一种不对称草酰胺桥联三核铜配合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种不对称草酰胺桥联三核铜配合物及其制备方法和应用，所述配合物由由二价铜与不对称草酰胺配体H3bdeox、高氯酸根以及1,10-邻菲罗啉生成，所述配位聚合物为三金属中心结构，其分子结构式为:[Cu3(bdeox)(phen)3(H2O)](ClO4)3?H2O，其中，Cu为二价铜离子，H3bdeox为N-(2-羧基苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺。本发明不对称草酰胺桥联三核铜配合物合成原料易得，成本低，产品以晶体形式析出，纯度大，产率高，而且，该配位聚合物在自然状态下能稳定存在，并具有较好的水溶性和脂溶性；另外，本发明配位聚合物对于肝癌和淋巴性白血病等多种癌细胞均呈现出优良的抑制作用，作用谱广，应用范围广泛。

说明书

技术领域

本发明属于配合物技术领域，具体涉及一种不对称草酰胺桥联三核铜配合物及其制 备方法和应用。

背景技术

铜是一种重要的微量元素，在细胞形成过程中起到重要作用，参与人体多种酶和重 要生命激素活动，与骨骼发育，中枢神经正常代谢密切相关。近年来铜配合物因其核酸 酶活性引起国内外学者极大兴趣，其中含有芳环结构的铜配合物不仅可以抑制DNA和RNA 多聚核酸酶的活性，在过氧化氢和氧气等氧化剂存在条件下还可诱导DNA断裂，甚至有 些配合物在没有氧化剂催化条件下，也可诱导DNA断裂，表现出强烈的核酸酶功能。铜 通常是通过参与氧化代谢，抑制自由基形成发挥其抗肿瘤作用，有关研究表明，铜缺乏 与胃癌、鼻咽癌和肝癌的发病率有关。德国学者在上世纪初就开始研究使用铜配合物治 疗患有面部癌症的病人，并起到了很好的效果。后续研究中发现皮下和静脉注射铜盐可 以软化或消除抑制在小鼠体内的癌瘤。最近，美国科学家的研究表明，通过服用适量铜 络合物来治疗实体瘤会明显抑制肿瘤生长和转移，提高生存几率，然而，迄今为止，尚 没有铜配合物作为抗癌药物用于临床。

发明内容

本发明的目的是提供一种不对称草酰胺桥联三核铜配合物及其制备方法和应用，本 发明所述配合物可以用于制备治疗癌症的药物，具有良好的应用前景。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种不对称草酰胺桥联三核铜配合物，它由二价铜与不对称草酰胺配体H₃bdeox、高 氯酸根以及1,10-邻菲罗啉生成，所述配位聚合物为三金属中心结构，其分子结构式为: [Cu₃(bdeox)(phen)₃(H₂O)](ClO₄)₃·H₂O，其中，Cu为二价铜离子，H₃bdeox为N-(2-羧基 苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺，phen为1,10-邻菲罗啉，晶体结构如下：

所述的配合物的制备方法，它包括以下步骤：

(1)、将N-(2-羧基苯胺基)草酰乙酯溶于四氢呋喃/乙醇混合溶液中，将其逐滴加入到 二乙撑三胺的四氢呋喃/乙醇混合溶液，在冰浴中搅拌反应，直至有大量的白色固体生成， 抽滤，洗涤，真空干燥，得到白色固体粉末即N-(2-羧基苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺；

(2)、将所述N-(2-羧基苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺溶于甲醇溶液，搅拌下，滴加 哌啶的甲醇溶液，滴加完毕反应30分钟，继续滴加入高氯酸铜甲醇溶液，搅拌反应后， 加入1,10-邻菲罗啉甲醇溶液，继续反应至反应完全，将反应体系冷却到室温后，常压过 滤，滤液在室温下静置，得到绿色块状晶体。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中N-(2-羧基苯胺基)草酰乙酯与二乙撑 三胺摩尔用量比为1∶1.2-1.6。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中四氢呋喃/乙醇的体积比v∶v=1∶1，洗 涤用溶液依次为无水乙醇和无水乙醚。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中在冰浴中继续搅拌反应6小时。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(2)中所选二价铜盐为高氯酸铜，所述反应 物N-(2-羧基苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺：哌啶：高氯酸铜：1,10-邻菲罗啉的摩尔用 量比为1∶3∶3∶3。

对上述技术方案的进一步改进：所述二价铜盐选择Cu(ClO₄)₂·6H₂O或CuCl₂， Cu(NO₃)₂。

本发明还提供了所述的配合物在制备用于预防和治疗肿瘤的药物中的应用。

所述配合物对DNA有切割能力。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明通过实验证实，本发明不对 称草酰胺桥联三核铜配合物对于肝癌以及淋巴性白血病等癌症的细胞具有很好的生长抑 制作用，对其机理探讨发现，其作用靶点为DNA，与DNA作用模式为插入式结合，可 以广泛用于制备预防和治疗这些癌症的药物。

本发明含有芳环结构的不对称草酰胺配位聚合物与DNA相互作用时选择性高，靶向 性强，这一结构特征对于以DNA为作用靶点的抗肿瘤化合物表现为更高的抗肿瘤活性。

本发明不对称草酰胺桥联三核铜配合物合成原料易得，成本低，产品以晶体形式析 出，纯度大，产率高，而且，该配位聚合物在自然状态下能稳定存在，并具有较好的水 溶性和脂溶性；另外，本发明配位聚合物对于肝癌和淋巴性白血病等多种癌细胞均呈现 出优良的抑制作用，作用谱广，应用范围广泛。

附图说明

图1为本发明配位聚合物的红外光谱图。

图2为本发明配位聚合物的X-衍射单晶结构图

图3为Tris-HCl缓冲溶液中不同浓度的HS-DNA存在下的紫外光谱变化，插入图表为为 配合物的[DNA]/(εa-εf)～[DNA]关系。

图4为pBR322DNA与不同浓度的三核铜配合物在pH7.40，37℃恒温反应2h的琼脂 糖凝胶电泳图，其中泳道Lane0:DNA control；Lane1:DNA+DMSO；Lane2-6，配合 物浓度(DMSO)：(2)6.25；(3)12.5；(4)25；(5)50；(6)100uM。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

本发明所述不对称草酰胺异金属一维配位聚合物的制备方法包括以下步骤：

一、不对称草酰胺配体N-(2-羧基苯)-N'-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺的制备

草酰胺配体N-(2-羧基苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺（H₃bdeox）的制备方法如下： 称取10mmol N-(2-羧基苯胺基)草酰乙酯，溶于10mL四氢呋喃/乙醇(v∶v=1∶1)混合溶液 中，于0℃搅拌下，将其逐滴加入到10mL含有14mmol二乙撑三胺的四氢呋喃/乙醇（v∶v =1∶1）混合溶液中。加完后，在冰浴中继续搅拌反应6小时，有大量的白色固体生成。 抽滤，依次用无水乙醇、无水乙醚洗涤滤饼多次，室温下真空干燥，得到白色固体粉末 即N-(2-羧基苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺。

所述溶液选择，反应溶液为四氢呋喃/乙醇(v∶v=1∶1)混合溶液，洗涤溶液依次为无水 乙醇、无水乙醚。

所述反应条件冰浴，N-(2-羧基苯胺基)草酰乙酯与二乙撑三胺摩尔用量比为1∶ 1.2-1.6。

二、不对称草酰胺桥联三核铜配合物的制备

本发明所述配合物的制备方法为：室温搅拌下，将0.05mmol N-(2-羧基苯)-N’-[(2- 氨乙基)乙基]草酰胺溶于5mL甲醇溶液，搅拌下，向N-(2-羧基苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基] 草酰胺甲醇溶液中滴加0.75mL0.2mmol/mL哌啶的甲醇溶液，滴加完毕反应30分钟， 继续逐滴加入5mL含0.15mmol Cu(ClO₄)₂·6H₂O的甲醇溶液到上述哌啶的甲醇溶液和 H₃bdeox的甲醇溶液中，在60℃下搅拌30分钟后，再向上述反应液中滴入含0.1mmol 邻菲啰啉的5mL甲醇溶液，此时反应体系的颜色很快变为绿色。继续搅拌反应6小时。 常压过滤，得到无色澄清的绿色溶液。滤液在室温下静置一周后，得到绿色块状晶体。 元素分析理论值：C，43.37；H，3.19；N，10.32%.；实测值：C，43.31；H，3.17；N， 10.35%。

铜盐选择Cu(ClO₄)₂·6H₂O，溶液为甲醇溶液。

制得的本发明终产物三核铜配合物为不对称草酰胺桥联结构，配位聚合物为三金属 中心结构。其分子结构式为:[Cu₃(bdeox)(phen)₃(H₂O)](ClO₄)₃·H₂O，其中，Cu为二价铜离 子，H₃bdeox为N-(2-羧基苯)-N’-[(2-氨乙基)乙基]草酰胺，phen为1,10-邻菲罗啉，H₂O 为水，ClO₄—为高氯酸根。

红外光谱与X-衍射单晶结构图分别如图1和图2所示。

图1红外分析：1667cm^-1处的强吸收峰可认为是草酰胺配体分子中羰基ν_C=O的伸缩振 动吸收^[32]，与自由配体的ν_C=O伸缩振动峰(1676cm^-1)相比，形成配合物后此特征峰向低波 数移动。配合物在1518cm^-1处较强的吸收峰，可归属为菲啰啉的ν_C=N振动吸收。此外在 1086cm^-1处(反对称伸缩)未分裂的宽带和623cm^-1处的锐带(反对称弯曲)表明非配位的高 氯酸根离子的存在。这与X-射线单晶衍射分析的结果一致。

图2X-衍射单晶结构图：配合物的晶体结构中包含一个结晶的水分子，三个未配位 的高氯酸根以及由反式不对称草酰胺桥联的三核铜(II)阳离子 [Cu₃(bdeox)(_phen)₃(H₂O)]³⁺。

如图2所示，将含N5、N6原子的菲啰啉分子称为p1，将含N7、N8原子菲啰啉分 子称为p2，将含N9、N10原子的菲啰啉分子称为p3。如图所示。Cu1和Cu2均处于N₃O₂的变形四方锥配位环境中而Cu3则处于N₄O的变形四方锥配位环境中。Cu1原子的配位 底面由草酰胺上的氧原子(O3)和氮原子(N2、N3、N4)组成。而轴向被水分子上的氧原子 (O5)所占据。Cu2原子的配位底面由草酰胺上的两个氧原子(O1、O4)，一个氮原子(N1) 和邻菲啰啉分子P1上的一个氮原子(N6)组成。而轴向位置则被来自相同邻菲啰啉分子 P1上的氮原子(N5)占据。Cu3原子的配位底面由来自草酰胺上的羧基氧原子(O2)和邻菲 啰啉分子P2上的两个氮原子(N9、N10)以及邻菲啰啉分子P3的氮原子(N7)组成。而轴向 则被来自邻菲啰啉分子P3的氮原子(N8)占据。

草酰胺桥联配体以反式桥联的方式与Cu1、Cu2及Cu3螯合。其中Cu1与草酰胺形 成了三个五元金属螯合环，其螯合角分别为83.3(2)°、83.0(3)°、86.9(3)°。其中二乙撑三 胺参与形成的两个五元螯合环具有不同的褶皱参数，含N2，N3原子的螯合环的褶皱参 数为Q=0.436(69)φ=112.1(9)°。而含N3，N4原子的螯合环为的褶皱参数为Q= 0.474(9)φ=271.3(8)°。而对于Cu2，则与草酰胺形成了一个五元环及一个六元环，其 螯合角分别为85.3(2)°、88.4(2)°。其中六元环的褶皱参数为Q=0.423(6)φ=154.9(9)° andθ=-0.179(7)°。对于Cu3，草酰胺配体通过羧基上的氧原子将其与Cu1、Cu2原子相 连，Cu3-O2的键长为2.038(5)配合物三个Cu原子通过草酰胺桥基之间的距离分别 为5.212(3)(Cu1...Cu2)，4.590(8)(Cu2...Cu3)和8.781(5)(Cu1...Cu3)。

配合物中含有三个1，10-邻菲啰啉分子p1、p2和p3，且均采取双齿配位模式。其 中p1通过N5、N6与Cu2配位后，与Cu2原子螯合形成一个螯合角为80.5(3)°的五元环。 该五元环的褶皱参数为Q=0.130(6)φ=189(4)°。另外p2和p3均与Cu3原子配位， 形成两个五元环，其螯合角分别为79.8(3)°、81.1(3)°。不对称草酰胺配体采取双齿配位 模式通过两个氮原子与Cu(II)原子配位，所成的螯合角为77.2(2)°。

配合物单晶的X射线衍射数据采用BRUKER SMART APEX CCD面探衍射仪在室温 下用MoKα辐射(λ=0.71073)收集，吸收校正使用SADABS程序。非氢原子用直接法 解出，并用全矩阵最小二乘法进行各项异性热参数修正。配位水的H原子位置用差值 Fourier图确定，修正时将其位置固定，并将U_iso固定为0.08所有计算使用SHELXTL 程序^[36]完成。有关X射线衍射分析的实验条件、数据分析及晶体学数据列于表1中。配 合物的主要键长和键角列于表2。

表1配合物的晶体学数据及结构分析参数

表2配合物的部分键长()和键角(°)

实施例2：细胞实验

(1)实验组：

选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞淋巴性白血病细胞P388和人肝癌细胞BEL7404，用 胰酶消化后，用10%小牛血清的RPM11640培养液配成50000个/mL的细胞悬液，接种 在96空培养板中，每孔接种100μL，37℃，5%CO₂，培养24小时。

加入所得配位聚合物溶液10μL（用DMSO溶解所述配位聚合物晶体，用生理盐水 稀释至终浓度为5μg/mL），每孔终体积为200μL，用1640培养液补足。37℃，5%CO₂， 培养3天。培养3天后弃掉上清液，每孔加入100μL新鲜配制的0.5mg/mL MTT（噻唑 蓝）的无血清培养液，37℃继续培养4小时，小心弃掉上清，并加入200μLDMSO溶解 MTTformazon沉淀，用微型超声振荡器混匀，在酶标仪上测定波长544nm处光密度值。

（2）空白组：实验同于实验组，但不加入配位聚合物。

（3）对照组：用阳性对照药顺铂代替实验组中的配位聚合物，实验同于实验组。

按照以下公式计算肿瘤细胞生长抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率（%）=（OD_对照-OD_实验）/（OD_对照-OD_空白）×100%

对淋巴性白血病细胞P388生长抑制率为83.6%；

对人肝癌细胞株BEL7404生长抑制率为90.8%。

上述实验结果表明本发明三核铜配合物能用于制备预防和治疗癌症的药物，其作用 效果与阳性对照药5-F-尿嘧啶相当。

实施例3：与HS-DNA的相互作用研究

紫外-可见吸收光谱滴定

在紫外可见光谱测试中，向参比池和样品池中加入同样体积的Tris-HCl缓冲液和配 体溶液，固定配体浓度，在200～600nm区间内进行紫外-可见光谱扫描。每次用微量进 样器往参比池和样品池中加入12μL的HS-DNA(5.16×10^-3mol·L^-1)溶液，使DNA与配体 的浓度比值不断增加，直至饱和，配体的吸收值不再变化。结合常数计算：

[DNA]/(εa-εf)=[DNA]/(εb-εf)+1/Kb(εb-εf)

其中εa为任意DNA浓度下溶液的摩尔消光系数；εf为自由配合物的摩尔消光系数； εb为是配合物被DNA完全键合时的摩尔消光系数；以[DNA]/(εa-εf)对[DNA]作图得 出斜率和截据，斜率和截距之比即结合常数Kb。

实验结果（图3）表明：在272nm处的吸收峰归属为配合物的π→π^*吸收。随着 HS-DNA浓度的增大，配合物的两个吸收峰强度均呈现明显的减色效应，且吸收峰的位 置发生了轻微的红移。据此可以推断该配合物(14)与DNA的作用模式为插入作用。结合 比为5.66×10⁵M^-1(R=0.9968)（图3）。

实例4：切割DNA活性研究

配合物与pBR322DNA反应

在Eppendorf管中分别加入一定量的配合物溶液和pBR322DNA溶液(1μg/μL)，用 Tris-HCl/NaCl缓冲液稀释，37℃避光反应30min后，加入反应终止液终止反应。离心 混合均匀后L采用琼脂糖凝胶电泳分析结果。

实验结果（图4）表明：配合物能够在生理条件下有效切割DNA。当质粒pBR322DNA 与配合物反应后，超螺旋构型Form I(ccc)被降解至开环型Form II(oc)和线型Form II (linear)。浓度为6.25μM时就出现少量的线型Form III(linear)DNA；在25～100μM时能 够有效地将开环型结构Form II(oc)DNA切割成线型Form III(linear)DNA，表现出对开 环型Form II(oc)DNA也有较强的切割能力。以上结果表明该不对称草酰胺三核铜配合 物是一种高效的化学切断试剂。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施 例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或 替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。