快速检测恶喹酸的试纸条及制备方法

摘要

本发明公开了一种快速检测恶喹酸的试纸条及其制备方法，该试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗恶喹酸多克隆抗体或单克隆抗体；在纤维素膜层上设有偶联恶喹酸的载体蛋白印制的检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹。本发明的试纸条结构简单，特异性强，灵敏度和准确度高，操作简便，适用范围广，价格低廉，易于推广应用，具有较好的社会和经济价值。

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留的免疫学检测领域，特别是涉及一种检测恶喹酸残留的免疫胶体金试纸条及制备方法。 

背景技术

恶喹酸（Oxolinic Acid，简称OA），别名奥索利酸，分子式为C₁₃H₁₁NO₅，分子量为261.23，属广谱类抗菌药物，特别是对革兰氏阴性菌有很强的抗菌活性，用量少，抗菌效果好，是治疗水生动物疾病的理想农药物之一。恶喹酸通常为白色或类白色的结晶性粉末，无臭无味，不溶于水和乙醇，能溶于甲酸和氢氧化钠溶液，不吸潮，对光、热稳定。但其对人体有一定毒副作用，常见的主要包括胃肠道反应、肝肾毒性以及肌肉骨骼副作用等，美国和日本禁用恶喹酸；欧盟和我国对其在牛、猪、鸡和鱼等肉类中的最高限量规定为50-300 μg/kg。尽管我国兽药残留限量参照国际和发达国家标准制定，并且兽药使用都有休药期规定，但从根本上解决动物性食品兽药残留超标问题仍存在较大难度。因此急需研究建立快速、灵敏、有效的恶喹酸残留的检测方法。 

目前国内外检测恶喹酸残留的方法主要采用理化分析方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱/质谱联用分析法（LC/MS）、气相色谱/质谱联用分析法（GC/MS）等，这些方法检测均存在一定缺陷：（1）待检测样品预处理过程复杂，繁琐费时；（2）需要昂贵的仪器设备，推广使用受到一定限制；（3）对专业人员的素质要求高，须有一定相关经验才能获得可靠结果；（4）仪器保养要求高，保养的好坏直接影响分析结果的准确性；（5）检测费用高；（6）无法进行现场检测和大规模批量检测，且时效性较差。免疫学检测法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度较高，精确性好，分析过程相对简单，用作恶喹酸的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术，急待研究解决。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：克服现有技术存在的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便、精准快速的用于检测恶喹酸残留的试纸条及制备方法。 

本发明的技术方案： 

一种快速检测恶喹酸的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗恶喹酸多克隆抗体或单克隆抗体；在纤维素膜层上设有偶联恶喹酸的载体蛋白印制的检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹。

所述偶联恶喹酸的载体蛋白是通过以下方法得到的： 

称取恶喹酸12mg溶入1mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温条件下加10μL三丁胺混匀，再加10μL氯甲酸异丁酯磁力搅拌反应3h，然后加入含20mg 载体蛋白的PBS溶液，搅拌反应过夜；反应液用PBS透析3天，4000r/min离心5min，弃沉淀，得到恶喹酸的载体蛋白偶联物，分装并保存于-20℃，备用。

所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。 

所述吸附纤维层用聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维棉或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体纤维层用吸附恶喹酸的金标抗体玻璃纤维棉制成。 

所述 偶联恶喹酸的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。 

所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“︱︱”直线式印迹、“十十”字型排列印迹、“┬ ┬”字型排列印迹、“┴ ┴”字型排列印迹、“├├”字型排列印迹或“┤┤”字型排列印迹。 

在所述吸附纤维层、金标抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧0.3-0.6cm处印制有样品标记线。 

所述恶喹酸的试纸条的制备方法，包括以下步骤： 

（1）偶联恶喹酸载体蛋白的制备

将恶喹酸12mg溶入1mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温条件下加10μL三丁胺混匀，再加10μL氯甲酸异丁酯磁力搅拌反应3h，然后加入含20mg 载体蛋白的PBS溶液，搅拌反应过夜；用PBS透析3天，4000r/min离心5min，弃沉淀，得到恶喹酸的载体蛋白偶联物；

（2）抗恶喹酸单克隆抗体或多克隆抗体的制备；

（3）恶喹酸金标抗体的制备；

（4）羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体的制备；

用所得的恶喹酸载体蛋白偶联物在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体在纤维素膜层上制备对照印迹；恶喹酸金标抗体用于制备金标抗体纤维层，然后依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。

本发明的试纸条具有以下优点： 

 特异性强，灵敏度高。本发明试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率，同时具有较强的特异性和较高的灵敏度，可检测到50 ng/g的微量恶喹酸。 

 简便、快速。使用本发明试纸条，可现场操作。只需将试纸条插入被检样品中10～20秒钟，取出后5分钟内即可判定检测结果。 

 结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示棕红色“︱”（或“十”、“┬”、“┴”、“├”、“┤”）印迹作为检测结果阳性和阴性标记，即在纤维素膜层上显示一条棕红色“︱”印迹，表示被检样品中含有恶喹酸，显示两条棕红色“︱︱”印迹，表示被检样品中不含恶喹酸。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。 

 节省费用。使用检测试纸条，无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检测，费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备费用。 

 适用范围广，便于推广应用。操作简便，能满足不同层次人员的需要，该试纸条具有广阔的市场前景和明显的经济效益以及社会效益。 

⑥ 存储方便，保质期长。检测试纸条存储方便，且其对存储温度要求不高，在4-8℃下有效期可保持一年，室温下有效保质期可达到六个月。 

附图说明

图1为本发明试纸条的俯视结构示意图。 

图2为图1试纸条的侧面结构示意图。 

图中，1为支撑层，2为吸附纤维层，3为金标抗体纤维层，4为纤维素膜层，5为吸水材料层，6为检测印迹，7为对照印迹，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为样品标记线。 

具体实施方式

实施例一：快速检测微量恶喹酸的试纸条及制备方法，参见图1、图2。图中支撑层1用塑胶薄片条制成，吸附纤维层2用玻璃纤维棉制成，金标抗体纤维层3上吸附有抗恶喹酸的单克隆抗体，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜制成，吸水材料层5用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从右至左依次粘贴固定在支撑层1上，彼此交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上设有检测印迹6和对照印迹7，检测印迹用偶联恶喹酸的牛血清白蛋白（BSA）溶液印制而成，对照印迹用兔抗小鼠IgG抗体印迹制成，两条印迹平行排列形成印迹带“︱︱”。8-1为覆盖在吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面的测试端保护膜（白色），8-2为覆盖在吸水材料层5上面的手柄端保护膜（如黄色），9为样品标记线，即在吸附纤维层2与金标抗体纤维层3交界处，对应的白色保护膜偏向吸附纤维层2一侧约0.5cm处印制的标记线，在样品标记线右侧的保护膜上印有箭头及max字样。 

待测样品溶液的制备及检测步骤： 

检测鸡肌肉：将样品切成块，捣碎，然后进行离心，4000r/min离心5min，吸取上层汁液作为待测样品；

操作方法：将试纸条测试端插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出试纸条，水平放置，5分钟内观察并判定检测结果。

结果判定：(a)阳性 如果在纤维素膜层上显示一条棕红色印迹带“︱”，表示检测结果为阳性，说明待测样品含有恶喹酸；(b)阴性 如果在纤维素膜层上显示两条棕红色印迹带“︱︱”，检测结果为阴性，说明待测样品中不含恶喹酸；(c)失效 如果在纤维素膜层上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。 

本发明试纸条的敏感性和检测限检测：共配制8个浓度为0、50、100、200、400、800、1600和3200μg/L的恶喹酸标准溶液，按照检测试纸操作要求进行检测，每个浓度设6个重复，根据试验结果判断检测试纸的敏感性和检测限。试验结果表明，本试纸条的检测限为50ng/g。 

要制成快速检测微量恶喹酸试纸条，首先制备偶联恶喹酸载体蛋白和恶喹酸金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维层；其次制备羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体，用于制备对照印迹。 

（1）恶喹酸的载体蛋白偶联物抗原的制备 

采用混合酸酐法，将恶喹酸与载体蛋白进行偶联，制备人工结合抗原。

称取恶喹酸12 mg溶入1 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，室温条件下加10 μL三丁胺混匀，再加10 μL氯甲酸异丁酯，磁力搅拌反应3 h，然后加入含20 mg 载体蛋白BSA（或者载体蛋白OVA、KLH）的PBS溶液，搅拌反应过夜；用PBS透析3天，4000r/min离心5min，弃沉淀，得到恶喹酸的载体蛋白偶联物，分装并保存于-20℃，备用。 

（2）抗恶喹酸单克隆抗体或多克隆抗体的制备 

单抗制备：用制备的恶喹酸载体蛋白偶联物以30μg～50μg/只的用量免疫6～8周龄Balb/C小鼠3～4次，每次免疫间隔时间3～5周，确定抗体效价符合要求后进行超强免疫，并在融合之前检测其抑制价，之后3～4天将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75%的酒精浸泡小鼠5～10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞。将1×10⁸的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7～1.0mL的50%的PEG4000，1min内加完，前30秒加0.1～0.3mL，中间15秒加0.2～0.4mL，最后15秒加完；然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10 min，1000rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板中（8～10块），100μL～200μL/孔，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养。培养10～14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3～6次有限稀释克隆化（直到细胞克隆为单克隆，检测各个克隆孔效价、抑制价基本一致），而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与恶喹酸反应，亲和力常数达到10¹⁰-10¹²，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃，针对恶喹酸特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。

多抗制备：用恶喹酸载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为200μg～500μg/次，背部皮下分4～6点注射。首免，用无菌PBS溶解制备的恶喹酸载体蛋白偶联物，与等量弗氏完全佐剂（FCA）混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解恶喹酸载体蛋白偶联物，与等量弗氏不完全佐剂（FIA）混合，充分乳化，首免后2～3周进行，连续免疫4～5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到10⁵以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS（pH7.2）混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS（pH7.2）溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS（pH7.2）溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS（pH7.2）透析48～72h，中间换液数次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，得纯化的抗恶喹酸多克隆抗体，-20℃冻存，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。 

（3）恶喹酸金标抗体和金标抗体玻璃纤维棉的制备 

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液。在沸腾的200mL 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1％柠檬酸钠8mL，获得直径约15nm的胶体金溶液，用0.1mol/L 的K₂CO₃调节pH值至8.5～9.5，置于2～8℃保存备用。以1：2000的标记比将待标记的恶喹酸单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加入20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得恶喹酸胶体金标记抗体。将1：100～1：500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，4℃低温真空干燥，制备恶喹酸金标抗体玻璃纤维棉。

（4）羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体的制备 

以饱和硫酸铵提取恶喹酸阴性小鼠血清IgG（或阴性兔血清IgG）用于恶喹酸快速检测试纸条对照印迹的制备（方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述）。

（5）试纸条的检测反应原理 

当恶喹酸试纸条的测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测恶喹酸及金标抗体玻璃纤维棉中的金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待测恶喹酸可与金标抗体纤维层中的金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上恶喹酸的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上偶联恶喹酸载体蛋白的检测印迹结合，试纸条上无法显示检测印迹，而羊或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体则可与金标抗体结合，形成棕红色对照印迹带“︱”，即一条棕红色带“︱”印迹为阳性表示。反之样品溶液中若无恶喹酸，则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联恶喹酸载体蛋白的检测印迹结合，试纸条显示棕红色检测印迹带“︱”；同样羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体也能与金标抗体结合，显示棕红色对照印迹带“︱”，形成两条棕红色带“︱︱”为阴性表示。如果纤维素膜上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。

实施例二：试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：金标抗体纤维层吸附有抗恶喹酸的多克隆抗体，吸附纤维层用尼龙膜制成，纤维素膜层采用纯纤维素膜，检测印迹带和隐形对照印迹带均为“十”，覆盖在吸水材料层上面的手柄端保护膜为兰色。      

待测样品为鸡肝，将样品切成块，捣碎，然后进行离心，4000r/min离心5min，吸取上层汁液作为待测样品；

结果判定：(a)阳性 如果在纤维素膜上显示有一条棕红色印迹带“十”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有恶喹酸；(b)阴性 如果在纤维素膜上显示有两条棕红色印迹带“十”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含恶喹酸；(c)失效 如果在纤维素膜上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。

操作和制备方法同实施例一，不重述。 

实施例三：试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：吸附纤维层用聚偏二氟乙烯膜（PVDF）制成，偶联恶喹酸载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白(OVA)，隐形对照印迹带用兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上印迹制成，纤维素膜层采用羧化纤维素膜，覆盖在吸水材料层上面的手柄端保护膜为绿色，检测印迹带和隐形对照印迹带均为“┬”。 

结果判定：（a）阳性 如果在纤维素膜上显示有一条棕红色印迹带“┬”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有恶喹酸；（b）阴性 如果在纤维素膜上显示有两条棕红色印迹带“┬”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含恶喹酸；（c）失效 如果在纤维素膜上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。操作和制备方法同实施例一，不重述。 

实施例四：试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：吸附纤维层用聚酯膜制成，纤维素膜层采用羧化纤维素膜，偶联恶喹酸载体蛋白溶液为血蓝蛋白（KLH）。检测印迹带和隐形对照印迹带均为“┴”。制备方法、操作和结果判定方法同实施例一，不重述。 

实施例五：试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：隐形对照印迹带用羊抗兔IgG抗体溶液在纤维素膜上印迹制成，吸附纤维层用尼龙膜制成。检测印迹带和隐形对照印迹带均为“├”。制备方法、结果判定和操作方法同实施例一，不重述。 

实施例六：和实施例一基本相同，不同之处在于：恶喹酸金标抗体纤维层吸附有抗恶喹酸多克隆抗体，检测样品为鸡肝。检测印迹带和隐形对照印迹带均为“┤”。 

实施例七：和实施例一基本相同，不同之处在于：恶喹酸金标抗体纤维层吸附有抗恶喹酸多克隆抗体，检测样品为鸡肌肉。 

实施例八：和实施例一基本相同，不同之处在于：恶喹酸金标抗体纤维层吸附有抗恶喹酸多克隆抗体，检测样品为鸡肝。 

实施例九：和实施例一基本相同，不同之处在于：偶联恶喹酸载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白（OVA），检测样品、结果判定和操作方法同实施例一。 

实施例十：和实施例一基本相同，不同之处在于：偶联恶喹酸载体蛋白溶液为血蓝蛋白（KLH），检测样品、结果判定和操作方法同实施例一。