用于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的方法和试剂盒

摘要

本发明涉及用于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及一种用于预测败血症患者具有选自呼吸衰竭、肾衰竭和血小板减少症的器官衰竭的风险的方法，包括由测量获自所述败血症患者的血液样品中内皮细胞特异性分子的浓度组成的步骤。

说明书

发明领域

本发明涉及用于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板 减少症的风险的方法和试剂盒。

发明背景

败血症是一种并发严重感染的临床症状并且特征在于全身炎 症和广泛的组织损伤并因此成为非冠脉重症监护病房(ICU)入院 和死亡的主要原因。常见原因包括革兰氏阴性菌、葡萄球菌、和脑 膜炎球菌。伴有逐渐增加的终末器官衰竭和死亡风险的炎症响应中 存在三个公认阶段：败血症、严重败血症、和败血症性休克。严重 败血症是伴有至少一个器官衰竭迹象的败血症。心血管衰竭通常表 现为血压过低、呼吸衰竭通常表现为血氧不足、肾衰竭通常表现为 少尿症、和血液衰竭通常表现为凝血病。

因此，非常需要预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板 减少症的风险的方法。

最近的研究结果表明在败血症患者中，血液内皮细胞特异性分 子(endocan)水平与患者疾病的严重性和预后有关并可代表一种 新的内皮细胞功能障碍标记物(Scherpereel A、Depontieu F、 Grigoriu B、Cavestri B、Tsicopoulos A、Gentina T、Jourdain M、 Pugin J、Tonnel AB、Lassalle P.Endocan，a new endothelial marker in  human sepsis.Crit Care Med.2006Feb；34(2)：532-7)。然而还未 研究内皮细胞特异性分子对于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭 或血小板减少症的风险的作用。

发明概述

本发明涉及一种用于预测败血症患者具有选自呼吸衰竭、肾衰 竭和血小板减少症的器官衰竭的风险的方法，包括由测量获自所述 败血症患者的血液样品中内皮细胞特异性分子的浓度组成的步骤。

发明详述

发明人表明血液内皮细胞特异性分子水平代表了预测败血症 患者中呼吸衰竭、和／或肾衰竭、和／或血小板减少症的工具。

因此，本发明涉及一种用于预测败血症患者具有选自呼吸衰 竭、肾衰竭和血小板减少症的器官衰竭的风险的方法，包括由测量 获自所述败血症患者的血液样品中内皮细胞特异性分子的浓度组 成的步骤。

如本文所用，术语“败血症患者”是指具有严重败血症或败血症 性休克的患者。

如本文所用，术语“呼吸衰竭”具有其在本领域的通常含义，定 义为呼吸系统不能履行其职责，也就是说维持正常充血(富CO₂的静脉血转化为富O₂的动脉血)。当空气和血液之间的气体交换 速率不能匹配身体的代谢需求时，出现呼吸衰竭。

如本文所用，术语“肾衰竭”具有其在本领域的通常含义，描述 了其中肾脏不能从血液中充分过滤毒素和废物的医学状况。

如本文所用，术语“血小板减少症”或“血小板减少”具有其在本 领域的通常含义，定义为血液中血小板数量的异常减少。

如本文所用，术语“内皮细胞特异性分子”或“ESM-1”具有其在 本领域的通常含义，是指内皮细胞特异性分子-1，其为通过肺和肾 脏中的内皮细胞表达的50-kDa硫酸皮肤素蛋白多糖(Lassalle P、 Molet S、Janin A等：ESM-1is a novel human endothelial cell-specific  molecule expressed in lung and regulated by cytokines.J Biol Chem 1996；271：20458-20464)，并可在人类血液中检测到(Bechard D、 Meignin V、Scherpereel A等：Characterization of the secreted form of  endothelial-cell-specific molecule1by specific monoclonal antibodies. J Vasc Res2000；37：417-425；Bechard D、Gentina T、Delehedde  M等：Endocan is a novel chondroitin sulfate／dermatan sulfate  proteoglycan that promotes hepatocyte growth factor／scatter factor  mitogenic activity.J Biol Chem2001；276：48341-48349)。

如本文所用，术语“血液样品”是指全血、血清、或血浆样品。 通常，制备重症监护病房(ICU)中患有严重败血症和败血症性休 克的入院患者的血液样品。

一旦制备了来自患者的血液样品，可通过本领域任何已知的方 法测量ESM-l的浓度。例如，可通过使用标准电泳和免疫诊断技 术，包括免疫测定例如竞争型、直接反应型、或夹层型测试来测量 ESM-1的浓度。这类测试包括，但不限于，Western印迹；凝集试 验；酶标记和介导的免疫测定，例如ELISA；生物素／抗生物素蛋 白型测定；放射性免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀反应，高效液相 色谱(HPLC)、尺寸排阻色谱、固相亲和色谱等。

在具体实施方案中，这种方法包含使血液样品与能够与血液样 品中存在的ESM-1选择性相互作用的结合配偶体接触。

结合配偶体通常可为抗体，其可为多克隆或单克隆的，优选为 单克隆的。针对ESM-1的多克隆抗体可根据已知方法通过向寄主 动物施用适当的抗原或表位来培养，所述动物选自例如猪、牛、马、 兔、山羊、绵羊、和小鼠等。本领域已知的多种佐剂可用以提高抗 体生产。虽然在实施本发明中有用的抗体可为多克隆的，但优选单 克隆抗体。针对ESM-1的单克隆抗体可使用通过连续培养细胞系 提供抗体分子的制备的任何技术来制备和分离。制备和分离技术包 括但不限于最先由Kohler和Milstein(1975)描述的杂交瘤技术； 人B-细胞杂交瘤技术(Cote等，1983)；和EBV-杂交瘤技术(Cole 等，1985)。或者，描述单链抗体制备的技术(参见例如U.S.专利 号4,946,778)可适于制备抗ESM-1，单链抗体。用于实施本发明 的抗体也包括抗ESM-1片段，包括但不限于F(ab')2片段(其可通 过完整抗体分子的胃蛋白酶消化产生)、和Fab片段(其可通过还 原F(ab')2片段的二硫桥产生)。或者，可构建Fab和／或scFv表达 文库以允许具有所需ESM-1特异性的片段的快速鉴别。例如，可 使用抗体的噬菌体展示。在这种方法中，单链Fv(scFv)或Fab 片段在适合的噬菌体，例如M13的表面上表达。简言之，去除已 用蛋白质免疫的适合寄主，例如小鼠的脾细胞。VL和VH链的编 码区获自那些产生所需针对该蛋白质的抗体的细胞。然后，这些编 码区融合至噬菌体序列的末端。一旦噬菌体插入适当的载体，例如 细菌，则该噬菌体展示出抗体片段。也可通过本领域技术人员已知 的组合方法提供抗体的噬菌体展示。通过噬菌体展示的抗体片段随 后也可用作免疫分析部分。

抗ESM-1单克隆抗体商购自Lunginnov(Lille，法国)。例如， 抗人内皮细胞特异性分子／ESM-1抗体MEP08检测人内皮细胞特异 性分子的N-末端(Bechard等(2000)J.Vasc.Res.37：417-425； Grigoriu等(2006)Clin.Cancer Res.12：4575-4582；Maurage等(2009) Exp.Neurol.68：836-844；Leroy等(2010)Histopathology56： 180-187；Sarrazin等(2010)J.Canc.Sci.Ther.2：47-52)。抗人内 皮细胞特异性分子／ESM-1抗体克隆MEP19检测人内皮细胞特异性 分子的C-末端(Bechard等(2000)J.Vasc.Res.37：417-425；Grigoriu 等(2006)Clin.Cancer Res.12：4575-4582；Maurage等(2009)Exp. Neurol.68：836-844；Leroy等(2010)Histopathology56：180-187； Sarrazin等(2010a)J.Canc.Sci.Ther.2：47-52；和Sarrazin等(2010b) Glycobiology20：1380-1388)。

在另一个实施方案中，结合配偶体可为适体。适体为就分子识 别而言代表抗体替代物的一类分子。适体为能够以高亲和力和特异 性识别几乎任何类型靶分子的寡核苷酸或寡肽序列。这类配体可通 过随机序列文库的配体指数富集的系统进化(SELEX，Systematic  Evolution of Ligands by EXponential)来分离，如Tuerk C.和Gold L.， 1990中所描述的。随机序列文库可通过DNA的组合化学合成来获 得。在该文库中，每个成员为最终化学改性的独特序列的线性低聚 体。可能的改性、这类分子的用途和优势已在Jayasena S.D.，1999 中综述。肽适体由通过平台蛋白展示的构象受限抗体可变区组成， 所述平台蛋白例如大肠杆菌硫氧还蛋白A(E.coli Thioredoxin A)， 其通过两种混合方法选自组合文库(Colas等1996)。

本发明的结合配偶体例如抗体或适体，可用可检测分子或物 质，例如荧光分子、放射性分子或任何其它本领域已知的标记物来 标记。标记物是本领域已知的，其通常(直接或间接地)提供信号。

如本文所用，就抗体而言，术语“标记的”意欲包括通过将可检 测物质，例如放射性试剂或荧光团(例如荧光素异硫氰酸酯(FITC) 或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))偶合(即物理连接)至抗体 或适体而直接标记抗体或适体，以及通过与可检测物质反应而间接 标记探针或抗体。可用放射性分子通过本领域已知的任何方法标记 本发明抗体或适体。例如放射性分子包括但不限于用于核素研究的 放射性原子例如I123、I124、In111、Re186、Re188。

前述测试通常包括将结合配偶体(即抗体或适体)结合于固体 载体中。可用于本发明实践的固体载体包括物质例如硝化纤维(例 如以膜或微量滴定孔形式)；聚氯乙烯(例如片或微量滴定孔)； 聚苯乙烯乳胶(例如珠或微量滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮化纸； 尼龙膜；活性珠、磁响应珠等。

更具体地，可使用ELISA方法，其中微量滴定板的孔包被有一 组针对ESM-1的抗体。然后将含有或怀疑含有ESM-1的血液样品 加入到包被的孔中。培养足以允许形成抗体-抗原复合物的时期之 后，可洗涤板以去除未结合部分并加入可检测标记的第二结合分 子。允许该第二结合分子与任何捕获的样品标记物蛋白反应、洗涤 板并且使用本领域所熟知的方法检测第二结合分子的存在。

通常，ELISA试剂盒商购自Lunginnov(Lille，法国)：EndoMark H1(ELISA试剂盒以检测人内皮细胞特异性分子)。其它ELISA 方法描述于：Bechard等(2000)J.Vasc.Res.37：417-425；Grigoriu 等(2006)Clin.Cancer Res.12：4575-4582；Leroy等(2010) Histopathology56：180-187；Sarrazin等(2006)BBA Reviews1765： 25-37；Sarrazin等(2010a)J.Canc.Sci.Ther.2：47-52；Scherpereel 等(2003)Cancer Res.63：6084-6089；Scherpereel等(2006)Crit.Care  Med.34(2)：532-537。

测量ESM-1的浓度(使用或不使用免疫测定基方法)也可包 括蛋白质的分离：基于蛋白质分子量的离心；基于质量和电荷的电 泳；基于疏水性的HPLC；基于尺寸的尺寸排阻色谱；和基于蛋白 质对于所用特定固相的亲和力的固相亲和色谱。一旦分离，ESM-1 可基于已知的“分离谱图”例如该蛋白质的保留时间来鉴别并使用 标准技术测量。或者，可通过例如质谱仪检测和测量分离的蛋白质。

本发明方法特别适用于预测器官衰竭，特别是患有严重败血症 和败血症性休克患者入住ICU之后48-72小时的呼吸衰竭。

本发明方法可进一步包括将ESM-1浓度与预定阀值相比较的 步骤。所述比较指示了所述患者是否具有患呼吸衰竭、肾衰竭或血 小板减少症的风险。例如，预定阀值代表健康患者，即不会出现器 官衰竭的患者中测量的平均浓度。通常，比健康患者中测定的预定 阀值低的浓度预示着器官衰竭，更具体地为患有严重败血症和败血 症性休克患者入住ICU之后48-72小时的呼吸衰竭。

因此，本发明方法可用于分类感染了败血症的患者并且然后可 用于在重症监护病房中选择正确的治疗。例如，具有高的出现呼吸 衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的患者可接受比具有弱风险的 患者更加强烈的治疗和关注。因此，这种方法可帮助医生做出治疗 处理的选择，其可相应地由向患者施用精确药物组成。治疗成本可 因此适合于入住重症监护病房的患者，因此本发明方法可代表一种 用于管理该类病房的有用工具。最后，本发明方法可用于监控感染 了败血症的患者的治疗结果。

本发明的进一步目标涉及ESM-1作为败血症患者中呼吸衰竭、 肾衰竭或血小板减少症的标记物的用途。

本发明的又一个目标涉及用于预测具有选自呼吸衰竭、肾衰竭 或血小板减少症的器官衰竭的风险的试剂盒，包含用于测量ESM-1 浓度的装置。试剂盒可包括抗体、或如上所述的一组抗体。在具体 实施方案中，如前所述标记抗体或一组抗体。试剂盒也可含有其它 适于包装的试剂和特定检测方案所需的物质，包括固相基质(如果 适用的话)和标准品。试剂盒也可含有用于检测其它器官衰竭标记 物，例如C反应蛋白(CRP)或降钙素原(PCT)、IL-6、TNFa 的装置。

本发明将通过以下附图和实施例来进一步阐明。然而，这些实 施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1.与健康志愿者(Témoin)相比，严重败血症(Sepsis  Sévère)和败血症性休克(Choc Septique)患者中内皮细胞特异 性分子血浆水平的增加(*：p<0.05)。

图2.内皮细胞特异性分子和呼吸衰竭。A：无呼吸衰竭的患 者中内皮细胞特异性分子的水平(0)，48小时处ALI／ARDS(1)(*： p<0.05)。B：无呼吸衰竭的患者中内皮细胞特异性分子的水平(0)， 72小时处ALI／ARDS(1)(*：p<0.05)。

图3.内皮细胞特异性分子和呼吸严重性。A：无呼吸衰竭的 患者中内皮细胞特异性分子的水平(0)，48小时处ALI(ALI)、ARDS (SDRA)。B：无呼吸衰竭的患者中内皮细胞特异性分子的水平(0)， 72小时处ALI(ALI)、ARDS(SDRA)。

图4.在48小时存在呼吸衰竭的入选时内皮细胞特异性分子 血浆水平的ROC曲线。AUC：曲线下面积。图下表格显示了取决 于内皮细胞特异性分子血浆水平值的计算的灵敏度和特异性。灰色 病例确定了对于最佳灵敏度／特异性值(分别为84.62％、100％)的 内皮细胞特异性分子截止(3，55ng／mL)。

具体实施方式

实施例1：

高水平血液内皮细胞特异性分子选择患有呼吸衰竭(通过 Pa02／Fi02<200定义)、和／或肾衰竭(通过肌酐>20mg／mL定义)、 和／或血小板减少症的败血症患者(表1)。

实施例2：低水平内皮细胞特异性分子预测患有严重败血症和 败血症性休克的患者入住ICU之后48-72小时的呼吸衰竭

介绍：

急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是常见 的临床疾病，其特征为肺泡上皮和内皮损伤，导致出现急性呼吸衰 竭。它们通过肺部气体交换来区分。术语ALI是指PaO₂／FiO₂比率 <300mmHg的患者，而比率<200mmHg定义为ARDS。ALI和 ARDS均可能作为直接的肺损伤，例如肺炎、穿刺(aspiration)、 肺部挫伤、或中毒性吸入、或间接肺外损伤例如败血症(其是ARDS 最普遍和致命的原因)，以及血液产品的多次输血、急性胰腺炎、 休克性非胸外伤、弥散性血管内凝血(DIC)而发生。ALI或ARDS 的发生率估计为全部入住重症监护病房(ICU)患者的7.1％。与 ARDS和ALI相关的死亡率估计为30-40％。对于大多数ARDS患 者，在诊断后第一个7-10天中测定临床结果，因为在这期间，一 半的患者已经死亡或已脱离(wean off)机械通风。ARDS幸存者 在6-12个月之内恢复肺功能，但通常存留残余异常，包括轻微的 限制／阻塞、锻炼期间削弱的气体交换、或降低的扩散能力。

对增加的死亡率的预测指标包括老龄、存在非肺部器官功能障 碍、肝硬化、活性恶性肿瘤、和败血症性休克；而气体交换削弱的 初始程度是一个较差的临床结果的预测因素。一种能够评估初始严 重性ALI／ARDS和能够密切跟踪炎症现象发展的简单、精确和血液 基生物标记物对于临床医生预测结果和更适当地选择治疗方法而 言将是非常有用的。

ALI／ARDS可分成带有明显重叠的渗出、增生和纤维化阶段。 渗出阶段发生在急性早期(损伤后1-7天)并且特征在于带有肺泡 I型细胞坏死的弥漫性肺泡损伤(DAD)、间质和肺泡富蛋白质水 肿、出血、和嗜中性粒细胞弥漫性肺泡浸润。增生阶段通常开始于 初始损伤之后的1-2周并且特征在于肺泡II型细胞的增殖和增生、 以及间质中和随后肺泡腔之内的成纤维细胞的增殖。仅有某些患者 进入纤维化阶段，通常开始于初始损伤之后的10-14天。其特征在 于淋巴细胞和巨噬细胞的聚集、以及纤维化、和通过肌内膜增厚和 壁纤维化变窄的弯曲脉管。

嗜中性粒细胞被视为与ALI／ARDS有关的炎症过程中的主要 角色。它们积聚于患ARDS患者的肺组织和支气管肺泡灌洗液中。 嗜中性粒细胞与入侵的微生物斗争但也可通过促炎性介质、自由 基、活性氧物种、和蛋白酶的制备和分泌而引起细胞损害。这些发 现支持了嗜中性粒细胞依赖性炎症不仅是ALI的结果而且是ALI 的起因这一观点。然而，在ALI／ARDS期间控制PMN在肺中积聚 的具体调节机制还未完全了解。

间接损伤情况下的主要靶向损害例如在败血症中观察到的为 肺内皮。我们对于控制ARDS中内皮细胞的病理生理反应机制的 了解仍然是不完全的。内皮损伤增加了血管渗透性并因此促进肺水 肿的形成。然而，内皮细胞也可独立于任何细胞损伤而被活化，包 括(i)诱导局部凝血，导致纤维蛋白沉积过多，(ii)粘附分子例 如ICAM-1的过度表达，有利于白细胞募集和迁移入间质和肺泡 腔。这可涉及严重败血症中可溶性ICAM-1的增加，然而，ICAM-1 也可在成纤维细胞和白细胞上表达，降低sICAM-1表达对肺内皮 的选择性。另外，毛细血管肺内皮的特征在于不存在2个其它主要 粘附分子E-选择素和VCAM-1的表达，即使在来自肺ARDS的激 活毛细血管内皮上。

另一方面，具有可将内皮细胞特异性分子视为活化的肺血管内 皮细胞的生物标记物的形成的一致性数据。内皮细胞特异性分子 (或ESM-1)已被鉴别为内皮细胞特异性蛋白多糖，其由20kDa 蛋白质核和O连接丝氨酸137的硫酸软骨素／硫酸皮肤素的独特葡 胺聚糖链组成。内皮细胞特异性分子主要通过肺表达，并在较小程 度上通过肾脏毛细血管表达。肺毛细血管选择性通过短启动子序列 Cytokines如TNF或IL-1来驱动，或者细菌LPS通过内皮细胞引 发内皮细胞特异性分子的合成和分泌。内皮细胞特异性分子结合其 受体白细胞整联蛋白LFA-1并抑制LFA-1／ICAM-1的相互作用，表 明内皮细胞特异性分子在控制白细胞血细胞渗出中的作用。早期研 究已证明患严重败血症的患者中血液内皮细胞特异性分子的水平 增加，与目前为败血症的最佳预后标记物的降钙素原一起作为不良 预后信号。

为了解释ALI／ARDS如何可在败血症期间发生，我们假设肺部 细菌激发后不久，活化的巨噬细胞释放IL-8以募集嗜中性粒细胞、 和TNF，这反过来活化肺内皮细胞以表达ICAM-1和内皮细胞特异 性分子以控制白细胞血细胞渗出。但如果败血症严重到足以诱导血 管内嗜中性粒细胞的活化，则发生通过嗜中性粒细胞蛋白酶诱导的 内皮细胞特异性分子蛋白质水解，导致嗜中性粒细胞血细胞渗出的 恶化并引发器官衰竭。如果我们的假设是真实的，则随后我们应能 够发现内皮细胞特异性分子的动力学、和严重败血症期间发生呼吸 衰竭之间的联系。

患者和方法：

本研究中已前瞻性地招募了21位患者和9位正常志愿者。全 部患者来自Lille University Hospital的重症监护病房。入选标准为 根据ACC／SCCM分类，患有严重败血症或败血症性休克的患者。 非入选标准为年龄<18岁和怀孕。排除标准为非败血症起因的败 血症性休克，并在入住ICU之前免疫抑制治疗1个月。

收集入选(inclusion)时和24小时、48小时和72小时时的器 官功能障碍的指数：Glasgow昏迷评分≤14、PaO2≤9.75kPa、氧 饱和度≤92％、ALI(PaO2／FiO2≤300)、ARDS(PaO2／FiO2≤200)、 血液收缩压≤90mmHg、血液收缩压自基线降低≥40mmHg、pH ≤7.3、乳酸盐≥2.5mmol／l、肌酐≥177μmol／l(患有已知肾病的 患者中肌酐加倍)、少尿症≤30ml／小时(对于>3小时)或≤0.71／24 小时、凝血酶原时间≤0.6s(参考0.70-1.30s)、血小板≤100× 109／l、胆红素≥43μmol／l、和麻痹性肠梗阻。败血症性休克定义 为虽然有足够的液体复苏(fluid resuscitation)，但血压过低持续 至少1小时。

从入住ICU的入选患者取样血液于5mL柠檬酸盐管中。然后 于4℃下离心3000g样品15min，通过500μL血浆每管等分试样 量，然后于-80℃下冷冻1.5小时。通过ELISA(Lunginnov，法国) 测定内皮细胞特异性分子的水平。

数据以中值和四分位范围表示或以平均值±标准差表示。数 据分析包括通过方差分析来比较入选时和在研究的各时间点存在 或不存在各器官衰竭的情况下的内皮细胞特异性分子的血浆水平。 当显著时，使用Bonferroni校准的事后测试进行2x2的组间比较。 通过ROC曲线完成内皮细胞特异性分子的预测值。全部统计学计 算将使用SPSS统计学软件包来进行。

结果：

与健康对照(0.67±0.25ng／mL)相比，严重败血症(3.96±3.35 ng／mL)和败血症性休克(4.33±5.01ng／mL)中内皮细胞特异性 分子的血浆水平增加(p<0.05)(图1)。

于48小时和／或72小时呼吸衰竭的患者在入选时的血浆内皮 细胞特异性分子的水平显著低于相同时间点不患有呼吸衰竭的患 者(p<0.05，图2)。

内皮细胞特异性分子的血浆水平不区分ALI和ARDS。它们在 两组中均较低(图3)。

内皮细胞特异性分子间的ROC曲线和48小时的呼吸衰竭显示 AUC=0.923(p<0.05)。入院时内皮细胞特异性分子值<3.55 ng／mL预测了48小时的呼吸衰竭，其中灵敏度为84.62％，特异性 为100％(图4)。

参考文献：

贯穿本申请，多个参考文献描述了本发明所属领域的现状。这 些参考文献的公开内容在此以引用方式并入本公开中。