为用于激活小的药物分子的酶分子。因为示例性酶分子被封装在颗 粒内，所以它避免了免疫系统。例如，HPNP的表面可以由靶向剂功能化， 例如，用于有效的布置和递送到靶区域。例如，可以分别将失活的药物 引入循环。因为示例性药物不为激活的，所以药物不会有剂量限制。例 如，一旦示例性未激活的药物与酶负荷的HPNP在体内的靶区域中相遇， 则药物可以扩散到HPNP内并且通过酶而变成激活的；并且激活的药物 可以扩散出HPNP达到靶区域，例如，由此只影响靶区域。

虽然本专利文件包含许多细节，但这些不应该被解释为对任何发明 范围的或所要求的范围的限制，而是解释为对特定发明的特定实施方案 的具体特征的描述。也可以在单个实施方案中组合地实施本专利文献的 单独实施方案中所述的某些特征。相反地，也可以在多个实施方案中分 别地或以任何适合的亚组合来实施单个实施方案中所述的各种特性。而 且，尽管以上所述的特性为在某些实施方案中发挥作用，甚至一开始就 要求如此，但来自所要求的组合的一个或多个特性可以在某些情况下从 组合中被剔除，并且所要求的组合可涉及亚组合或亚组合变体。

相似地，虽然在附图中以特定顺序描述了操作，但这不应该理解为 必须以所示特定顺序或先后次序进行此类操作，或必须进行所有例示的 操作来获得所需的结果。而且，以上所述实施方案中的各种系统组件的 分离不应该理解为在所有实施方案中必须此类分离。

只描述了很少的实施和实例，并且基于本专利文件所描述的和所例 示的内容可以进行其他实施、改善和变化。